星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化黃芪甲苷二元醇質(zhì)體處方及其理化性質(zhì)考察

吳少媛，馮玉天嬌 ，陳筱瑜，黃慶德

（1.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350122；2.福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院藥學院，福建 福州 350101）

黃芪甲苷（astragaloside Ⅳ，ASIV）為中藥黃芪主要活性成分之一，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗病毒、抗纖維化、抗細胞凋亡、抗腫瘤等藥理作用［1］。近年來有研究表明，ASIV 可有效保護皮膚成纖維細胞免于長波紫外線引起的氧化損傷，達到延緩皮膚光老化的作用［2-5］，且當ASIV濃度為10 μg/mL時，促進皺紋和非皺紋皮膚成纖維細胞的增殖作用最為明顯［6］。由于ASIV 難溶于水及油脂，在蒸餾水中的溶解度僅為0.01 mg/mL［7］，制成外用制劑用于延緩皮膚光老化時，存在經(jīng)皮滲透性差及難以在皮膚達到有效濃度的問題。所以，應(yīng)用新的制劑技術(shù)來提高ASIV 的溶解度，并改善其經(jīng)皮滲透性能具有重要意義。二元醇質(zhì)體是用二元醇（乙醇、丙二醇）制備醇質(zhì)體，與普通醇質(zhì)體比較，減少了乙醇用量，增加穩(wěn)定性，降低對皮膚（黏膜）的刺激性，可以發(fā)揮兩者協(xié)同促進透皮吸收的作用，增加藥物的透皮吸收并提高藥物在皮膚中的滯留量［8-9］。本實驗在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用星點設(shè)計-響應(yīng)面法對ASIV 二元醇質(zhì)體處方進行優(yōu)化，并對其理化性質(zhì)進行考察，為制備ASIV 二元醇質(zhì)體凝膠劑的研究提供實驗數(shù)據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 EasySep?-3030 高效液相色譜儀-UM5800 蒸發(fā)光散射檢測器（上海通微分析技術(shù)有限公司）；MPLR-702 恒溫磁力攪拌器（常州市金壇大地自動化儀器廠）；BT100-1F 蠕動泵（保定蘭格恒流泵有限公司）；STARTER3100 PH 酸度儀（美國OHAUS 公司）；FA2004N 萬分之一電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；XS205 十萬分之一電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；NICOMP 380ZLS 納米粒度及電位分析儀（美國PSS粒度儀公司）；H7650 透射電子顯微鏡（日本HITACHI 公司）；UFC5003BK 超濾離心管（美國 Merck Millipore 公司）。

1.2 試藥 ASIV對照品（純度≥98%）、ASIV原料藥（純度98%）、聚山梨酯-80（上海源葉生物科技有限公司，批號：J25F10T81373、C14J9Q65734、Z17D9Y77 731）；大豆卵磷脂［艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司，批號：SY-SI-190602］；磷酸二氫鉀（上海麥克林生化科技有限公司，批號：C10419856）；磷酸、無水乙醇、丙二醇、甲醇、乙腈（國藥集團化學試劑有限公司）；水為超純水；甲醇、乙腈均為色譜純；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 ASIV 二元醇質(zhì)體制備 準確稱取處方量的ASIV、大豆卵磷脂、聚山梨酯-80、二元醇（乙醇-丙二醇），置錐形瓶中，在室溫密閉條件下，攪拌20 min至完全溶解，為A 相。設(shè)置攪拌速度為700 r/min，將處方量的超純水（B 相）以1 mL/min 的速度緩慢加入A 相中，結(jié)束后繼續(xù)攪拌90 min，冷卻至室溫，即得ASIV 二元醇質(zhì)體，4 ℃條件下保存。同法制備空白二元醇質(zhì)體。

2.2 HPLC-ELSD 測定ASIV 含量方法的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈∶水（36∶64）；溫度：70 ℃；壓力：3.89 bar；信號：30 mV；氣體流量：2.50 L/min；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱定ASIV 對照品適量，置25 mL 量瓶中，加甲醇超聲溶解，冷卻至室溫后用甲醇稀釋至刻度，0.22 μm 微孔濾膜濾過，得濃度為 992.00 μg/mL 的 ASIV 對照品母液，備用。

