對叔丁基鄰苯二酚抑藻效果及毒性應(yīng)用研究

陳宏偉，王志紅，仇永婷，劉立凡

（1.深圳市水務(wù)（集團）有限公司，廣東 深圳 518000;2.廣東工業(yè)大學 土木與交通工程學院，廣東 廣州 510000）

0 引言

化感作用是指由植物、細菌等所產(chǎn)生的二次代謝產(chǎn)物影響生態(tài)系統(tǒng)中一些生物的生長和發(fā)育的現(xiàn)象，這些代謝產(chǎn)物被稱為化感物質(zhì)[1]。基于化感作用治理富營養(yǎng)化水體因其高效性、環(huán)境友好性等優(yōu)勢受到國內(nèi)外研究人員的關(guān)注，是目前水環(huán)境領(lǐng)域的研究熱點。四尾柵藻與水華微囊藻共培時，通過釋放酚酸類化感物質(zhì)對叔丁基鄰苯二酚（TBC）來抑制水華微囊藻的生長，維持自身的競爭優(yōu)勢，譚凱婷等[2]研究發(fā)現(xiàn)，實驗室條件下，TBC 對銅綠微囊藻也擁有顯著的抑制效果。但目前對該化感物質(zhì)抑藻的研究多集中在實驗室配置的培養(yǎng)液條件下，對自然水體環(huán)境下的抑藻效果研究較少，且以上研究僅針對TBC 對單一藻類的抑制效果，無法全面反映其實際應(yīng)用前景。為此，分別選取以藍藻為主的廣州大學城中心湖（以下簡稱中心湖）、以綠藻為主的華南理工大學景觀湖水體（以下簡稱華工湖）及藍藻、綠藻占比均等的廣東工業(yè)大學行政樓景觀湖水體（以下簡稱廣工湖）3 種典型自然水體作為研究對象，研究不同濃度的TBC 對自然水體中藻類的抑制效果、生物毒性及降解產(chǎn)物，以期使我國的化感抑藻技術(shù)盡快成熟和推廣應(yīng)用。

1 試驗方法及材料

1.1 試驗方法

（1）TBC 對3 種典型自然水體的抑藻效果試驗

分別從廣州大學城中心湖、華工湖及廣工湖水體中采樣后將2.0 L 試驗水樣裝入容量為2.5 L的燒杯中，再將水樣中TBC 質(zhì)量濃度分別設(shè)置為0，0.05，0.1，0.5，1.0，2.0 及5.0 mg/L，培養(yǎng)條件盡量還原我國南方夏季典型藻華爆發(fā)高峰期的環(huán)境參數(shù)，選用自然光照，試驗期間測定光照度范圍為2 500 ± 500 lx，光暗比為12 h ∶12 h，溫度范圍為30 ～35 ℃，試驗周期為15 d。每組設(shè)置3 個平行樣，培養(yǎng)過程中用玻璃棒每天攪動3 次，同時調(diào)換燒杯位置。以上水樣分別在第0，1，2，4，7，10 和15 天時定期取樣，檢測并記錄各組水樣中藻類的葉綠素濃度數(shù)據(jù)。

（2）TBC 的生物毒性試驗

受試生物選用大型溞，試驗在150 mL 燒杯中進行。以蒸餾水、中心湖、華工湖及廣工湖原水為試驗水樣，將水樣中TBC 質(zhì)量濃度分別設(shè)置為0，0.05，0.1，0.5，1.0，2.0 及5.0 mg/L，每個水樣中投入10 個大型溞，每組設(shè)置3 個平行樣，試驗過程中定期觀察并及時移除死掉的受試生物以避免對水體造成污染。設(shè)置光照度范圍為2 500 ± 500 lx，光暗比為12 h ∶12 h，溫度范圍為30 ～35 ℃，試驗周期為96 h。

