底物親和設(shè)計(jì)提高腈水解酶Nit6803活性

劉欣悅，韓來闖，劉中美

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

腈水解酶(Nitrilase，EC 3.5.5.1)，是一類可以將氰基一步水解為羧酸的酶，廣泛分布于植物、動(dòng)物、細(xì)菌、真菌和古菌中[1-3]。除了天然酶資源豐富、反應(yīng)條件溫和以外，Nitrilase還具有較強(qiáng)的區(qū)域選擇性和立體選擇性，因此是多種重要大宗化工品、藥物中間體的理想生物催化劑[4]。然而，目前鑒定的天然Nitrilase底物譜較窄、活性低、熱穩(wěn)定性差，極大地限制了其規(guī)模應(yīng)用[5]。近些年，人們不斷嘗試通過天然菌種分離、宏基因組分析等手段挖掘新型Nitrilase[6]。但是受制于酶活性與穩(wěn)定性間的“trade-off”效應(yīng)，嗜溫生物來源的Nitrilase活性較好但穩(wěn)定性差；嗜熱生物的Nitrilase穩(wěn)定性強(qiáng)但活性極低[7-8]。因此，直接挖掘得到高性能天然Nitrilase的希望十分渺茫。

酶分子改造是提升酶學(xué)性質(zhì)的有效手段，主要包含3種基本策略：定向進(jìn)化、理性設(shè)計(jì)及半理性設(shè)計(jì)，針對(duì)Nitrilase的分子改造也獲得了一定效果[9]。例如，SCHREINER等[10]基于易錯(cuò)PCR對(duì)來源于AlcaligenesfaecalisJM3的Nitrilase進(jìn)行定向進(jìn)化，提高其活性及對(duì)低pH的耐受性。定向進(jìn)化最為依賴高通量篩選方法，雖然一些顯色試劑和pH指示劑已被用來篩選Nitrilase的活性，但是依然遠(yuǎn)未達(dá)到理想的篩選通量[11]。因此，現(xiàn)階段構(gòu)建大容量的突變體庫對(duì)Nitrilase定向進(jìn)化依然十分困難。而另一方面，隨著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測、功能分析軟件不斷開發(fā)，以及計(jì)算機(jī)算力的指數(shù)增長，蛋白質(zhì)半理性、理性設(shè)計(jì)的易用性和可靠性快速提升。例如，基于人工智能的蛋白質(zhì)全原子結(jié)構(gòu)預(yù)測平臺(tái)AlphaFold2的開源，將結(jié)構(gòu)生物學(xué)從實(shí)驗(yàn)解析帶入了大規(guī)模預(yù)測的新階段[12]。華盛頓大學(xué)David Baker課題組開發(fā)的Rosetta套件功能多樣，且具備良好的可編程性，經(jīng)過多年發(fā)展，已經(jīng)成為蛋白質(zhì)分子改造、人工蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的強(qiáng)大工具[13]。而分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬及量子化學(xué)計(jì)算的廣泛應(yīng)用，為在微觀上觀察酶分子運(yùn)動(dòng)、解析催化機(jī)制提供了可能[14-16]。多種理性設(shè)計(jì)策略在Nitrilase的改造上也得到成功應(yīng)用，大幅提升其酶學(xué)性質(zhì)。例如，湯曉芒[17]對(duì)來源于古菌Pyrococcusabyssi的腈水解酶PaNit通過分子模擬及MaCrodox程序和TK-SA模型等計(jì)算方法獲得熱穩(wěn)定性增強(qiáng)且仍具備活力的突變體。YU等[18]通過催化口袋底物結(jié)合位點(diǎn)的重設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)了腈水解酶對(duì)映選擇性的調(diào)控，為腈水解酶在不對(duì)稱催化中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。對(duì)雜合腈水解酶BaNIT進(jìn)行組合突變設(shè)計(jì)，可提升其可溶表達(dá)、對(duì)映選擇性及活性[19]。