2.2.3 供試品溶液制備 精密吸取3 mL ASIV 二元醇質(zhì)體，置10 mL 量瓶中，加甲醇超聲溶解，冷卻至室溫后用甲醇稀釋至刻度，0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.2.4 陰性對照溶液制備 精密量取3 mL 空白二元醇質(zhì)體，置10 mL 量瓶中，加甲醇超聲溶解，冷卻至室溫后用甲醇稀釋至刻度，0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得陰性對照溶液。

2.2.5 專屬性試驗 將對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液分別注入高效液相色譜儀，按“2.2.1”項下的色譜條件檢測，結(jié)果見圖1。由圖可知，在該色譜條件下，制備二元醇質(zhì)體的各輔料對ASIV的含量測定無干擾，專屬性好。

圖1 高效液相色譜圖

2.2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.2”項下的對照品母液用甲醇稀釋，分別配成濃度為49.60、69.44、89.28、297.60、694.40、992.00 μg/mL 的 ASIV對照品溶液，0.22 μm 微孔濾膜濾過，按“2.2.1”項下的色譜條件進樣檢測，記錄峰面積。以ASIV 的質(zhì)量濃度C（μg/mL）的對數(shù)為橫坐標X，以測得的峰面積A 的對數(shù)為縱坐標Y，進行線性回歸，得回歸方程：Y＝1.637X＋8.171，r＝0.999 9。結(jié)果表明，ASIV在49.60～992.00 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗 精密吸取“2.2.6”項下濃度為694.40 μg/mL 的對照品溶液，重復(fù)進樣 6 次，測定峰面積，計算RSD值為0.10%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗 取同一批ASIV 二元醇質(zhì)體樣品6 份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，測定ASIV 的峰面積，計算 ASIV 含量和RSD值，RSD值為2.99%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.9 回收率試驗 取已知濃度的ASIV 二元醇質(zhì)體1.5 mL，置10 mL 量瓶中，分別加入ASIV 對照品1.913、1.594、1.275 mg，每一濃度水平各 3 份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，測定其峰面積，計算平均回收率和RSD值。結(jié)果平均回收率為101.21%，RSD為 1.01%。

2.3 質(zhì)量評價指標

2.3.1 超濾離心法測定包封率 精密量取0.4 mL ASIV 二元醇質(zhì)體置于5 mL 量瓶中，用甲醇超聲破乳后，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，測定ASIV 含量為W1。精密量取0.4 mL ASIV 二元醇質(zhì)體置截留分子量為50 kD 超濾離心管中，以 6 000 r/min 離心 60 min［10］，移取全部濾液，置2 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，測定 ASIV 含量為W2，計算包封率。

包封率＝（W1－W2）/W1×100%

2.3.2 粒徑、PDI 和Zeta 電位測定 取適量ASIV 二元醇質(zhì)體，純化水稀釋后用納米粒度及電位分析儀測定其粒徑和Zeta 電位。

2.4 ASIV 二元醇質(zhì)體處方篩選

2.4.1 聚山梨酯-80 含量對二元醇質(zhì)體的影響 分別取0.00%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%（W/V）的聚山梨酯-80 及處方量ASIV 和大豆卵磷脂，量取一定比例的乙醇、丙二醇和水，按“2.1”項下方法制備二元醇質(zhì)體，每組平行制備3 份，按“2.3.1”“2.3.2”項下方法測定包封率（A）、平均粒徑（B）、Zeta 電位（C），計算綜合評分，綜合評分＝Ai/Amax×50＋Bmin/Bi×25＋Ci/Cmax×25，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，聚山梨酯-80 含量為0.75%時的綜合評分最高。

表1 聚山梨酯-80 含量對二元醇質(zhì)體的影響（，n=3）

表1 聚山梨酯-80 含量對二元醇質(zhì)體的影響（，n=3）

組號1 2 3 4 5 6聚山梨酯-80/%0.00 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50綜合評分/分0 89.49 95.61 92.84 90.90 89.12包封率/%—80.33±0.02 78.64±0.01 76.57±0.01 77.89±0.00 71.83±0.01粒徑/nm—222.90±1.90 217.40±1.64 188.37±1.96 229.87±1.50 220.97±1.45 Zeta電位/mV—15.27±0.21 20.79±2.02 16.78±1.24 18.24±0.46 19.21±0.31

2.4.2 大豆卵磷脂用量的考察 分別取2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%（W/V）的大豆卵磷脂及處方量ASIV、0.75%聚山梨酯-80，量取一定比例的乙醇、丙二醇和水，按“2.1”項下方法制備二元醇質(zhì)體，按“2.3.1”“2.3.2”項下方法測定包封率、平均粒徑、Zeta電位，計算綜合評分，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，大豆磷脂含量為4.0%時的綜合評分最高。

