低氧暴露對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖和凋亡的影響

郭玉靜，胡英，龍啟福，許玉珍，李積東，永勝

氧關(guān)乎生物的生命，當(dāng)機(jī)體處于低氧狀態(tài)時(shí)會(huì)引起組織和細(xì)胞不可逆轉(zhuǎn)的損傷。低氧會(huì)改變細(xì)胞代謝［1］，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生［2］，導(dǎo)致氧化損傷［3］，并影響細(xì)胞的增殖和凋亡信號(hào)通路［4］。淋巴細(xì)胞作為機(jī)體重要的適應(yīng)性免疫應(yīng)答細(xì)胞，在維持免疫穩(wěn)態(tài)中必不可少。研究發(fā)現(xiàn)，低氧暴露可抑制CD3/CD28抗體介導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖、分化并減少B淋巴細(xì)胞激活因子受體和表面受體（如BCR、CD19等），導(dǎo)致淋巴細(xì)胞水腫，未成熟B淋巴細(xì)胞發(fā)育停滯，T、B淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，最終誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞損傷［5-7］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，低氧暴露30 d后，小鼠脾的T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少、CD4+T/CD8+T淋巴細(xì)胞比例下降且CD4+T淋巴細(xì)胞活化水平顯著降低［8］。然而，并未對(duì)低氧暴露誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞數(shù)量減少的機(jī)制進(jìn)行探究。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)低氧暴露對(duì)淋巴細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以探究低氧誘導(dǎo)下淋巴細(xì)胞數(shù)量減少的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6～8周齡SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠30只，體質(zhì)量（18±2）g，購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（陜）2020-005。飼養(yǎng)于18～22℃動(dòng)物房中，自由進(jìn)食飲水。本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)過(guò)青海大學(xué)倫理協(xié)會(huì)審查。

1.2試劑和儀器胎牛血清（FBS，北京TransGen Biotech公司）；抗小鼠CD3藻紅蛋白-花青素7（PE-cy7）抗體、抗小鼠CD19別藻青蛋白（APC）抗體、羧基熒光素乙酰乙酸（CFSE）增殖檢測(cè)試劑盒、FITC Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BD公司）；淋巴細(xì)胞非特異性刺激物刀豆蛋白A（ConA，美國(guó)Sigma公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）試劑盒（日本TaKaRa公司）；引物［生工生物工程（上海）股份有限公司］；硝酸纖維素（NC）膜（美國(guó)Pall Corporation公司）；鼠源B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（bcl-2）蛋白抗體、鼠源胱天蛋白酶-3（caspase-3）蛋白抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗和山羊抗小鼠二抗（Proteintech公司）；兔源bcl-2同源拮抗劑-殺傷蛋白（Bak）蛋白抗體（Affinity公司）；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。細(xì)胞培養(yǎng)箱（中國(guó)海爾公司）；低氧培養(yǎng)箱（美國(guó)BioSpherix公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman公司）；冷場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本JEOL公司）；熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；凝膠成像系統(tǒng)（法國(guó)VILBER公司）。

1.3方法

1.3.1小鼠脾淋巴細(xì)胞分離和培養(yǎng)將小鼠脫頸處死，用75%乙醇浸泡5 min，然后用無(wú)菌鑷剪切開(kāi)小鼠腹腔，摘除脾，用1 mL PBS清洗5次。將脾切為3份，置于2 mL PBS的無(wú)菌平皿內(nèi)，用無(wú)菌鑷擠壓脾組織。取脾細(xì)胞懸浮液經(jīng)200目尼龍篩濾器后，于50 mL無(wú)菌離心管中，4℃、1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，加3 mL紅細(xì)胞裂解液混合均勻，置于冰盒15 min，充分溶解后4℃、1 500 r/min離心10 min，棄去上清液，PBS沖洗1～2次。最后將含10%FBS與1%的青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸浮細(xì)胞。用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對(duì)10 μL的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，重復(fù)3次，取平均值（細(xì)胞存活率≥95%）。將細(xì)胞濃度調(diào)整為2.0×106/mL，然后將細(xì)胞（1×106個(gè)/mL）加入24孔板。將同一只小鼠淋巴細(xì)胞分為2組，常氧組置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2、21%O2、74%N2），低氧組置于低氧培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2、1%O2、94%N2）培養(yǎng)12、24、48 h。

