pH驅動法負載香芹酚納米顆粒的制備及性能

鄭華明，王江麗，田宇航，周明鈺，游 峰，蔡子青

(武漢工程大學材料科學與工程學院，湖北 武漢 430205)

精油(EOs) 是從食用和藥用植物的不同部位提取的揮發(fā)性油成分，包括芽、樹皮、花、葉、果實和種子[1]。多項研究結果表明，香芹酚(Car) 精油具有優(yōu)異的抗氧化性能和抗菌性能，是公認的安全食品添加劑[2]，受到眾多的研究者們關注。由于香芹酚是親脂性物質，并且存在刺激性氣味，導致其無法直接應用于食品保鮮領域[3]。為了克服這些缺陷，研究者們通過制備不同類型的負載體系[4]或將香芹酚通過一定的方式直接添加到薄膜中[5]等方法來提高香芹酚的穩(wěn)定性和利用率。玉米醇溶蛋白(Zein)是玉米的主要貯藏蛋白，來源廣，成本低，可以應用于各種領域。玉米醇溶蛋白的結構組成中，有超過50%的疏水性氨基酸殘基，導致其無法溶于水溶液中，但可溶于60%～90% 的乙醇水溶液和pH 值11.3～12.7 的堿性溶液[6]。研究發(fā)現(xiàn)，玉米醇溶蛋白具有自組裝特性，可用于微膠囊或納米顆粒的制備[7]，因此，可以作為生物活性成分的裝載系統(tǒng)。然而，在實際應用中玉米醇溶蛋白卻存在自身缺陷；一方面，玉米醇溶蛋白的等電點在6.2 左右，即在中性條件下納米粒子間的靜電斥力弱，使形成的納米粒子(NPs) 容易在疏水力驅動下發(fā)生團聚[8]；另一方面，玉米醇溶蛋白疏水的外表面使形成的納米粒子干燥后在水中無法再次分散，因此在實際應用中受到了很大的限制。

酪蛋白酸鈉(SC) 是一種安全無害的乳化劑，具有良好的表面活性，與玉米醇溶蛋白形成配合物后，可以提高由冷凍或噴霧干燥制備的納米粒子在水中的再分散性[9]。Yuan 等[10]發(fā)現(xiàn)玉米醇溶蛋白和酪蛋白酸鈉可以溶于強堿性溶液，并且在溶液酸化至中性過程中SC 和Zein 會發(fā)生重組，從而形成共組裝的SC/Zein NPs，該制備方法被稱為pH 驅動法。另外，在堿性條件下，某些含有羥基的EOs 會發(fā)生去質子化反應，使其水溶性增加；在酸化至中性過程中，其又可以再次質子化，并且可以在氫鍵和疏水力作用下被封裝到生物聚合物基質中[11]。

相較于傳統(tǒng)的反溶劑沉淀法[12]，pH 驅動法具有明顯的優(yōu)勢。首先，實驗過程中無需添加大量的乙醇，制備過程更加綠色、環(huán)保；其次，pH 驅動法所制備的載香芹酚納米粒子粒徑更小，在水中分散后的穩(wěn)定性更強；而且，其抗氧化性能和抗菌性能較前者分別提高了14.69%和12%左右。因此，本文采用pH 驅動法，制備出了負載香芹酚的玉米醇溶蛋白/酪蛋白酸鈉納米顆粒，將其應用于食品包裝時，可有效地抑制食品腐敗變質和延長食品的貨架壽命。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）：Nicolet 6700；紫外分光光度計：Lambda35；激光粒度儀：Zetasizer Nano-ZS90，英國Malvern；恒溫培養(yǎng)振蕩器：ZWY-2102C，上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 負載香芹酚納米顆粒的制備