表2 大豆卵磷脂含量對二元醇質(zhì)體的影響（，n=3）

表2 大豆卵磷脂含量對二元醇質(zhì)體的影響（，n=3）

組號1 2 3 4 5 6大豆卵磷脂/%2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50包封率/%68.24±0.02 74.51±0.02 75.30±0.00 76.64±0.00 85.11±0.00 86.42±0.00粒徑/nm 235.60±4.37 259.50±2.00 241.00±2.99 242.40±4.20 223.87±7.18 253.10±0.36 Zeta電位/mV 13.54±0.35 13.93±0.42 14.71±0.13 16.01±0.61 17.35±1.24 16.33±0.14綜合評分/分82.74 84.75 87.99 90.50 99.24 95.64

2.4.3 丙二醇和乙醇比例的考察 取處方量ASIV、0.75%聚山梨酯-80 及4.0%（W/V）的大豆卵磷脂，一定比例的二元醇相（乙醇與丙二醇的比例分別為 9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9），按“2.1”項下方法制備二元醇質(zhì)體，乙醇與丙二醇比例為1∶9 的處方組未形成醇質(zhì)體，其余8 組于4 ℃冰箱放置，24 h 后乙醇與丙二醇比例為 4∶6、3∶7、2∶8 的處方組均出現(xiàn)不同程度的沉淀，其余5 組仍為醇質(zhì)體狀態(tài)，按“2.3.1”“2.3.2”項下方法測定包封率、平均粒徑、Zeta電位，計算綜合評分，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，乙醇和丙二醇的比例對是否能形成二元醇質(zhì)體影響較大，當乙醇占二元醇體系含量的50%以下時，無法形成穩(wěn)定的二元醇質(zhì)體，當乙醇和丙二醇的比例為8∶2 時，綜合評分最高。

表3 乙醇丙二醇比例對二元醇質(zhì)體的影響（，n=3）

表3 乙醇丙二醇比例對二元醇質(zhì)體的影響（，n=3）

組號1 2 3 4 5乙醇∶丙二醇9∶1 8∶2 7∶3 6∶4 5∶5包封率/%72.90±0.00 85.66±0.00 82.21±0.01 84.23±0.01 83.36±0.00粒徑/nm 268.20±4.19 222.33±0.85 158.67±1.63 192.93±2.02 201.60±0.95 Zeta電位/mV 20.68±0.58 24.27±0.48 16.74±0.79 19.81±0.67 19.89±0.92綜合評分/分78.64 92.84 90.23 90.13 88.82

2.4.4 藥物含量的考察 分別精密稱取0.10%、0.12%、0.14%、0.16%、0.18%、0.20%、0.22%（W/V）的ASIV 及處方量的聚山梨酯-80 和大豆卵磷脂，量取一定比例的乙醇、丙二醇和水，按“2.1”項下方法制備二元醇質(zhì)體，于4 ℃冰箱放置24 h 后，藥物含量為0.16%、0.18%、0.20%和0.22%的處方組出現(xiàn)沉淀，其余組穩(wěn)定，按“2.3.1”“2.3.2”項下方法測定包封率、平均粒徑、Zeta 電位，計算綜合評分，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，當藥物含量為0.12%時，綜合評分最高。

表4 藥物含量對二元醇質(zhì)體的影響（，n=3）

表4 藥物含量對二元醇質(zhì)體的影響（，n=3）

組號1 2 3藥物含量/%0.10 0.12 0.14包封率/%86.88±0.00 89.76±0.01 93.03±0.00粒徑/nm 209.70±2.34 223.47±3.00 198.97±3.20 Zeta電位/mV 20.68±3.71 22.14±2.70 14.19±0.35綜合評分/分95.42 97.26 92.16