（3）TBC 的降解產(chǎn)物研究試驗

以蒸餾水、中心湖、華工湖及廣工湖原水為試驗水樣，設(shè)置水樣中TBC 質(zhì)量濃度為2.0 mg/L。光照度范圍為2 500±500 lx，光暗比為12 h ∶12 h，溫度范圍為30 ～35 ℃，每組設(shè)置3 個平行樣。以上水樣分別在第0，1，2，4，6，8 和10 天時定期取樣并檢測各水樣中的降解產(chǎn)物類型。

1.2 試驗材料

（1）試驗水樣

試驗用水樣分別取自中心湖、華工湖、廣工湖。設(shè)置3 組重復(fù)試驗，取水日期分別為3月15日（溫度為15 ～23 ℃，第1 批）、7月20日（溫度為26 ～33 ℃，第2 批）及8月30日（溫度為25 ～31 ℃，第3 批）。所取水樣經(jīng)實驗室采用藻類分析儀（Algae Lab Analyser bbe）分析后，3 種自然水體內(nèi)藻華種類的占比見表1。

表1 3 種典型自然水體中藻類占比

由于氣候等條件的差別，3 批自然水體中藻類占比數(shù)值也存在差別，但各水體中優(yōu)勢藻種類相同。由表1 可以看出，中心湖水體中優(yōu)勢藻為藍藻，3 次取樣藍藻在總藻中占比分別為58.23%，90.24%及65.22%，平均占比為71.23%；華工湖水體中優(yōu)勢藻為綠藻，3 次取樣中綠藻在總藻中占比分別為98.11%，88.62%及80.31%，平均占比為89.01%；廣工湖水體中藍藻、綠藻含量基本相當，3 次取樣藍藻、綠藻占比均為16% ～20%。3 種水體各具代表性，為研究TBC 對不同自然水體的抑藻效果提供了典型案例。

為觀察水體中的藻細胞種類，將3 種自然水樣分別用蒸餾水稀釋10 倍后，吸取25 μL 滴入藻類計數(shù)框放在顯微鏡下進行鏡檢發(fā)現(xiàn)，水體中藍藻主要包括微囊藻屬、魚腥藻屬、束絲藻屬，綠藻主要包括柵藻屬、小球藻屬和十字藻屬，硅藻主要為直鏈藻屬。經(jīng)對比相關(guān)文獻，該原水特征與我國南方主要淡水水體中藻類種群特征類似[3-4]。

（2）毒理試驗生物

大型溞購自廣州光大藻種，取大型溞第3 ～6天時成溞產(chǎn)的幼體溞作為試驗材料。試驗開始前，在實驗室自然光照與溫度下馴養(yǎng)7 d 以上及自然死亡率小于0.5%時符合試驗要求。飼以斜生柵藻，試驗前1 d 停止喂食，試驗期間也不喂食。

1.3 降解產(chǎn)物檢測方法

采用甲苯為有機萃取劑，將待測樣品用0.45 μm 水系微孔濾膜過濾后，再將20 mL 甲苯分4次萃取20 mL 濾液，最后將萃取液通過0.45 μm有機系微孔濾膜過濾后，采用美國Thermo Fisher公司的超高分辨四極桿組合靜電場軌道阱液質(zhì)聯(lián)用儀進行檢測。檢測條件見表2。

表2 檢測條件

1.4 數(shù)據(jù)分析

（1）LC5024h及LC5048h擬合

采用SPSS 20.0 軟件研究不同水體中TBC 投加量與受試生物累計致死率的關(guān)系，以TBC 的初始投加濃度為協(xié)變量，以24 h 或48 h 內(nèi)受試生物的累計死亡率為響應(yīng)頻率建立probit 回歸模型，即可生成probit 回歸模型下給定時間內(nèi)TBC 對受試生物的毒性回歸方程。根據(jù)方程，當致死率為50%時對應(yīng)的TBC 濃度即為給定時間的半抑制濃度（LC50）。

