SARS-CoV-2輔助蛋白ORF8的功能及研究進(jìn)展

付亞男，曾鳳，饒晶晶，黃艷萍，劉志新，劉龍

截至2022年5月25日，新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）共造成5億多人患病，600多萬人死亡［1］。SARSCoV-2與SARS-CoV同屬β冠狀病毒屬，基因組序列相似，均編碼刺突蛋白（spike protein，S）、核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，N）、膜蛋白（membrane protein，M）、包膜蛋白（envelope protein，E）、16種非結(jié)構(gòu)蛋白及多種輔助蛋白。SARS-CoV-2與SARSCoV具有較高的序列同源性和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用相似性［2］，但SARS-CoV-2和SARS-CoV的輔助蛋白ORF8具有較低的蛋白質(zhì)序列同源性：核苷酸同源性為55.4%，蛋白質(zhì)同源性為30%［3］。SARSCoV-2輔助蛋白在病毒生命周期和毒力強(qiáng)弱中發(fā)揮著重要作用，輔助蛋白ORF8與病毒復(fù)制無關(guān)，但能夠與宿主分子直接相互作用，提高了病毒感染的可能性［2］。目前，SARS-CoV-2輔助蛋白正快速進(jìn)化及突變，可能會造成病毒毒力及傳播性的增加，而通過研究病毒輔助蛋白可為臨床診斷新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）提供新的途徑及治療藥物。本文主要?dú)w納總結(jié)了SARS-CoV-2輔助蛋白ORF8的突變及功能，旨在為臨床治療COVID-19提供相關(guān)線索及理論支持。

1 SARS-CoV-2輔助蛋白ORF8的結(jié)構(gòu)與功能

1.1 ORF8的結(jié)構(gòu)SARS-CoV-2輔助蛋白ORF8的晶體結(jié)構(gòu)為共價二聚體，ORF8單體結(jié)構(gòu)是由β1～β8形成反向平行的β折疊；ORF8二級結(jié)構(gòu)由1個短的α-螺旋、7個β-鏈和1個未知的外部結(jié)構(gòu)域組成［4］。SARS-CoV-2 ORF8屬于免疫球蛋白（Ig）新家族，由N端序列和Ig樣折疊組成，是含有121個氨基酸的分泌蛋白，定位并富集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）［5］。經(jīng)多重比對和結(jié)構(gòu)分析表明，SARS-CoV-2 ORF8與SARS-CoV ORF8蛋白是不同的新型病毒蛋白，兩者具有較低的序列相似性與結(jié)構(gòu)同源性［6-7］。

1.2 ORF8的功能SARS-CoV-2通過結(jié)合血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）受體進(jìn)入細(xì)胞后，基因組序列編碼的開放閱讀框翻譯為不同的病毒蛋白，其中輔助蛋白在抵御宿主免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮了重要作用。機(jī)體在抵抗SARS-CoV-2感染的過程中涉及多條抗病毒信號通路，其中以Ⅰ型干擾素（typeⅠinterferon，IFN-Ⅰ）通路與核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路為主。IFN-Ⅰ和NF-κB通路主要通過誘導(dǎo)IFN-Ⅰ及炎性細(xì)胞因子的釋放來抵抗病毒感染。SARS-CoV-2 ORF8介導(dǎo)IFN-Ⅰ通路的抑制及NF-κB通路的激活，在抑制宿主免疫反應(yīng)中起重要作用。（1）SARS-CoV-2 ORF8能夠抑制IFN-Ⅰ通路。①ORF8可以通過抑制干擾素刺激反應(yīng)元件（interferon stimulus response element，ISRE）的產(chǎn)生與減少干擾素調(diào)節(jié)因子3（interferon regulatory factor 3，IRF3）的核轉(zhuǎn)位來抑制干擾素的產(chǎn)生［8-9］。②ORF8下調(diào)聚肌苷酸胞苷酸（polynosinlc acidpolycyttdylic acld，Poly I:C）誘導(dǎo)的IFN-β和干擾素刺激基因（interferon-stimulating genes，ISGs）表達(dá)［10］。③ORF8蛋白通過激活轉(zhuǎn)錄激活因子6（activating transcription factor 6，ATF6）和肌醇依賴酶1（inositolrequiring enzyme 1，IRE1）通路誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS），ERS通路的激活在介導(dǎo)IFN-β產(chǎn)生方面具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用［10］。然而，ERS通路的激活如何影響IFN-β和ISGs表達(dá)的詳細(xì)機(jī)制仍有待闡 明。（2）SARS-CoV-2感 染細(xì)胞 后，輔 助 蛋白ORF8在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)直接與主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ（major histocompatibility complexⅠ，MHCⅠ）分子相結(jié)合，促進(jìn)MHCⅠ運(yùn)輸?shù)阶允审w，隨后ORF8與自噬基因Beclin1相互作用，啟動自噬溶酶體降解，MHCⅠ的降解減少了其與CD8+T細(xì)胞的結(jié)合，介導(dǎo)SARS-CoV-2逃避CD8+T細(xì)胞的殺傷作用［11］。（3）SARS-CoV-2 ORF8通過與宿主重組白細(xì)胞介素17受體A（interleukin 17 receptor A，IL-17RA）相互作用激活白細(xì)胞介素17（interleukin 17，IL-17）信號通路來促進(jìn)促炎因子表達(dá)，然后ORF8與IL-17RA結(jié)合募集NF-κB激活劑1（Act1），Act1可以與腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6）結(jié)合激活NF-κB通路，導(dǎo)致大量炎性因子釋放［12］。同時IL-17抗體能夠通過抑制ORF8與IL-17RA的相互作用來控制細(xì)胞因子風(fēng)暴，為治療COVID-19提供潛在靶點(diǎn)［13］。SARS-CoV-2在早期感染階段逃避宿主抗病毒免疫反應(yīng)的機(jī)制見圖1。