1.3.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T、B淋巴細(xì)胞數(shù)量離心收集細(xì)胞沉淀，加入100 μL PBS重懸細(xì)胞，再加入2 μL抗小鼠CD3PE-cy7和CD19 APC抗體，同時(shí)設(shè)空白組、CD3 PE-cy7單標(biāo)管和CD19 APC單標(biāo)管。避光孵育15 min后，加入400 μL PBS重懸細(xì)胞。將染色完畢的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管，上機(jī)檢測(cè)T、B淋巴細(xì)胞百分比。

1.3.3CFSE檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖情況小鼠淋巴細(xì)胞提取完成后，加入CFSE（終濃度5 μmol/L）。37℃水浴15 min后，加入9×原體積的PBS，4℃、1 500 r/min離心5 min，棄上清。加入10 mL含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液，4℃、1 500 r/min離心10 min，洗滌2次。調(diào)整細(xì)胞含量為2.0×106個(gè)/mL，置于24孔板中，每孔加ConA（終質(zhì)量濃度3 mg/L）培養(yǎng)12、24、48 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖率。

1.3.4Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)淋巴細(xì)胞凋亡率通過(guò)FITC Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)凋亡百分比。用PBS洗滌細(xì)胞，4℃、1 500 r/min離心5 min，棄上清液，再懸浮在100 μL的1×FITC Binding Buffer中。用5 μL FITC Annexin V和5 μL PI避 光 染 色15 min。然 后 加 入400 μL 1×FITC Binding Buffer，培養(yǎng)12、24、48 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞凋亡率。

1.3.5掃描電鏡（SEM）觀察淋巴細(xì)胞形態(tài)離心收集細(xì)胞，加入2.5%戊二醛，并在4℃下固定24 h，隨后用PBS清洗3次。將樣品分別在30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇中梯度脫水10 min，干燥至臨界點(diǎn)。樣品在雙面導(dǎo)電膠帶上鋪展，粘貼在金屬短柱上，在濺射鍍膜裝置中鍍金2 min，然后在掃描電子顯微鏡下觀察。

1.3.6qPCR檢測(cè)Bak、bcl-2、caspase-3的mRNA表達(dá)離心收集細(xì)胞沉淀，加入1 mL TRIzol提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行RNA濃度及純度測(cè)定，并將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以β-actin為內(nèi)參，用qPCR法檢測(cè)淋巴細(xì)胞Bak、bcl-2、caspase-3的mRNA表達(dá)量。qPCR反應(yīng)體系：2×SYBR?Premix Ex TaqTM10 μL，上、下游引物（均為10 μmol/L）各0.8 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃5 s，63℃60 s，循環(huán)50次。采用2－ΔΔCt法計(jì)算相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

Tab.1 Sequence of the primers in qPCR表1 qPCR引物序列

1.3.7Western blot檢測(cè)Bak、bcl-2、caspase-3蛋白表達(dá)離心收集細(xì)胞，加入40～60 μL蛋白裂解液提取總蛋白，并用BCA法檢測(cè)其濃度，調(diào)整蛋白上樣量為30 μg/孔。使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，隨后將其轉(zhuǎn)移到NC膜上。在室溫下5%的脫脂奶粉中封閉2 h，TBST清洗3遍，添加Bak（1∶300）、bcl-2（1∶500）、caspase-3（1∶500）、β-actin（1∶10 000）一抗，在4℃下孵育過(guò)夜。次日，TBST清洗膜，用二抗（1∶5 000）在室溫下孵育1 h。最后使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）顯色液對(duì)蛋白進(jìn)行可視化，并用Image J分析軟件進(jìn)行分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 低氧處理對(duì)T、B淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響 與常氧組比較，低氧組12、24、48 h時(shí)T、B淋巴細(xì)胞的百分比下降（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.2 低氧處理對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響 與常氧組比較，12、24、48 h時(shí)低氧組淋巴細(xì)胞增殖率顯著下降（P＜0.01）。見(jiàn)圖1、表3。

2.3 低氧處理對(duì)淋巴細(xì)胞凋亡的影響 與常氧組比較，12、24、48 h低氧組淋巴細(xì)胞凋亡率均顯著增加（P＜0.05），見(jiàn)表4、圖2。