將2.5 g 的香芹酚與3 mol/L 的NaOH (25 mL) 混合后在120 ℃油浴中加熱10 min，得到透明的去質子化香芹酚堿溶液。取1 mL 去質子化香芹酚堿溶液與19 mL 去離子水完全混合，然后將0.1 g 玉米醇溶蛋白溶于上述溶液中，以800 r/min 攪拌30 min，直至無可見顆粒。將0.025 g，0.05 g，0.1 g 和0.2 g的酪蛋白酸鈉分別溶于玉米醇溶蛋白/香芹酚堿水溶液中，相應的Zein 和SC 質量比為4:1，2:1，1:1 和1:2，在磁性攪拌器上以800 r/min 攪拌30 min。最后，在Zein/SC/Car 堿性混合溶液中加入質量分數(shù)20%的葡萄糖-δ-內酯(GDL) 調節(jié)pH 為7.0，最終獲得復合納米粒子分散液。所有分散液經冷凍干燥并充分研磨后，低溫密封儲存，備用。

1.3 測試與表征

1.3.1 納米粒子的FT-IR 分析：樣品的紅外光譜圖采用溴化鉀壓片法來測定。將干燥后的樣品與溴化鉀以1:100 的質量比進行混合，然后充分研磨后壓制成片。光譜的掃描范圍為500～4000 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描64 次。其中，純溴化鉀壓片為空白組。

1.3.2 納米粒子的包封率的測定：根據(jù)Wang 等[13]的測定方法，并適當修改。香芹酚-乙醇溶液標準曲線Y= 0.01439X+ 0.0061 (R2= 0.9996) 的建立：配制一定濃度(10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40 μg/mL 和50 μg/mL) 的香芹酚-乙醇標準溶液，其中香芹酚的質量濃度為自變量，吸光度值為因變量，經擬合后即為標準曲線的函數(shù)方程式。

取4 mL 新鮮制備的納米粒子分散液和16 mL石油醚于離心管中，充分振蕩5 min 后，取0.5 mL 的石油醚相轉移到10 mL 的試劑瓶中，并在通風柜中靜置50 min，使石油醚完全揮發(fā)。然后在試劑瓶中加入4 mL 無水乙醇。利用紫外分光光度計測定樣品在276 nm 處的吸光度值，乙醇為空白對照組。用式（1）計算包封率(Encapsulation efficiency,EE)

式中：λ0——投入香芹酚的總含量；λ1——游離香芹酚量。

1.3.3 納米粒子的粒徑分布和Zeta 電位測試：在室溫條件下，通過激光粒度儀來檢測負載香芹酚納米顆粒的粒徑分布、平均電位和PDI 值。所有樣品均用去離子水稀釋至適當濃度，每組樣品均重復測試三次，結果取平均值。

1.3.4 納米粒子的復溶性分析：分別取20 mg 凍干后的Zein/Car 納米粒子、Zein/SC 納米粒子、Zein/SC/Car 納米粒子溶于10 mL 去離子水中攪拌使其分散均勻。將樣品靜置1 d 后，觀察不同復合納米粒子的分散情況。

1.3.5 納米粒子復溶后的存儲穩(wěn)定性分析：取不同Zein/SC 質量比的納米粒子溶于去離子水中，配制成濃度為2 mg/mL 的分散液，通過觀察新鮮復溶和靜置15 d 后的分散液的粒徑、電位和PDI 值的變化，用于研究不同Zein/SC 質量比的復合納米粒子分散液的儲存穩(wěn)定性。

1.3.6 納米粒子的表觀形貌表征(FE-SEM)：將納米粒子分散液滴在樣品臺上，風干后進行噴金。采用德國Zeiss SIGMA 300 場發(fā)射電子顯微鏡，在加速電壓為3 kV 條件下觀察負載香芹酚納米顆粒的微觀形貌。

1.3.7 納米粒子的熱性能分析：采用差示掃描量熱儀(DSC-60，日本島津) 分析樣品的熱穩(wěn)定性。將5 mg 左右的樣品放入坩堝中，密封。測試條件：在流速為20 mL/min 的N2氛圍中，樣品從室溫以10 ℃/min 升溫速率加熱到100 ℃，10 min 后以20 ℃/min降溫速率冷卻至30 ℃，隨后以10 ℃/min 升溫速率加熱到270 ℃。