眾所周知，酶與底物的結(jié)合是其發(fā)揮催化功能的先決條件。大量研究表明，優(yōu)化催化口袋，提升酶與底物的親和力，能夠有效提高酶活力[20]。基于此，本研究提出一種酶-底物親和設(shè)計(jì)策略，以提高酶活力。如圖1所示，首先，設(shè)計(jì)催化口袋殘基的單點(diǎn)飽和突變，并用Cartesian_ddG方法過濾對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性不利影響的突變。然后使用自由能微擾(free energy perturbation,FEP)方法計(jì)算底物親和力變化，經(jīng)酶活力表征獲得正向突變。最后，進(jìn)一步做組合突變設(shè)計(jì)，提升活性。本研究選擇來源于Syechocystissp.PCC6803的腈水解酶Nit6803作為研究對(duì)象，該酶底物譜較廣，但酶活力較低，無法滿足應(yīng)用需求[21-22]。經(jīng)過本研究提出的底物親和策略改造，獲得了催化煙腈活性提升3.56倍的突變體，證明該策略的有效性。

圖1 酶-底物親和改造策略Fig.1 Enzyme-substrate affinity modification strategy

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

克隆宿主EscherichiacoilJM109、表達(dá)宿主EscherichiacoliER2566、表達(dá)質(zhì)粒pET-24a(+)，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要試劑

胰蛋白胨、酵母提取物，Oxoid公司；氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、咪唑、煙酸，國藥有限化學(xué)試劑有限公司；3-氰基吡啶，Sigma公司；異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)、卡那霉素，上海生工生物工程有限公司；培養(yǎng)基中的卡那霉素終質(zhì)量濃度為50 μg/mL。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10。固體培養(yǎng)基加入20 g/L瓊脂粉。2×YT培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨16，酵母提取物10，氯化鈉5。

1.1.4 緩沖液

PBS緩沖液：氯化鈉8 g，氯化鉀0.2 g，磷酸氫二鈉1.42 g，磷酸二氫鉀0.27 g，調(diào)pH至7.4，用去離子水定容至1 L。Binding buffer：0.2 mol/L 磷酸二氫鈉，0.2 mol/L 磷酸氫二鈉，調(diào)pH為7.4，加入20 mmol/L 咪唑。Washing buffer：上述Binding buffer中咪唑濃度調(diào)整至500 mmol/L。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分子對(duì)接

從PDB數(shù)據(jù)庫獲得Nit6803的三維結(jié)構(gòu)(PDB code:3 WUY)，從PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得底物3-氰基吡啶的三維結(jié)構(gòu)。使用軟件Schr?dinger的Glide模塊進(jìn)行分子對(duì)接(extra precision模式)，生成50個(gè)poses結(jié)果。結(jié)合對(duì)接打分及視覺判斷，選擇合適的對(duì)接pose，獲得Nit6803結(jié)合3-氰基吡啶的復(fù)合體結(jié)構(gòu)。定義距離底物5 ?以內(nèi)的氨基酸為組成催化口袋的殘基。使用在線工具PLIP(https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index)分析催化口袋殘基與底物間的相互作用。

1.2.2 折疊自由能計(jì)算

使用基于Rosetta的Cartesian_ddG方法計(jì)算點(diǎn)突變對(duì)蛋白質(zhì)折疊自由能的影響[23]。首先，通過內(nèi)坐標(biāo)relax對(duì)Nit6803的初始晶體結(jié)構(gòu)優(yōu)化，優(yōu)化時(shí)對(duì)蛋白骨架及殘基側(cè)鏈重原子添加坐標(biāo)限制勢。選擇能量最低的結(jié)構(gòu)進(jìn)行笛卡爾坐標(biāo)relax，進(jìn)一步優(yōu)化結(jié)構(gòu)。笛卡爾坐標(biāo)relax過程中不限制蛋白骨架及殘基側(cè)鏈重原子坐標(biāo)。使用兩步relax優(yōu)化后的結(jié)構(gòu)進(jìn)行Cartesian_ddG計(jì)算，根據(jù)相比于野生型的G評(píng)價(jià)突變對(duì)酶穩(wěn)定性的影響。定義G≤20.93 kJ/mol為對(duì)蛋白穩(wěn)定性沒有顯著影響。