（2）安全投加濃度（SC）

安全投加濃度(SC)為不影響水體生態(tài)環(huán)境下水體可接受的化學藥劑投加濃度，計算公式為：

式中：LC5024h為24 h半抑制質(zhì)量濃度，mg/L；LC5048h為48 h 半抑制質(zhì)量濃度，mg/L。

（3）細胞活力抑制率（IR）及用效用—安全比（RES）

以藻細胞葉綠素濃度的降低來表示細胞受抑制的程度，抑制率（IR）公式如下：

式中：N0為對照組葉綠素質(zhì)量濃度，μg/L；NS為試驗組藻類葉綠素質(zhì)量濃度，μg/L。

研究人員通過效用—安全比（RES）來衡量抑藻劑的應(yīng)用價值[5]，公式如下：

式中：Ec為TBC 有效 抑藻質(zhì) 量濃度，mg/L；IR48h為48 h 細胞活力抑制率，%。

RES數(shù)值越小，說明抑藻效果與生態(tài)安全性更好。當RES大于1 時，說明抑藻劑的有效抑藻濃度超過對水體的安全投加濃度，不適合被廣泛應(yīng)用；當RES數(shù)值小于1 時，說明抑藻劑的有效抑藻濃度在水體的安全投加濃度范圍內(nèi)，可應(yīng)用于控制水體中的藻類。

2 結(jié)果與討論

2.1 TBC 對3 種典型自然水體的抑藻效果

（1）投加不同濃度TBC 對3 種典型自然水體中藍藻生長的影響

向3 種典型自然水體水樣中投加不同濃度TBC 后發(fā)現(xiàn)，3 批重復(fù)試驗趨勢基本相同，水體中藍藻葉綠素濃度（采用平均值）的變化見圖1。

圖1 投加不同濃度TBC 后藍藻葉綠素濃度變化

由圖1 可以看出，在無藍藻的華工湖原水中，投加不同濃度TBC 后藍藻葉綠素濃度在15 d 的培養(yǎng)期間一直為0。在含有藍藻的中心湖與廣工湖原水中，15 d 后藍藻的葉綠素濃度與TBC 的投加量呈負相關(guān)，說明TBC 對藍藻細胞的生長存在抑制作用，且濃度越高，抑制能力越強。當TBC 的投加質(zhì)量濃度小于0.1 mg/L 時，TBC 對藍藻的抑制能力較弱，中心湖及廣工湖水體中的藍藻葉綠素濃度在15 d 內(nèi)仍處于增加狀態(tài)，當TBC 的投加質(zhì)量濃度大于0.5 mg/L 時，藍藻的葉綠素濃度不斷下降，肉眼可見水體短時間內(nèi)綠色變淺、濁度降低且藻密度在15 d 內(nèi)未出現(xiàn)反彈，說明TBC 抑制能力較強。有研究發(fā)現(xiàn)，許多化感物質(zhì)均存在濃度效應(yīng)，如李楠[6]研究了廣玉蘭、龍爪槐和黃楊浸提液對Microcystis aeruginosa 生長的影響，發(fā)現(xiàn)3 種植物的浸提液對Microcystis aeruginosa 的生長具有明顯的抑制作用，且抑制作用隨濃度的升高而增強。

不同自然水體中的藍藻對TBC 的敏感性不同。在藍藻占比為58.23% ～90.24%的中心湖水體中，當TBC 投加質(zhì)量濃度為0.5 mg/L 時，水體中藍藻受到強烈抑制，10 d 后抑制率達到80%，當TBC 投加質(zhì)量濃度增至1 ～5 mg/L 時，藍藻葉綠素變化情況與0.5 mg/L 時基本相同，說明中心湖中TBC 投加質(zhì)量濃度為0.5 mg/L 時即達到飽和抑制濃度。在藍藻占比為18.31 % ～19.65 %的廣工湖水體中，抑制效果隨TBC 投加濃度的增加不斷增強，當TBC 投加質(zhì)量濃度大于2.0 mg/L 時才基本達到飽和。說明中心湖水體中藍藻比廣工湖水體中藍藻對TBC 更敏感，推測藍藻在水體中占比越高，TBC 的抑制能力越強。