2.4.5 星點效應(yīng)-響應(yīng)面優(yōu)化二元醇質(zhì)體處方

2.4.5.1 星點試驗設(shè)計 根據(jù)單因素篩選實驗結(jié)果，聚山梨酯-80 的含量為0.75%，藥物含量為0.12%，二元醇與水的比例為4∶6。由于大豆卵磷脂含量以及無水乙醇含量對二元醇質(zhì)體綜合評分影響較大，因此選擇以大豆卵磷脂含量（X1，W/V）、無水乙醇含量（X2，V/V）為考察因素進行星點設(shè)計，因素與水平見表5。以包封率（Y1）與平均粒徑（Y2）為指標，并將二者線性歸一化［11］，歸一值（di）范圍分別為 Y1（Ymin＝69.50%，Ymax＝91.28%）、Y2（Ymin＝147.4，Ymax＝347.4）。通過總評歸一值 OD［OD＝（d1d2d3…dn）1/n，dmax＝（Yi－Ymin）/（Ymax－Ymin），dmin＝（Ymax－Yi）/（Ymax－Ymin）］評價 ASIV 二元醇質(zhì)體的質(zhì)量，Y1對OD 值的貢獻根據(jù)公式dmax計算其d 值，Y2對OD 值的貢獻根據(jù)公式dmin計算其d 值。在響應(yīng)面上直觀地讀出各因素的最優(yōu)區(qū)間，確定最優(yōu)處方。試驗安排以及結(jié)果見表6。

表5 因素水平表

表6 試驗安排及結(jié)果

2.4.5.2 模型擬合 運用Design-Expert 8.0.6 軟件對實驗結(jié)果進行多元非線性擬合，得到OD 值（Y）對大豆卵磷脂含量（X1）、無水乙醇含量（X2）的響應(yīng)方程為：Y＝0.75＋0.1X1－0.11X2＋0.17X1X2－0.14X12－0.28X2（2R2＝0.949 0）。對響應(yīng)方程進行方差分析，結(jié)果見表7。該響應(yīng)方程的P＜0.01，表明該模型方程極顯著。在回歸模型中的一次項大豆卵磷脂含量（X1）的P＜0.05、無水乙醇含量（X2）的P＜0.01，表明其對OD 值影響顯著，影響程度為：乙醇含量（X2）＞磷脂含量（X1）；二次項X12和X22以及交互項X1X2對OD 值的影響均顯著（P＜0.01）。該方程的失擬項的P＞0.05，失擬項差異不顯著，表明本實驗設(shè)計可靠，得到的響應(yīng)面方程可用于ASIV 二元醇質(zhì)體處方優(yōu)化。

表7 方差分析結(jié)果

2.4.5.3 響應(yīng)面分析 運用Design-Expert 8.0.6 軟件繪制OD 值與變量大豆卵磷脂含量（X1）和乙醇含量（X2）的三維響應(yīng)面圖和二維等高線圖，見圖2。從圖中可知，兩因素對OD 值的響應(yīng)曲面坡度較大，說明2 個因素對OD 值的影響較大，等高線圖的形狀接近橢圓形，且等高線較密集，說明大豆卵磷脂含量（X1）和乙醇含量（X2）兩因素交互作用較顯著。

圖2 大豆卵磷脂含量與乙醇含量交互作用對OD 值的響應(yīng)面及等高線圖

2.4.5.4 響應(yīng)面優(yōu)化和預(yù)測 在滿足ASIV 二元醇質(zhì)體OD 值最大化條件下，利用Design-Expert 8.0.6軟件優(yōu)化處方，得到大豆卵磷脂含量及無水乙醇含量的優(yōu)化值分別為3.86%、27.13%，預(yù)測的粒徑為220.77 nm，包封率為89.49%。

2.4.5.5 驗證試驗 按“2.4.5.4”項下最優(yōu)處方，平行制備6 份ASIV 二元醇質(zhì)體，分別測定其包封率、粒徑，結(jié)果見表8。實驗值與預(yù)測值偏差均＜4%，說明響應(yīng)方程有較好的預(yù)測性，可用于ASIV 二元醇質(zhì)體處方的優(yōu)化。

表8 預(yù)測值與實驗值比較（，n=6）

表8 預(yù)測值與實驗值比較（，n=6）

指標包封率/%粒徑/nm Zeta電位/mV PDI預(yù)測值89.490 220.770偏差/%-3.587 2.854——實驗值86.280±0.030 227.070±5.030-21.060±0.320 0.172±0.016——

2.5 ASIV 二元醇質(zhì)體理化性質(zhì)

2.5.1 ASIV 二元醇質(zhì)體形態(tài) 取適量ASIV 二元醇質(zhì)體滴加到載有Formvar 支持膜的銅網(wǎng)上，用少量2%磷鎢酸負染，自然揮干后，置于透射電子顯微鏡下觀察二元醇質(zhì)體形態(tài)，結(jié)果見圖3，本品形態(tài)規(guī)整，呈球形或類球形。