1.2.3 酶-底物結(jié)合自由能計(jì)算

使用自由能微擾/漢密爾頓副本交換分子動(dòng)力學(xué)(FEP/hamiltonian replica exchange molecular dynamics, FEP/HREMD)計(jì)算酶與底物的結(jié)合自由能。計(jì)算所需文件使用在線工具CHARMM-GUI(https://charmm-gui.org/)生成，然后使用NAMD 2.14軟件進(jìn)行計(jì)算，副本數(shù)量設(shè)定為32。計(jì)算體系為邊界10 ?的正方體盒子，其中填充含有0.15 mol/L K+和Cl-的中性TIP3顯性水模型。

1.2.4 分子動(dòng)力學(xué)模擬

使用軟件NAMD 2.14進(jìn)行CHARMM36力場的分子動(dòng)力學(xué)模擬計(jì)算。3-氰基吡啶的拓?fù)湮募傲鰠?shù)由CGenFF生成。計(jì)算體系為邊界10 ?的正方體盒子，其中填充含有0.15 mol/L K+和Cl-的中性TIP3顯性水模型。計(jì)算步長為2 fs，非鍵相互作用的cutoff設(shè)定為12 ?。使用Particle Mesh Ewald(PME)實(shí)現(xiàn)周期性邊界條件的應(yīng)用。動(dòng)力學(xué)模擬過程包含1 ns在NVT系綜下的水平衡，60 ps NVT系綜下0～300 K的升溫，以及20 ns在NPT系統(tǒng)下300 K的常規(guī)動(dòng)力學(xué)模擬。使用Bio3D分析模擬過程的均方根偏差(root mean square deviation, RMSD)及不同殘基骨架的均方根波動(dòng)(root mean square fluctuation, RMSF)。

1.2.5 定點(diǎn)突變

腈水解酶Nit6803基因，由蘇州金唯智公司進(jìn)行密碼子優(yōu)化和基因合成，并連接至表達(dá)載體pET-24a(+)NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)之間，6×His-tag融合在Nit6803的C端，得到表達(dá)質(zhì)粒pET24a-Nit6803。以該質(zhì)粒作為模板，通過全質(zhì)粒PCR及無縫克隆構(gòu)建Nit6803突變體表達(dá)質(zhì)粒。50 μL的PCR擴(kuò)增體系包含：2×PrimeSTARTMMax DNA Polymerase(Takara，日本)25 μL、上下游引物各2 μL，模板0.5 μL、ddH2O 20.5 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為98 ℃預(yù)變性3 min，30個(gè)循環(huán)的98 ℃變性15 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min 45 s，最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用DpnⅠ消化酶消化2～3 h，以去除模板。純化后的片段使用ABclonal MultiF Seamless Assembly Mix(ABclonal Technology，中國)通過引物的同源臂序列無縫克隆自組裝，進(jìn)而轉(zhuǎn)化至E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于LB平板，37 ℃過夜培養(yǎng)。接取單菌落培養(yǎng)后，送蘇州金唯智公司測序驗(yàn)證。本研究所用引物見表1。

1.2.6 酶的表達(dá)與純化

將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliER2566感受態(tài)細(xì)胞，單菌落接種至含有3 mL LB的試管中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)8～10 h。以2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量轉(zhuǎn)接種子液到含有5 mL LB試管中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600≈0.6，添加終濃度為0.5 mmo/L的IPTG。在25 ℃、200 r/min下繼續(xù)培養(yǎng)12～16 h，收取菌液用于全細(xì)胞酶活力檢測。