1.3.8 納米粒子的抗氧化性能分析：采用自由基DPPH 清除法[14]測定香芹酚納米粒子(m(Zein)/m(SC) = 1:2) 的抗氧化活性。向20 mL 試劑瓶中依次添加3 mL 質量濃度為40 mg/mL 的DPPH-乙醇溶液和3 mL 不同質量濃度(0g/mL，60g/mL，80g/mL，100g/mL，120g/mL 和140g/mL) 的復合納米粒子分散液，混勻后在室溫、避光條件下靜置1 h。然后通過紫外分光光度計來檢測樣品在λ=525 nm 處的吸光度值。以DPPH-乙醇溶液加3 mL去離子水作為空白對照?？寡趸钚砸訢PPH 清除率（R）為指標，計算公式如式（2）

式中：A0——空白對照的吸光度值；A1——不同質量濃度的復合納米粒子溶液的吸光度值。

1.3.9 納米粒子的抗菌性能分析：用平板計數(shù)法研究負載香芹酚的納米粒子（m(Zein)/m(SC) = 1:2）對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌效果。將負載香芹酚的納米粒子溶于生理鹽水中，配制成不同質量濃度(0 mg/mL，2 mg/mL，6 mg/mL，10 mg/mL) 的分散液，并通過紫外燈照射30 min 來實現(xiàn)樣品的無菌環(huán)境。

將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別接種于固體培養(yǎng)基中，在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，實現(xiàn)細菌的純化。取純化后的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌單菌落分別于10 mL 液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)24 h。用生理鹽水稀釋菌液，使其濃度大約在108CFU/mL，然后在8.9 mL 的液體培養(yǎng)基中加0.1 mL稀釋好的菌液和1 mL 不同質量濃度的復合納米粒子分散液。振蕩培養(yǎng)24 h 后，稀釋菌液至合適的濃度，涂平板，培養(yǎng)24 h 后拍照記錄細菌菌落數(shù)。最后，利用菌落數(shù)計算抑菌率（I）。計算公式如式(3)

式中：B0——空白對照組的菌落數(shù)；B1——不同質量濃度樣品的菌落數(shù)。

2 結果與分析

2.1 納米粒子的FT-IR 分析

紅外光譜分析圖可以鑒別物質間的氫鍵相互作用。紅外吸收峰的頻率變化越大，表明氫鍵相互作用越強。各組分及復合納米顆粒的FT-IR 光譜如Fig.1 所示。在SC 和Zein 的光譜中可以觀察到幾個蛋白質的特征峰，3200～3500 cm-1和2800～3000 cm-1處分別代表親水性O—H 吸收峰和疏水性C—H 的伸縮振動峰，表明蛋白質具有較好的兩親性；另外，2 種蛋白質的光譜在1400～1600 cm-1區(qū)域的酰胺基的紅外特征峰分布也相似[15]，1630 cm-l左右為酰胺Ⅰ帶，1540 cm-l左右為酰胺Ⅱ帶。香芹酚的光譜在1400～1650 cm-1由于苯環(huán)的骨架振動有4 個吸收峰，在2700 ～2960 cm-1處的吸收峰為烷基C—H峰，其中2960 cm-1處的峰強度大較尖銳，表明香芹酚的疏水性較強。在Zein/SC NPs 的光譜中出現(xiàn)了2 個新的吸收峰，是調節(jié)pH 過程中加入的葡萄糖-δ-內酯中酯基的C—O 峰和端基的C—H 彎曲振動峰，分別在1261 cm-1和801 cm-1處，另外，光譜中—OH 特征峰值移動到3435 cm-1，在包覆香芹酚后，峰值進一步移動到3431 cm-l。該峰值的變化表明，由于zein 結構中的酰胺鍵與SC 中的酰胺鍵、Car 中的羥基相互作用，使三者物質間形成了強烈的 氫 鍵[16]。Zein/SC/Car NPs 在800～1450 cm-l處 的 光譜 與Zein/SC NPs 在800～1450 cm-l處 的 光 譜 有 明 顯區(qū)別，并且在1450 cm-l處觀察到1 個振動峰，這是由于香芹酚結構中的苯環(huán)振動引起的，進一步證實了香芹酚被成功包埋在納米粒子中。通過比較香芹酚與Zein/SC/Car NPs 在2960 cm-l處的吸收峰，可以發(fā)現(xiàn)后者的峰強度減小，沒有出現(xiàn)C—H 強尖峰，即在三元納米粒子中香芹酚與玉米醇溶蛋白間存在相互作用力，使其疏水性減弱。綜上可知，復合納米粒子的形成主要依賴于氫鍵和疏水驅動力。