1.3 SARS-CoV-2與SARS-CoV ORF8的 功 能 比較SARS-CoV ORF8是一種ER駐留膜蛋白［14］。在SARS-CoV流行的中晚期，ORF8蛋白伴隨著29個核苷酸（nucleotides，nt）缺失，導(dǎo)致ORF8a和ORF8b兩種截短功能蛋白的產(chǎn)生，SARS-CoV ORF8的29 nt缺失減弱了病毒的復(fù)制［15］。ORF8a和ORF8b分別編碼39個和84個殘基多肽，ORF8a的氨基酸個數(shù)太少，因此不能發(fā)揮信號功能；ORF8b蛋白極其不穩(wěn)定，會迅速降解［16］。ORF8ab通過誘導(dǎo)ATF6蛋白水解和加工的N端的核易位來調(diào)節(jié)未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）［14］。ORF8ab的N81是其N-連接糖基化位點(diǎn)，糖基化對蛋白質(zhì)的寡聚化、分選、運(yùn)輸和折疊起重要作用［17］。未糖基化的ORF8ab是不穩(wěn)定的，這解釋了在沒有ORF8a區(qū)域的情況下，ORF8b會迅速降解，并推測糖基化有助于ORF8b的折疊［18］。SARS-CoV輔助蛋白ORF8b和ORF8ab以泛素-蛋白酶體依賴性方式誘導(dǎo)IRF3的降解，從而導(dǎo)致IRF3二聚化減少，最終抑制IFN-β信號通路［19］。ORF8b區(qū)域可能包含多個功能域來發(fā)揮功能，如泛素結(jié)合、泛素化和糖基化等，從而參與ORF8ab穩(wěn)定性、宿主-病毒相互作用和生化特性的調(diào)節(jié)［18］。然而，迄今為止尚未在ORF8a區(qū)域中鑒定出功能域，但ORF8a可以通過線粒體依賴性途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［20］。這表明沉默蛋白ORF8ab的表達(dá)可能是靶向SARS-CoV逃避宿主防御機(jī)制的策略［14］。

Fig.1 Diagram of the mechanism of SARS-CoV-2 ORF8 escaping host antiviral immune response圖1 SARS-CoV-2 ORF8逃避宿主抗病毒免疫反應(yīng)機(jī)制圖

2 SARS-CoV-2輔助蛋白ORF8的突變

2.1 ORF8截短突變SARS-CoV-2輔助蛋白ORF8具有快速進(jìn)化的特性，且正在經(jīng)歷快速的非隨機(jī)進(jìn)化［21］。2020年1月23日—3月25日，新加坡和中國臺灣收集的191個臨床樣本中有23.6%存在ORF8 382 nt的缺失，表明該缺失突變體保留了在人與人之間有效感染及傳播的能力［7］。該突變體導(dǎo)致了ORF8/ORF7b的缺失，其與較輕的癥狀和較低的病毒復(fù)制能力有關(guān)［22］。SARS-CoV-2 ORF8缺失突變體會影響蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，如5′端336 nt缺失消除了ORF8轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列［23］。2020年12月發(fā)現(xiàn)的ORF8 Q27stop突變體可能改變了病毒的傳播能力，基因組中大多數(shù)刺突蛋白的突變與ORF8 Q27stop和ORF8 K68stop相關(guān)，表明監(jiān)測ORF8的缺陷譜系對了解COVID-19的流行至關(guān)重要［24］。目前，SARS-CoV-2輔助蛋白ORF8缺失突變體仍在繼續(xù)進(jìn)化，且將有可能進(jìn)化為另一進(jìn)化枝，這一發(fā)現(xiàn)將有助于了解SARS-CoV-2的傳播及進(jìn)化動態(tài)。