表1 本文所用引物及其序列Table 1 Primers used in this study

挑取單菌落至含有3 mL LB的試管中，37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)8～10 h。以1%(體積分?jǐn)?shù))的接種量轉(zhuǎn)接種子液至含有100 mL 2×YT培養(yǎng)基的三角瓶中，37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)至OD600≈0.6，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，溫度調(diào)整至25 ℃繼續(xù)培養(yǎng)12～16 h。經(jīng)10 000 r/min離心3 min收集菌體，棄上清液，用20 mL Binding buffer重懸，于冰水混合物中超聲破碎。破碎液在4 ℃、12 000 r/min條件下離心30 min，取上清液過0.22 μm濾膜。采用親和層析的方法純化腈水解酶，純化柱為GE公司的HisTrap HP 5 mL柱。用Binding buffer平衡純化柱后上樣，然后用5～10個(gè)柱體積的Binding buffer洗去雜蛋白，目的蛋白用Washing buffer梯度洗脫并收集活性蛋白。蛋白濃度使用Bradford法定量，SDS-PAGE檢測蛋白純度。

1.2.7 酶活力測定

全細(xì)胞活性測定：使用PBS將細(xì)胞OD600調(diào)至2。取100 μL菌液，加入400 μL PBS和500 μL 100 mmol/L 3-氰基吡啶溶液，充分混勻后于37 ℃金屬浴中反應(yīng)10 min。反應(yīng)液12 000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。純酶活性測定：用PBS將純酶的質(zhì)量濃度稀釋至0.5 mg/mL，取10 μL至1.5 mL離心管中，加入490 μL 100 mmol/L 3-氰基吡啶溶液，充分混勻后于37 ℃金屬浴中反應(yīng)10 min。加入500 μL乙腈終止反應(yīng)，過0.22 μm濾膜。

使用HPLC測定反應(yīng)產(chǎn)物中煙酸含量。色譜柱為Diamonsil C18(2) 5 μm 250 mm×4.6 mm(迪馬科技，中國)，流動(dòng)相為乙腈和水的混合液[V(水)∶V(乙腈)=2∶1]。檢測波長為210 mm，柱溫40 ℃，流動(dòng)相流速為0.6 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測間隔為10 min，每組數(shù)據(jù)至少進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。單位酶活力定義為在37 ℃下每分鐘催化3-氰基吡啶生成1 μmol 煙酸所需要的酶量(U)。比酶活力為每毫克腈水解酶所具有的酶活力(U/mg)。

1.2.8 熱穩(wěn)定性測定

將酶質(zhì)量濃度調(diào)整至0.5 mg/mL，在金屬浴40 ℃和50 ℃下分別處理0、0.5、1、2、4 h取樣，測定其酶活力，以未經(jīng)熱處理的酶活力作為100%，分析其穩(wěn)定性。

1.2.9 分批補(bǔ)加3-氰基吡啶催化合成煙酸

反應(yīng)體系為50 mL于37 ℃、200 r/min的搖床中進(jìn)行催化合成，其中菌液OD600為10，每次添加50 mmol/L 3-氰基吡啶，共添加10次至終濃度為500 mmol/L。在一定時(shí)間取樣利用HPLC檢測煙酸生成量與底物殘留量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單點(diǎn)突變設(shè)計(jì)及表征

利用軟件Schr?dinger將3-氰基吡啶對(duì)接至Nit6803的晶體結(jié)構(gòu)中，獲得酶-底物復(fù)合體結(jié)構(gòu)(圖2-a)。定義距底物5 ?范圍內(nèi)的氨基酸殘基組成催化口袋，包含10個(gè)位點(diǎn)：Glu53、Tyr59、Phe64、Thr139、Tyr140、His141、Trp170、Met197、Val198和Phe202(圖2-b)。由于Pro對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)影響較大，因此不考慮突變?yōu)镻ro的設(shè)計(jì)。使用Rosetta的Cartesian_G計(jì)算催化口袋180個(gè)單點(diǎn)突變的折疊自由能，并計(jì)算相比于野生型(wild type, WT)的變化(G)，計(jì)算結(jié)果如圖2-c所示。定義G≤5為對(duì)蛋白的穩(wěn)定性影響不大，共包含86個(gè)單點(diǎn)突變。進(jìn)一步利用FEP/HREMD計(jì)算這些突變體的底物結(jié)合自由能，并與WT相比較(Gbinding)。定義Gbinding≤-1為對(duì)底物親和有顯著影響，包含10個(gè)單點(diǎn)突變體，結(jié)果見圖2-d。