（2）TBC 不同初始投加濃度對3 種典型自然水體中綠藻生長的影響

向3 種典型自然水體水樣中投加不同濃度TBC 后，3 批重復(fù)試驗趨勢基本相同，水體中綠藻葉綠素濃度（采用平均值）的變化見圖2。由圖2可以看出，當不含藍藻的華工湖水體中投加不同濃度TBC 后，水體中綠藻濃度隨時間變化情況與空白組基本相同，均隨時間的增加而上升，綠藻葉綠素質(zhì)量濃度均由400 μg/L 升至約550 μg/L，表明TBC 對綠藻沒有抑制作用。在有藍藻的中心湖及廣工湖水體中，當TBC 投加質(zhì)量濃度小于0.1 mg/L 時，綠藻濃度均逐漸降低并在第4 天趨于0。當TBC 投加質(zhì)量濃度大于0.5 mg/L 時，15 d 后綠藻的葉綠素濃度基本與TBC 投加量呈負相關(guān)。即綠藻的葉綠素濃度隨著TBC 投加濃度的升高反而降低。以上說明TBC 對藻類的抑制具有選擇性，對藍藻有顯著的抑制作用，而對綠藻幾乎沒有抑制作用。有研究發(fā)現(xiàn)，許多化感物質(zhì)均具有選擇性，如李鋒民等[7]對從蘆葦分泌的化感物質(zhì)2-甲基乙酰乙酸乙酯進行研究，發(fā)現(xiàn)其對于銅綠微囊藻和蛋白核小球藻的抑制作用較強，而對小球藻卻幾乎沒有抑制作用。MANDAL S M 等[8]研究表明，沉水植物輪藻對羊角月牙藻和小球藻具有化感抑制作用，而對斜生柵藻的生長幾乎沒有影響?；形镔|(zhì)選擇抑制性與化感物質(zhì)的抑藻機理有關(guān)。TBC 是一種含有含有酚羥基和羧基的典型的酚酸類物質(zhì)，酚羥基及醇羥基可通過氫鍵與藻類酶中的肽基結(jié)合從而使藻類酶的結(jié)構(gòu)功能破壞[9]。由于不同藻類酶的結(jié)構(gòu)不同，化感物質(zhì)對酶的作用效果不同從而使得化感物質(zhì)的抑制效果不同。同時，藍綠藻細胞膜的結(jié)構(gòu)不同也可能是造成這種差異另一的原因，如QIU X 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，酚酸類物質(zhì)可以改變藻細胞膜的通透性使細胞發(fā)生質(zhì)壁分離，從而破壞藻細胞結(jié)構(gòu)導(dǎo)致藻細胞死亡。

圖2 投加不同濃度TBC 后綠藻葉綠素濃度的變化

結(jié)合藍藻試驗數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，TBC 投加質(zhì)量濃度為0 或低于0.1 mg/L 時，中心湖與廣工湖水體中藍藻濃度不斷上升，綠藻濃度不斷下降，藍藻為優(yōu)勢藻。而當TBC 投加質(zhì)量濃度超過0.5 mg/L 時，則抑制了藍藻的生長，從而使綠藻在與藍藻的競爭中取得了優(yōu)勢，綠藻濃度不斷增加。在自然環(huán)境下，化感作用是藻類的一種自我保護機制，可以幫助特定的種群在資源競爭中取得優(yōu)勢。如赤潮異彎藻通過細胞接觸抑制血紅哈卡藻的生長[11]，布氏常絲藻通過釋放次生代謝物抑制銅綠微囊藻生長[12]。擬柱胞藻、銅綠微囊藻可釋放毒素從而抑制其他藻類生長[13]。一般認為，硅藻與綠藻為有益藻類，在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)有重要的應(yīng)用價值，如綠藻屬的蛋白核小球藻、硅藻屬的小環(huán)藻是魚蝦蟹的優(yōu)質(zhì)餌料；卵囊藻、柵藻等復(fù)合綠藻可以降低魚蝦蟹的應(yīng)激，減少發(fā)病率[14]；而藍藻為有害藻，可產(chǎn)生危害人體的肝毒素及神經(jīng)毒素等，并具有致癌效應(yīng)[15]。因TBC 在抑制有害藻藍藻的同時不對其他藻類產(chǎn)生影響，故具有良好的應(yīng)用前景。