2.4 低氧處理對(duì)淋巴細(xì)胞形態(tài)的影響同一時(shí)間下低氧組較常氧組更早出現(xiàn)淋巴細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)特征，見(jiàn)圖3。12 h時(shí)，常氧組淋巴細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞膜完整，表面可見(jiàn)微絨毛；而低氧組淋巴細(xì)胞表面微絨毛消失。24 h時(shí)，低氧組較常氧組淋巴細(xì)胞體積增大，細(xì)胞破碎，胞漿外溢。48 h時(shí)，大量細(xì)胞出現(xiàn)晚期凋亡特征，常氧組淋巴細(xì)胞體積開(kāi)始增大，細(xì)胞塌陷、胞漿外溢，呈火山口樣結(jié)構(gòu)；低氧組淋巴細(xì)胞見(jiàn)大小不等、呈杵狀和球狀的突起，細(xì)胞完全破碎。

2.5 低 氧 對(duì) 淋 巴 細(xì) 胞Bak、bcl-2、caspase-3的mRNA表達(dá)影響與常氧組相比，12、24、48 h時(shí)，低氧組淋巴細(xì)胞Bak和caspase-3的mRNA表達(dá)量上調(diào)，bcl-2的mRNA表達(dá)量下調(diào)（P＜0.01），見(jiàn)表5。

2.6 低氧對(duì)淋巴細(xì)胞Bak、bcl-2、caspase-3的蛋白表達(dá)影響12、24、48 h時(shí)，低氧組較常氧組淋巴細(xì)胞Bak和caspase-3蛋白表達(dá)量升高，bcl-2蛋白表達(dá)量降低（P＜0.05）。見(jiàn)表6、圖4。

Tab.2 Comparison of the percentages of T and B lymphocytes at different time points between the two groups表2 2組不同時(shí)間T、B淋巴細(xì)胞百分比比較 （n=3，%，±s）

Tab.2 Comparison of the percentages of T and B lymphocytes at different time points between the two groups表2 2組不同時(shí)間T、B淋巴細(xì)胞百分比比較 （n=3，%，±s）

＊P＜0.05。

組別常氧組低氧組t 12 h T淋巴細(xì)胞40.17±1.90 32.26±3.30 3.603＊B淋巴細(xì)胞33.47±2.38 27.42±2.73 2.895＊24 h T淋巴細(xì)胞32.65±4.60 23.77±2.61 2.904＊B淋巴細(xì)胞27.96±1.50 23.39±2.31 2.873＊48 h T淋巴細(xì)胞26.30±1.11 23.16±1.33 3.140＊B淋巴細(xì)胞24.62±2.88 18.71±1.31 3.229＊

Fig.1 Effects of normoxia and hypoxia exposure on lymphocyte proliferation at different time points圖1常氧和低氧暴露不同時(shí)間對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響

Tab.3 Comparison of lymphocyte proliferation rates at different time points between two groups表3 2組不同時(shí)間淋巴細(xì)胞增殖率比較（n=3，%，±s）

Tab.3 Comparison of lymphocyte proliferation rates at different time points between two groups表3 2組不同時(shí)間淋巴細(xì)胞增殖率比較（n=3，%，±s）

＊＊P＜0.01。

組別常氧組低氧組t 12 h 31.56±1.63 27.31±2.05 4.749＊＊24 h 38.50±0.31 34.74±0.82 11.324＊＊48 h 43.32±1.35 40.66±0.49 5.566＊＊

Tab.4 Comparison of apoptosis rate of lymphocyte at different time points between the two groups表4 2組不同時(shí)間淋巴細(xì)胞凋亡率比較（n=3，%，±s）

Tab.4 Comparison of apoptosis rate of lymphocyte at different time points between the two groups表4 2組不同時(shí)間淋巴細(xì)胞凋亡率比較（n=3，%，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別常氧組低氧組t 12 h 17.05±1.33 22.28±1.13 5.446＊＊24 h 30.66±3.11 36.34±1.64 3.172＊48 h 82.01±1.66 86.99±1.42 6.033＊＊

Fig.2 Effects of normoxia and hypoxia exposure on lymphocyte apoptosis at different time points圖2常氧和低氧暴露不同時(shí)間對(duì)淋巴細(xì)胞凋亡的影響

Fig.3 Lymphocyte morphological changes of hypoxia exposure at different time points observed by SEM圖3 SEM觀察低氧暴露不同時(shí)間淋巴細(xì)胞形態(tài)變化