構(gòu)建10個(gè)設(shè)計(jì)的單點(diǎn)突變體，誘導(dǎo)表達(dá)后測定全細(xì)胞酶活力。以WT的酶活力作為100%，結(jié)果如圖2-e所示，突變體F64Y、W170G的酶活力顯著高于野生型，分別達(dá)到野生型的200%、150%，V198D與野生型酶活力接近，其余突變體酶活力明顯降低。進(jìn)一步，對(duì)F64Y和W170G純化并測定純酶比酶活力，分別為(10.04±0.24)U/mg和(7.1±0.41)U/mg，顯著高于WT(4.93±0.48)U/mg(圖2-f)。由于催化口袋殘基較多，其組合突變的數(shù)量龐大，難以窮舉設(shè)計(jì)，因此首先對(duì)單點(diǎn)飽和突變進(jìn)行設(shè)計(jì)和表征。以上結(jié)果表明，通過底物親和力設(shè)計(jì)策略，成功獲得活性顯著提升的單點(diǎn)突變體，證明了策略的有效性。

a-酶-底物復(fù)合體結(jié)構(gòu)；b-催化口袋示意圖；c-單點(diǎn)突變Cartesian_G折疊自由能變化；d-單點(diǎn)突變FEP結(jié)合自由能變化； e-單點(diǎn)突變體全細(xì)胞相對(duì)酶活力；f-單點(diǎn)突變體比酶活力圖2 單點(diǎn)突變設(shè)計(jì)及酶活力表征Fig.2 Single-point mutation design and enzyme activity characterization

2.2 組合突變設(shè)計(jì)及表征

由單點(diǎn)突變體的酶活力結(jié)果可知Phe64和Trp170兩個(gè)位點(diǎn)對(duì)于該酶催化活性有顯著影響，因此基于這兩個(gè)位點(diǎn)做組合突變設(shè)計(jì)。與單點(diǎn)突變的設(shè)計(jì)策略類似，首先使用Cartesian_G計(jì)算324個(gè)組合突變體的折疊自由能，并計(jì)算相比于WT的變化(G)。計(jì)算結(jié)果如圖3-a所示，G≤5的有37個(gè)組合突變，且集中于F64H、F64 W、F64Y和W170F、W170Y幾種突變情況。這說明，由于WT中Phe64和Trp170都是大位阻芳香側(cè)鏈殘基，突變成其他類型側(cè)列氨基酸后對(duì)整體的折疊自由能影響較大。進(jìn)一步，利用FEP/HREMD對(duì)這些突變體的底物結(jié)合自由能進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果顯示，共有14個(gè)突變體的底物結(jié)合自由能相比于WT降低(圖3-b)。其中，僅有F64Y/W170G組合突變的底物結(jié)合自由能比單點(diǎn)突變的F64Y更低。