2.2 TBC 的毒性研究

（1）TBC 對大型溞的急性毒性研究

將蒸餾水及3 種自然水體中TBC 質(zhì)量濃度分別設(shè)置為0 ，0.5 ，1.0 ，2.0 ，3.0 及5.0 mg/L，3批重復(fù)組中各水體內(nèi)大型溞在96 h 內(nèi)的累計死亡趨勢基本相同，累計致死率變化見圖3。由圖3可以看出，大型溞的死亡率與TBC 濃度及暴露時間呈正相關(guān)，隨著TBC 濃度的增加，相同時間內(nèi)大型溞的死亡率不斷增加，同濃度下暴露時間越長，大型溞的死亡率越高，且TBC 在自然水體中的致死率低于蒸餾水中。TBC 在最佳抑藻質(zhì)量濃度為0.5 mg/L 時，各水體中TBC 致死率均處于較低水平，24 h 后致死率均為0，48 h 后在蒸餾水中致死率為10%，在自然水體中為0，96 h 后，水樣中致死率均為20%。在TBC 最大投加質(zhì)量濃度為5 mg/L 時，24 h 后自然水體中大型溞的致死率均為50%左右，蒸餾水中致死率為70%，48 h 后自然水體中大型溞的致死率均為60% ～65%，蒸餾水中致死率為80%；72 ～96 h 后所有水樣中致死率均達到90%～100%。

圖3 在蒸餾水及3 種自然水體中TBC 對大型溞的致死率影響

將致死率數(shù)據(jù)根據(jù)1.4.1 中的方法，采用SPSS 建立probit 回歸模型，擬合毒性回歸方程，計算半致死濃度（LC50），結(jié)果見表3。

表3 不同水體中TBC 對大型溞的毒性對比

由表3 可以看出，毒性方程擬合程度良好（R2＞0.8）。蒸餾水中24 h 和48 h 的LC50 分別為2.93 和2.50 mg/L，中心湖中分別為3.71 和3.35 mg/L，華工湖中分別為3.43 和2.93 mg/L，廣工湖中分別為3.62和3.10 mg/L，將結(jié)果代入公式計算出蒸餾水、中心湖、華工湖、廣工湖的安全質(zhì)量濃度分別為0.54，0.82，0.68 和0.64 mg/L。發(fā)現(xiàn)所有水體中TBC 對大型溞的SC均大于中心湖水體中TBC 對藍藻的EC（0.5 mg/L），證明TBC 在以藍藻為優(yōu)勢藻的自然水體抑藻過程中對其他水生生物相對安全。

同時看出，TBC 在不同的水體環(huán)境中對大型溞的毒性程度不同。大型溞在不同的自然水體中對TBC 的耐受程度由強到弱為：中心湖＞廣工湖＞華工湖＞蒸餾水。大型溞在自然水體中對TBC的耐受性比在蒸餾水中高，究其原因：①自然水體中的酚類物質(zhì)可被水體中沉積物吸附，這一過程可有效降低酚類在水體中的擴散能力及毒性；②自然水體中的真菌和細菌均有以酚類物質(zhì)為食的物種，從而推動水體中酚類物質(zhì)的降解[16]。

TBC 在中心湖水體中對藍藻的EC為0.5 mg/L，且該濃度下對大型溞的LC5048h為3.35 mg/L，根據(jù)安全效應(yīng)比公式，TBC 對大型溞的RES數(shù)值為0.313 4，小于1，說明TBC 在其起效的藍藻抑制濃度內(nèi)，具有很好的生態(tài)安全性，不會對水生態(tài)環(huán)境造成明顯危害。