Fig.1 FT-IR spectra of zein，Car，SC，zein/SC and zein/SC/Car

2.2 納米粒子包封率分析

包封率是指某種活性物質實際包裹量與理論投入量的比值。在香芹酚的添加量恒定的條件下，納米粒子的EE 受Zein/SC 比例的影響如Fig.2 所示。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，m(Zein)/m(SC) = 1:2 時，納米粒子的EE最高達到82.19%，相較于Liu 等[17]最大包封率(74.2%) 提高了8%左右。當m(Zein)/m(SC)小于4:1 時，隨著酪蛋白酸鈉質量的進一步增加，負載香芹酚的納米粒子的EE 也在逐漸增加。實驗中所制備的Zein/SC 納米粒子的包封率都較高，但適量的酪蛋白酸鈉可作為Zein/Car NPs 表面的靜電穩(wěn)定劑，能防止納米粒子在疏水力驅動下聚集形成大顆粒[11]。

Fig.2 Effect of zein and SC mass ratio on encapsulation efficiency of zein/SC nanoparticles

2.3 粒徑分布及其電位、多分散系數(shù)

從Fig.3 可以發(fā)現(xiàn)，不同Zein/SC 質量比的Zein/SC/Car NPs 的粒徑分布呈單峰狀，并且分布曲線的峰都比較尖銳，多分散系數(shù)(PDI)值也都小于0.4，該現(xiàn)象表明在同一質量比下的復合納米粒子的尺寸分布均勻，粒徑大小集中。隨著SC 含量的增加納米粒子的粒徑在逐漸減少，當Zein/SC 的質量比為4:1，2:1，1:1 和1:2 時，形成的納米粒子的平均粒徑分別大約在200 nm，140 nm，100 nm 和70 nm。由于Zein 和SC 分子間容易形成氫鍵[18]，隨著SC 含量的增加，兩者結構中形成的氫鍵越致密，導致生成的納米粒子的粒徑減小且分散性提高。不同Zein/SC質量比對納米粒子電位的影響與粒徑變化有相似的趨勢，隨著納米粒子中SC 含量的增加，納米粒子的電位值在逐漸減小。當m(Zein)/m(SC) = 4:1 時，粒子的電位值最小為－32.7 mV；當m(Zein)/m(SC)= 1:2時，粒子的電位值最大為－29.4 mV。隨著Zein/SC/Car NPs 粒徑的減小，其表面的電荷密度增加，但是粒子表面的凈電荷卻減少，導致粒徑較小的納米粒子的表面電位也減小。

Fig.3 Effect of zein and SC mass ratio on particle size, potential and polymer dispersity index(PDI) of zein/SC nanoparticles

2.4 復溶性

在實際應用中，固體的納米粒子有利于儲存和運輸。因此，復溶性是凍干粉末在實際應用中的一個重要性能。Fig.4 分別是Zein/SC NPs，Zein/SC/Car NPs 和Zein/Car NPs 在相同濃度下，在去離子水中的不同溶解分散圖。從Fig.4 可以發(fā)現(xiàn)，未添加SC 的Zein/Car NPs 分散液在靜置后表現(xiàn)出明顯的分層現(xiàn)象，并且分散液中的Zein/Car NPs 快速沉降于試劑瓶底部，上層的水溶液依然澄清透明；而添加了SC的復合納米粒子都有較好的復溶性，都能在水中分散并形成了均一的分散液。此外，Zein/SC NPs 分散液呈乳白色、Zein/SC/Car NPs 分散液呈淡藍色，該現(xiàn)象是因為香芹酚與玉米醇溶蛋白的非極性氨基酸間生成氫鍵，使形成的復合納米粒子粒徑變小，分散液更澄清所致。