3 討論

低氧與免疫功能障礙關(guān)系密切。脾作為體內(nèi)最大的免疫器官在維持免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。脾的淋巴細(xì)胞是產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要部分，其數(shù)量變化與機(jī)體免疫功能密切相關(guān)［9］。因此，在本研究中選擇脾淋巴細(xì)胞作為研究對(duì)象來(lái)判斷低氧暴露后小鼠的免疫狀態(tài)。

CD3+分子在所有成熟T淋巴細(xì)胞中表達(dá)，是T淋巴細(xì)胞表面的特異性標(biāo)志物。CD19+是B淋巴細(xì)胞表面的特異性標(biāo)志物。本研究通過(guò)PE-cy7 CD3+和APC CD19+熒光染料分別標(biāo)記T、B淋巴細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)低氧暴露下T、B淋巴細(xì)胞數(shù)量均減少。在低氧條件下，缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）表達(dá)常升高。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α可以促進(jìn)滑膜成纖維細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞之間相互作用，抑制調(diào)節(jié)性B淋巴細(xì)胞和初始B淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)γ干擾素（IFN-γ）、白細(xì)胞介素（IL）-17炎性細(xì)胞因子和IgG自身抗體的產(chǎn)生，從而加重類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的病情［10］。研究表明［11-12］，低氧可抑制CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的增殖，并降低活化T細(xì)胞總腺苷三磷酸產(chǎn)量以及IFN-γ、IL-3、IL-12和IL-18分泌。CD4+T淋巴細(xì)胞主要分化為Th細(xì)胞，Th細(xì)胞在免疫應(yīng)答過(guò)程中起關(guān)鍵作用，影響免疫細(xì)胞的活化［13-14］。Th細(xì)胞活化后分化為Th1、Th2和Tfh效應(yīng)細(xì)胞，其中Th2亞群通過(guò)分泌IL-4、IL-5、IL-6等細(xì)胞因子，Tfh細(xì)胞通過(guò)分泌IL-21促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的增殖和分化［15］。因此，推斷低氧暴露下T淋巴細(xì)胞數(shù)量的減少可能影響調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞因子分泌，進(jìn)而導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞減少。

Tab.5 Comparison of mRNA expression levels of Bak,bcl-2 and caspase-3 in lymphocytes at different time points between the two groups表5 2組低氧暴露不同時(shí)間淋巴細(xì)胞Bak、bcl-2、caspase-3 mRNA表達(dá)水平比較 （n=3，±s）

Tab.5 Comparison of mRNA expression levels of Bak,bcl-2 and caspase-3 in lymphocytes at different time points between the two groups表5 2組低氧暴露不同時(shí)間淋巴細(xì)胞Bak、bcl-2、caspase-3 mRNA表達(dá)水平比較 （n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別常氧組低氧組t 12 h Bak 0.98±0.12 1.11±0.18 2.248＊bcl-2 1.00±0.10 0.66±0.21 4.527＊＊caspase-3 0.96±0.08 1.25±0.35 2.171＊24 h Bak 1.01±0.36 1.43±0.28 2.724＊bcl-2 1.10±0.30 0.52±0.22 4.440＊＊caspase-3 0.94±0.08 1.15±0.19 2.532＊48 h Bak 0.95±0.49 1.44±0.42 2.721＊bcl-2 1.16±0.47 0.74±0.39 2.516＊caspase-3 0.98±0.16 2.21±0.56 5.973＊＊

Tab.6 Comparison of Bak,bcl-2 and caspase-3 protein expression levels in lymphocytes at different time pointsbetween the two groups of mice表6 2組低氧暴露不同時(shí)間淋巴細(xì)胞Bak、bcl-2、caspase-3蛋白表達(dá)水平比較 （n=3，±s）

Tab.6 Comparison of Bak,bcl-2 and caspase-3 protein expression levels in lymphocytes at different time pointsbetween the two groups of mice表6 2組低氧暴露不同時(shí)間淋巴細(xì)胞Bak、bcl-2、caspase-3蛋白表達(dá)水平比較 （n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別常氧組低氧組t 12 h Bak 0.31±0.11 0.54±0.09 2.828＊bcl-2 0.62±0.06 0.44±0.09 2.819＊caspase-3 0.45±0.08 0.72±0.15 2.794＊24 h Bak 0.23±0.15 0.48±0.03 2.799＊bcl-2 0.90±0.14 0.50±0.17 3.117＊caspase-3 0.71±0.06 0.94±0.13 2.787＊48 h Bak 0.37±0.13 0.73±0.17 2.867＊bcl-2 0.36±0.04 0.23±0.02 4.658＊＊caspase-3 0.36±0.03 0.66±0.10 4.950＊＊