2.2 ORF8點(diǎn) 突 變SARS-CoV-2 ORF8第84位 氨基酸為亮氨酸或絲氨酸，因此具有ORF8L和ORF8S兩種核苷酸序列［25］。研究者從6 337個核苷酸序列中鑒定出240個SARS-CoV-2 ORF8的非同義突變，其中7%是無義突變，93%是錯義突變，在這些突變體中，L84S為最主要的突變［26］。L84S突變通常會伴隨V62L突變，V62L和S24L突變可能具有臨床意義［27］。SARS-CoV-2 ORF8突變體導(dǎo)致該病毒在傳染性、致病性和免疫逃逸方面存在顯著差異，其原因可能是病毒突變體增強(qiáng)了病毒逃避宿主免疫系統(tǒng)的能力，ORF8 L84S突變體不能像野生型抗原肽一樣與MHCⅡ等位基因抗原結(jié)合槽結(jié)合，從而產(chǎn)生逃避宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力［28］。特別是W45L突變體，能夠增加其與IRF3的結(jié)合親和力來幫助病毒逃避免疫系統(tǒng)［9］，表明ORF8突變體可能會進(jìn)一步逃避宿主免疫監(jiān)視。S24L是ORF8中第二大常見的突變，其可以增加ORF8蛋白的折疊穩(wěn)定性，并與SARS-CoV-2的傳播有關(guān)［29-30］。因此，SARS-CoV-2ORF8突變體的出現(xiàn)可能與病毒免疫逃逸和毒力增強(qiáng)有關(guān)。

3 SARS-CoV-2輔助蛋白ORF8在COVID-19診斷和治療中的前景

3.1 ORF8抗體在血清學(xué)檢測和診斷中的應(yīng)用前景SARS-CoV-2以高毒力、高傳染性為特征，常用的檢測方法多為血清學(xué)檢測［31］。SARS-CoV-2ORF8具有分泌性而被表征為新型免疫原性分泌蛋白，在COVID-19患者的血清中能夠檢測到ORF8抗體。研究發(fā)現(xiàn)ORF8抗體的產(chǎn)生早于N蛋白抗體，抗ORF8抗體的檢測比傳統(tǒng)的抗N抗體檢測更靈敏和準(zhǔn)確，通過ELISA分析表明，ORF8在COVID-19患者的抗體反應(yīng)方面具有高度免疫原性［6］。據(jù)此，SARS-CoV-2 ORF8抗體可以用來進(jìn)行血清學(xué)檢測和診斷，同時也為疫苗開發(fā)提供了依據(jù)。

3.2 ORF8在藥物治療中的應(yīng)用前景SARS-CoV-2 ORF8作為拮抗宿主天然免疫反應(yīng)的重要蛋白，通過抑制ORF8來改善病毒的免疫逃逸和病毒感染可能是一種有效的治療策略。通過鑒定高可信度的SARS-CoV-2蛋白質(zhì)-宿主蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，研究人員確定了69種相互作用物，其中66種可以用于藥物研究，并發(fā)現(xiàn)47種人類蛋白質(zhì)與SARS-CoV-2輔助蛋白ORF8相互作用；其中有15種是處于臨床前、臨床試驗或已獲得美國食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)的已知藥物靶點(diǎn)［32］。從灌木葉中分離出的化合物具有作為免疫調(diào)節(jié)劑的潛力，這些化合物能夠與SARS-CoV-2 ORF8 mRNA的翻譯起始位點(diǎn)及翻譯終止位點(diǎn)結(jié)合，從而抑制與COVID-19感染有關(guān)的細(xì)胞因子風(fēng)暴，因此建議進(jìn)一步研究灌木葉分離出的化合物的免疫調(diào)節(jié)特性及ORF8蛋白在COVID-19感染藥物開發(fā)中的作用［33］。另外，ORF8可以激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白（P13K/Akt/mTOR）信號通路以維持病毒增殖的環(huán)境；雷帕霉素是雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1（mTORC1）的抑制劑［3］，通過雷帕霉素抑制mTORC1的活性來阻斷細(xì)胞生長途徑可能是抵抗病毒感染的治療策略。

4 小結(jié)與展望

SARS-CoV-2 ORF8不 僅 對COVID-19的 發(fā) 病機(jī)制和免疫調(diào)節(jié)具有重要作用，而且對于藥物和診斷試劑的開發(fā)也很重要。SARS-CoV-2 ORF8抗體較N抗體具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性而被提議用作血清學(xué)檢測和診斷COVID-19的標(biāo)志物［6］。但ORF8較高的突變性和進(jìn)化性可能會影響血清學(xué)反應(yīng)和作為治療靶點(diǎn)的可行性［3］。目前已經(jīng)有研究報道，ORF8中的突變體能夠增加其與IRF3的結(jié)合親和力，從而幫助病毒逃避宿主免疫系統(tǒng)［9］。因此這種高突變性及高進(jìn)化性很有可能會加重病毒對人體的感染及在宿主體內(nèi)的復(fù)制。目前尚不清楚ORF8變異是否會影響抗原表位的變化，因此必須研究SARS-CoV-2 ORF8的各種自然變異對檢測及診斷COVID-19的潛在影響。

同時，SARS-CoV-2 ORF8蛋白通過影響宿主各種免疫途徑來逃避免疫監(jiān)視，研究其背后的分子機(jī)制將增進(jìn)對ORF8在COVID-19發(fā)病機(jī)制中作用的認(rèn)識，有助于開發(fā)有效的抗病毒藥物。今后需要進(jìn)一步揭示SARS-CoV-2 ORF8高頻突變的重要性及其對宿主免疫應(yīng)答相關(guān)的影響，這將有利于SARSCoV-2的溯源工作。