Fig.4 Redispersibility of zein/SC NPs, zein/SC/Car NPs and zein/Car NPs

2.5 納米粒子的存儲穩(wěn)定性

Fig.5 分別是Zein/SC/Car NPs 在儲存0 d 和15 d時其粒徑、電位、PDI 值的變化圖。實驗中所制備的Zein/SC/Car NPs 都能溶于水中，但穩(wěn)定性不同。當m(Zein)/m(SC) = 1:2 時，Zein/SC/Car NPs 在靜置15 d后，粒徑大小及分布幾乎沒有變化。而其它樣品的粒徑都出現(xiàn)了不同程度的變化，主要表現(xiàn)為粒徑變小、分布更加集中。該結果表明，在靜置過程中由于部分不穩(wěn)定的復合納米粒子會逐漸沉降，致使上層分散液中粒子的粒徑更小、分布更加集中。通過比較納米粒子的電位可以發(fā)現(xiàn)，當m(Zein)/m(SC)=4:1 和2:1 時，靜 置15 d 后Zein/SC/Car NPs 的 電 位 有所減??；當m(Zein)/m(SC)= 1:1 和1:2 時，Zein/SC/Car NPs 的電位有所增大，其中m(Zein)/m(SC)= 1:2 的電位值變化最大，從－29 mV 增加到－37 mV。由此可見，SC 作為穩(wěn)定劑，有利于提高分散液的穩(wěn)定性。PDI 越小，表明粒徑分布得更均勻。不同Zein/SC 質 量 比 的 分 散 液 經 靜 置0 d 和15 d 后，PDI 值 均會出現(xiàn)不同程度的降低，即表明在靜置過程中分散液中的納米粒子的分布均勻性都會變好。綜上所述，m(Zein)/m(SC)= 1:2 的復合納米粒子的存儲穩(wěn)定性最好，其在放置過程中粒徑幾乎不會發(fā)生變化，并且其分散液的穩(wěn)定性和分散情況都趨于最好。

Fig.5 (a～d)Size, (e)potential and (f)PDI of zein/SC/Car nanoparticles with different mass ratios of zein and SC after storage dfor 0 d and 15 d

2.6 納米粒子的表觀形貌

通過FE-SEM 分析復合納米粒子的微觀形貌。如Fig.6 所示，負載香芹酚的復合納米顆粒都具有較好的球形結構。通過Fig.6(a～c)可以發(fā)現(xiàn)，Zein 和SC質量比為1:2 時，復合納米粒子的粒徑多數(shù)為50～90 nm，并且分布較均勻；極少數(shù)納米粒子尺寸小于50 nm，這是Zein 自組裝形成了中空的顆粒；少量的復合納米粒子的粒徑為160 nm 左右，是因為部分復合納米粒子表面缺乏帶電荷數(shù)少、斥力小，導致其團聚成大顆粒。通過Fig.6(d～f)可以發(fā)現(xiàn)，Zein 和SC 的質量比為4:1 時，復合納米粒子粒徑在100～200 nm，并且粒子間相互粘連，團聚在一起，該結果表明，少量SC 無法使納米粒子穩(wěn)定存在。由此可見，適量的SC 可以與玉米醇溶蛋白納米粒子相互作用，使粒子表面形成負電荷的COO—，促使粒子間相互排斥，從而提高其穩(wěn)定性；而缺乏SC 的復合納米粒子由于表面電荷數(shù)少，導致其穩(wěn)定性較差，容易發(fā)生團聚，從而形成大顆粒。