圖3 ASIV 二元醇質(zhì)體透射電鏡圖（×50 000）

2.5.2 粒徑、PDI和Zeta電位測定 取適量ASIV二元醇質(zhì)體，純化水稀釋后用納米粒度及電位分析儀測定其粒徑和Zeta 電位，粒徑分布見圖4。結(jié)果表明，ASIV 二元醇質(zhì)體的平均粒徑為（227.07±5.03）nm，PDI 值為（0.172±0.016），說明本品粒徑較小且分布均勻；電位值為（-21.06±0.32）mV，說明本品比較穩(wěn)定，不易聚集。

圖4 ASIV 二元醇質(zhì)體粒徑分布圖

2.5.3 ASIV二元醇質(zhì)體穩(wěn)定性考察 按“2.4.5.4”項下優(yōu)化的處方制備6 批ASIV 二元醇質(zhì)體，在4 ℃條件下貯存，分別于第 0、15、30、90 天按“2.3.1”“2.3.2”項下方法測定包封率、平均粒徑、Zeta 電位，結(jié)果見表9。結(jié)果表明，ASIV 二元醇質(zhì)體在4 ℃條件下穩(wěn)定性良好。

表9 ASIV 二元醇質(zhì)體穩(wěn)定性試驗結(jié)果（，n=6）

表9 ASIV 二元醇質(zhì)體穩(wěn)定性試驗結(jié)果（，n=6）

時間/d 0 15 30 90包封率/%86.28±0.03 86.37±0.01 86.71±0.02 87.41±0.01粒徑/nm 227.07±5.03 229.02±3.84 235.07±6.50 247.47±12.21 Zeta電位/mV 20.03±2.97 21.07±1.64 20.23±1.45 21.90±1.55

3 討 論

由于二元醇質(zhì)體體系中保留一定比例的醇相，常用的制備方法為注入法、注入-超聲法。注入-超聲法因為應(yīng)用了探頭超聲，可以減小醇質(zhì)體的粒徑。預(yù)試驗分別采用注入法、注入-超聲法制備ASIV 二元醇質(zhì)體，結(jié)果表明，注入-超聲法隨著超聲時間的增加，醇質(zhì)體粒徑逐漸減小，由220 nm降至137 nm 左右，但包封率也由87%降低至66%，為保證制劑具有較高的包封率，本實驗最后選擇采用注入法制備ASIV 二元醇質(zhì)體。

醇相比例對醇質(zhì)體質(zhì)量影響較大，一般醇質(zhì)體中乙醇含量不能＞45%，否則乙醇將溶解并破壞醇質(zhì)體磷脂囊泡結(jié)構(gòu)［12］。本實驗前期對二元醇含量（10%～60%）進行考察，發(fā)現(xiàn)二元醇含量在10%～30%時，制備的二元醇質(zhì)體會產(chǎn)生沉淀，分析原因可能是ASIV 是一種難溶解成分［7］，當處方中二元醇比例較小時，部分ASIV 析出產(chǎn)生沉淀；二元醇含量＞50%時，體系為澄清透明溶液，不能形成醇質(zhì)體，原因可能是二元醇溶解、破壞了磷脂囊泡結(jié)構(gòu)。所以，本實驗進行二元醇質(zhì)體處方優(yōu)化時將二元醇與水相的比例確定為4∶6。

二元醇質(zhì)體的評價指標主要為包封率、平均粒徑、PDI 及Zeta 電位，采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化處方試驗中由于各水平條件下二元醇質(zhì)體的Zeta電位和PDI 值變化不大，所以數(shù)據(jù)分析時只選擇包封率和平均粒徑的OD值作為星點設(shè)計-響應(yīng)面法的響應(yīng)值。結(jié)果表明，模型擬合情況良好，響應(yīng)方程的P值為0.000 2，模型方程極顯著，失擬項的P值為0.521 5，失擬項差異不顯著，表明實驗設(shè)計可靠。經(jīng)驗證，優(yōu)化處方各評價指標的預(yù)測值與試驗值的偏差均＜4%，可用于ASIV 二元醇質(zhì)體處方的優(yōu)化。

綜上，本實驗通過星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化ASIV 二元醇質(zhì)體處方，建立的響應(yīng)方程具有良好的預(yù)測性，優(yōu)化所得的二元醇質(zhì)體處方為：大豆卵磷脂含量3.86%，無水乙醇含量27.13%，丙二醇含量12.87%，水含量60%，制得的ASIV 二元醇質(zhì)體性質(zhì)穩(wěn)定。