選擇Gbinding最低的F64Y/W170G，測定全細(xì)胞活性，結(jié)果顯示，F(xiàn)64Y/W170G的全細(xì)胞活性為野生型的476%(圖3-c)。對(duì)F64Y/W170G純酶的酶活力進(jìn)行測定，其比酶活力為(22.48±0.64) U/mg，為野生型的4.56倍(圖3-d)。該結(jié)果表明，針對(duì)Phe64和Trp170兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行組合突變設(shè)計(jì)，并通過底物親和計(jì)算，得到相比于單點(diǎn)突變進(jìn)一步提升活性的突變，證明了本文提出的設(shè)計(jì)策略的可靠性。

a-組合突變Cartesian_ΔΔG折疊自由能變化；b-組合突變FEP結(jié)合自由能變化；c-組合突變?nèi)?xì)胞相對(duì)酶活力；d-組合突變比酶活力圖3 組合突變設(shè)計(jì)及酶活力表征Fig.3 Combinatorial mutation design and enzyme activity characterization

為了解析組合突變F64Y/W170G顯著提升Nit6803催化3-氰基吡啶活性的分子機(jī)制，對(duì)WT和F64Y/W170G與底物結(jié)合復(fù)合體做20 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬計(jì)算(圖4-a)。由于活性中心與待催化基團(tuán)的距離與酶的活性高低關(guān)系密切[24]，我們分析了模擬過程中Nit6803活性中心Cys169的巰基和底物3-氰基吡啶的氰基之間的距離。結(jié)果表明，得益于F64Y/W170G與底物更高的親和力，其活性中心與底物間的距離相比WT更近(圖4-b)，這也是其具備更高活性的重要原因。進(jìn)一步，對(duì)WT和F64Y/W170G與底物間的相互作用分析，結(jié)果表明，F(xiàn)64Y/W170G保持了和WT類似的酶-底物相互作用：Tyr140與3-氰基吡啶的吡啶環(huán)形成π-π堆疊，Phe64、Val198與3-氰基吡啶存在疏水相互作用(圖4-c)。

2.3 突變體的熱穩(wěn)定性分析

本研究提出的設(shè)計(jì)策略首先使用Cartesian_G排除折疊自由能顯著提升的突變，以防止突變對(duì)熱穩(wěn)定性的不利影響。為了驗(yàn)證該步驟的有效性，測定WT與F64Y/W170G分別在40、50 ℃下處理后的殘余酶活力。以未熱處理的酶活力作為100%，結(jié)果如圖5-a所示，F(xiàn)64Y/W170G與WT的穩(wěn)定性基本一致，甚至在40 ℃下F64Y/W170G穩(wěn)定性略優(yōu)于WT。對(duì)未結(jié)合底物的WT和突變體進(jìn)行動(dòng)力學(xué)模擬分析，結(jié)果如圖5-b～圖5-d所示，RMSD結(jié)果顯示突變體的整體波動(dòng)小于野生型。F64Y/W170G的RMSF和回轉(zhuǎn)半徑Rg與WT相比沒有明顯差異，進(jìn)一步證明了F64Y/W170G和WT相比，不論是各殘基還是蛋白整體的穩(wěn)定性差別不大。以上結(jié)果表明通過本研究提出的設(shè)計(jì)策略，成功大幅提高了Nit6803活性的同時(shí)沒有影響其熱穩(wěn)定性。

a-300 K下野生型和突變體F64Y/W170G的RMSD值；b-野生型和突變體的活性中心Cys169巰基與底物氰基之間的距離； c-野生型和突變體F64Y/W170G與底物間的相互作用圖4 突變體F64Y/W170G分子動(dòng)力學(xué)模擬分析及與底物之間相互作用Fig.4 Molecular dynamics simulation analysis and interaction with substrate of mutant F64Y/W170G

a-野生型與突變體的熱穩(wěn)定性；b-400 K下野生型與突變體的RMSD值；c-400 K下野生型與突變體的RMSF值； d-400 K下野生型與突變體的回轉(zhuǎn)半徑Rg值圖5 突變體F64Y/W170G的熱穩(wěn)定性分析Fig.5 Thermal stability analysis of mutant F64Y/W170G