Fig.4 Protein expression levels of Bak,bcl-2 and caspase-3 in lymphocytes at different time points between the two groups of mice圖4低氧暴露不同時(shí)間淋巴細(xì)胞Bak、bcl-2、caspase-3的蛋白表達(dá)水平

淋巴細(xì)胞增殖和凋亡可影響CD4+T/CD8+T淋巴細(xì)胞的比例［8］、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的數(shù)量及免疫系統(tǒng)功能［16-17］。為進(jìn)一步探究低氧暴露下淋巴細(xì)胞數(shù)量減少的原因，本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)低氧暴露對(duì)淋巴細(xì)胞增殖和凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)在ConA刺激下，低氧暴露對(duì)淋巴細(xì)胞增殖有抑制作用。淋巴細(xì)胞增殖是免疫應(yīng)答的重要因素，增殖減少可導(dǎo)致細(xì)胞損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和染色體重組等功能發(fā)生改變［18-19］。此外，細(xì)胞凋亡也是引起細(xì)胞損傷的重要因素，低氧在促進(jìn)淋巴細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，HIF通過(guò)抑制過(guò)渡性B細(xì)胞，來(lái)增加生發(fā)中心B淋巴細(xì)胞的糖酵解速率，從而減少細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡并調(diào)節(jié)抗體產(chǎn)生［20］。Shan等［21］將HIF-1α轉(zhuǎn)染至巨噬細(xì)胞后與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，可以抑制T淋巴細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究通過(guò)評(píng)估淋巴細(xì)胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)低氧能明顯誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡，提示淋巴細(xì)胞增殖減少或凋亡增加可能是低氧暴露誘導(dǎo)T、B淋巴細(xì)胞減少的重要原因。

為進(jìn)一步明確低氧引起淋巴細(xì)胞數(shù)量改變的主要原因，本研究通過(guò)SEM觀察淋巴細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果顯示，淋巴細(xì)胞隨著時(shí)間的推移出現(xiàn)凋亡特征形態(tài)學(xué)改變，且在同一時(shí)間下低氧組較常氧組更早出現(xiàn)凋亡特征形態(tài)學(xué)變化，提示低氧可能主要通過(guò)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡而使其數(shù)量減少。細(xì)胞凋亡由多個(gè)基因和通路協(xié)調(diào)。bcl-2家族在細(xì)胞凋亡中起至關(guān)重要的作用，主要分布在核膜、線粒體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，以維持細(xì)胞器膜的完整性［22］。bcl-2家族主要分為抗凋亡基因（bcl-2、bcl-xl等）和促凋亡基因（Bax、Bak等）［23］。這2組蛋白表達(dá)失衡可導(dǎo)致線粒體損傷，釋放促凋亡因子并激活下游caspases家族，引起細(xì)胞凋亡［24］。caspase-3的激活通常被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志［25］。研究發(fā)現(xiàn)，低氧通過(guò)下調(diào)bcl-2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡［26］。Zhao等［27］發(fā)現(xiàn)，低氧暴露促進(jìn)人類子宮囊性韌帶成纖維細(xì)胞凋亡，凋亡相關(guān)因子caspases、Bax/bcl-2顯著上調(diào)。本研究中低氧暴露不同時(shí)間下淋巴細(xì)胞抗凋亡基因bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)；促凋亡基因Bak和caspase-3的mRNA和蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)，與上述研究結(jié)果一致。

綜上，低氧暴露可降低小鼠脾T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞數(shù)量，抑制淋巴細(xì)胞增殖，促進(jìn)淋巴細(xì)胞凋亡，并進(jìn)一步加快淋巴細(xì)胞出現(xiàn)凋亡特征形態(tài)學(xué)改變，同時(shí)誘導(dǎo)凋亡相關(guān)因子在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平發(fā)生顯著差異。后續(xù)將進(jìn)一步探討低氧暴露誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制及相關(guān)通路，為揭示低氧引起免疫功能障礙的機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。