Fig.6 FE-SEM images of carvacrol-loaded nanoparticles

2.7 納米粒子的DSC 分析

DSC 可以用來研究高分子聚合物的熱性能。Zein，SC，Zein/SC NPs 和Zein/SC/Car NPs 的DSC 如Fig.7 所示，從曲線a，b 的變化可以看出，Zein 和SC的Tg分別約為160 ℃和208 ℃[19]。SC 在120 ℃左右出現(xiàn)了較為寬闊吸熱峰，這主要是因為樣品中水分蒸發(fā)引起的。Zein/SC NPs (曲線c)的DSC 曲線上在197 ℃出現(xiàn)了1 個Tg，表明Zein 與SC 完全混合。香芹酚的沸點在237 ℃，從曲線d 可以明顯看出包覆香芹酚的納米粒子在210 ℃左右出現(xiàn)1 個強的吸熱峰，這主要是因為香芹酚的蒸發(fā)和沸騰共同所致。與曲線a 和b 相比較，曲線d 中出現(xiàn)的明顯吸熱峰也再次驗證了香芹酚被成功負載到玉米醇溶蛋白/酪蛋白酸鈉的納米粒子之中。

Fig.7 DSC curves of (a) zein, (b)SC, (c)zein/SC NPs and (d)zein/SC/Car NPs

2.8 抗氧化性能

香芹酚結構上的酚羥基使香芹酚具有較好的抗氧化和抗菌性能，以空白組為對照，DPPH 自由基清除率為指標，來研究負載香芹酚納米粒子的抗氧化活性。由Fig.8 可知，隨著負載香芹酚納米粒子質量濃度從60μg/mL 增加到140μg/mL 時，抗氧化能力也在隨之提高，從開始的27%提高到了68.69%，并且DPPH 清除率的變化率也一直在增大，說明復合納米粒子的質量濃度越大，其抗氧化性能也越強。該結果表明，適量濃度的香芹酚可以表現(xiàn)出優(yōu)異的抗氧化性能，被包覆于納米粒子中時，其抗氧化活性不會被封裝體系所影響。

Fig.8 DPPH scavenging rate of zein/SC/Car nanoparticles with different mass concentrations (60 μg/mL, 80 μg/mL, 100 μg/mL, 120 μg/mL, 140 μg/mL)

2.9 抗菌性能

復合納米粒子具有優(yōu)異的抗菌性能是其應用于食品保鮮的重要基礎。包覆香芹酚納米粒子對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌效果如Fig.9 所示。隨著復合納米粒子的質量濃度的增加，平板上存活的菌落數(shù)逐漸減小，表明包覆香芹酚的復合納米粒子對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有優(yōu)異的抗菌效果。對金黃色葡萄球菌的抗菌結果：當納米粒子的質量濃度為2 mg/mL，6 mg/mL 和10 mg/mL時，抑菌率分別為69%，76%和91%；對大腸桿菌的抗菌結果：當納米粒子的質量濃度為2 mg/mL，6 mg/mL 和10 mg/mL 時，抑菌率分別為54%，72%和85%。從抑菌結果可以發(fā)現(xiàn)，包覆香芹酚的玉米醇溶蛋白納米粒子對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都具有的良好的抑菌效果，并且納米粒子質量濃度越高時，抗菌效果越明顯。該結果表明將香芹酚包覆于玉米醇溶蛋白納米粒子中時，既可以提高其穩(wěn)定性也不影響其抗菌性能。

Fig.9 Antibacterial effect of zein/SC/Car nanoparticles with different mass concentrations(0 mg/mL, 2 mg/mL, 6 mg/mL, 10 mg/mL)

3 結論

本研究采用pH 驅動法制備了負載香芹酚的玉米醇溶蛋白納米粒子，通過添加酪蛋白酸鈉提高了復合納米粒子的儲存穩(wěn)定性和復溶性，使香芹酚的抗菌和抗氧化性能更好地得到應用。通過紅外光譜和DSC 分析證實香芹酚被成功包埋在復合納米顆粒中，復合納米粒子的形成主要是由于3 種物質間形成了氫鍵和疏水力驅動。Zein/SC 質量比為1:2時的復合納米粒子，其粒徑小、包封率高且具有更好的復溶性和儲存穩(wěn)定性，同時也表現(xiàn)出較好的抗氧化性能和抗菌性能。Zein/SC/Car 納米粒子在食品保鮮和延長食品貨架壽命方面中具有廣闊的應用前景。