2.4 分批補(bǔ)加3-氰基吡啶催化合成煙酸

首先添加50 mmol/L底物進(jìn)行全細(xì)胞催化反應(yīng)，觀察在不同時(shí)間的底物殘留和產(chǎn)物生成情況，如圖6-a所示，WT在40 min可以轉(zhuǎn)化90%的3-氰基吡啶，在60 min完全轉(zhuǎn)化；F64Y/W170G在20 min可以轉(zhuǎn)化90%的底物，25 min可完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。說明F64Y/W170G的催化速率更快，同時(shí)確定WT與F64Y/W170G分批補(bǔ)加底物的時(shí)間間隔分別為40、20 min。因?yàn)椴捎玫牡萇D值的菌液進(jìn)行催化，為了減少表達(dá)量差異對(duì)于催化能力的影響，通過SDS-PAGE檢測兩者的表達(dá)情況，結(jié)果如圖6-b所示，WT與F64Y/W170G相同OD值下表達(dá)基本一致。說明突變體確實(shí)是由于酶活力的提升導(dǎo)致催化速率的加快。通過分批補(bǔ)加底物進(jìn)行全細(xì)胞催化，F(xiàn)64Y/W170G結(jié)果如圖6-c所示，轉(zhuǎn)化95%的底物生成煙酸需要250 min，在430 min時(shí)檢測不到底物，說明無底物殘留，完全轉(zhuǎn)化為煙酸。WT結(jié)果如圖6-d所示，轉(zhuǎn)化95%的底物需要540 min且到600 min時(shí)仍可檢測到底物存在。綜上所述，F(xiàn)64Y/W170G催化3-氰基吡啶能力強(qiáng)于WT，分批補(bǔ)加共500 mmol/L 3-氰基吡啶后達(dá)到95%的轉(zhuǎn)化率WT需要9 h，而F64Y/W170G只需4 h，相對(duì)于野生型來大幅縮短了催化時(shí)間。

M-Marker，1-WT，2-F64Y/W170G a-野生型與突變體對(duì)于50 mmol/L 3-氰基吡啶的反應(yīng)過程；b-野生型與突變體蛋白表達(dá)情況 c-F64Y/W170G分批補(bǔ)加3-氰基吡啶催化結(jié)果；d-WT分批補(bǔ)加3-氰基吡啶催化結(jié)果圖6 分批補(bǔ)加3-氰基吡啶催化合成煙酸Fig.6 Catalytic synthesis of nicotinic acid by adding 3-cyanopyridine in batches

3 結(jié)論

本文提出了一種結(jié)合Cartesian_G和FEP/HREMD的酶-底物親和力設(shè)計(jì)策略，并利用該策略成功提升了腈水解酶Nit6803對(duì)3-氰基吡啶的催化活性，同時(shí)沒有對(duì)酶的熱穩(wěn)定性造成不利影響。眾所周知，酶活性與穩(wěn)定性之間的“trade-off”效應(yīng)一直是酶分子改造的瓶頸，而本研究提出的策略為突破這一瓶頸的理性設(shè)計(jì)提供了新的范例。另外，本研究提出的策略直接計(jì)算所有單點(diǎn)突變和組合突變的影響，相比于傳統(tǒng)的基于丙氨酸掃描的半理性設(shè)計(jì)方法，具有更大的覆蓋范圍。

天然腈水解酶活性較低，嚴(yán)重限制了其工業(yè)應(yīng)用。本研究通過理性設(shè)計(jì)和分子改造，Nit6803催化3-氰基吡啶的活性顯著提升，其中組合突變F64Y/W170G的比酶活力達(dá)到了WT的4.56倍。通過分批補(bǔ)加底物進(jìn)行全細(xì)胞催化時(shí)，催化500 mmol/L 3-氰基吡啶使達(dá)到95%的轉(zhuǎn)化率野生型需要9 h，突變體只需要4 h，大幅縮短了催化時(shí)間，有望應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。而本研究提出的設(shè)計(jì)策略可以成為酶分子催化不同反應(yīng)的通用改造方法，不僅推進(jìn)腈水解酶的應(yīng)用，也為其他酶的改造提供了新的思路。