（2）TBC 的降解產(chǎn)物研究

TBC 對人體眼睛、皮膚、粘膜和上呼吸道有刺激作用，可引起呼吸道和皮膚的過敏反應(yīng)，除TBC本身外，TBC 在水體中的降解產(chǎn)物也影響水體的生態(tài)安全性。采用甲苯萃取后，通過超高分辨四極桿組合靜電場軌道阱液質(zhì)聯(lián)用儀按照1.3.2 的條件對降解產(chǎn)物進行檢測，結(jié)果顯示，TBC 在蒸餾水中的降解產(chǎn)物包括對叔丁基鄰苯二醌、鄰苯二甲酸酐及鄰苯二甲酸二丁酯和一些開環(huán)化合物如丁烯、異丁烯、叔丁醇、碳酸等。TBC 在自然水體中降解產(chǎn)物除對叔丁基鄰苯二醌未檢出外，其余降解產(chǎn)物與蒸餾水中的降解產(chǎn)物類型相同。

TBC 在水體中的降解過程主要由水體中自由基的作用而產(chǎn)生[17]。結(jié)合文獻對試驗結(jié)果進行研究：測得的降解產(chǎn)物中，TBC 在蒸餾水中生成對叔丁基鄰苯二醌轉(zhuǎn)化途徑較為明確，李早英等[18]研究發(fā)現(xiàn)對叔丁基鄰苯二酚經(jīng)環(huán)境中氧化劑氧化可形成對叔丁基鄰苯二醌。在3 種水體中均檢測到丁烯、異丁烯、碳酸、草酸等開環(huán)化合物，根據(jù)上述理論可推測是由于自然水體中的羥基自由基、超氧陰離子自由基等對TBC 及其他氧化產(chǎn)物的化學鍵發(fā)生作用，使其在水體中的化學結(jié)構(gòu)發(fā)生重整導(dǎo)致苯環(huán)開環(huán)，生成了丁烯、異丁烯、碳酸、草酸等開環(huán)化合物，其中丁烯進行二聚并生成鄰二甲苯[19]，鄰二甲苯被氧化后生成鄰苯二甲酸酐[20]，氧化物繼續(xù)氧化后生成鄰苯二甲酸二丁酯[21]。大部分小分子開環(huán)化合物在自由基的作用下可進一步降解，從而降低TBC 及其降解產(chǎn)物對水體生態(tài)系統(tǒng)的毒性。

3 結(jié)論

（1）在自然水體中，TBC 對藍藻表現(xiàn)出良好的抑制效果，抑制能力隨投加濃度的升高而增強，自然水體中藍藻占比越高,TBC 的抑藻效果越好。在以藍藻為優(yōu)勢藻的中心湖水體中，當TBC 投加質(zhì)量濃度為0.5 mg/L 時達到飽和抑制濃度，在藍、綠藻優(yōu)勢均等的廣工湖水體中，TBC 投加質(zhì)量濃度為2 mg/L 時達到飽和抑制濃度。且抑制效果持續(xù)時間長，在15 d 內(nèi)未反彈。

（2）TBC 對藻類的抑制具有選擇性，對有害藍藻有顯著的抑制作用，而對有益綠藻幾乎沒有抑制作用。在藍綠藻的競爭中，TBC 對有害藍藻的抑制效果可使有益綠藻獲得競爭優(yōu)勢，從而使水體中藻類群落發(fā)生演替。

（3）TBC 在所有水體中對大型溞的安全投加質(zhì)量濃度均大于在中心湖水體中對藍藻的EC（0.5 mg/L），且TBC 在自然水體中對大型溞的生物毒性低于蒸餾水中。RES值為0.31，屬于安全性較好的抑藻材料，可應(yīng)用于處理水體中的藻類爆發(fā)而不會對水域生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生明顯影響。

（4）TBC 在水體中的降解產(chǎn)物主要包括TBC 的氧化產(chǎn)物對叔丁基鄰苯二醌、鄰苯二甲酸酐及其氧化物鄰苯二甲酸二丁酯和和一些開環(huán)化合物如丁烯、異丁烯、叔丁醇、碳酸等，降解產(chǎn)物無明顯生態(tài)安全隱患。