肽配基仿生親和介質(zhì)的制備和抗體純化性能研究

史清洪，賈立霞

（天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300350）

抗體因其高特異性和低免疫原性被廣泛應(yīng)用于癌癥、自身免疫性疾病及類風(fēng)濕性疾病等的治療[1]，市場需求日益擴(kuò)大，這促進(jìn)了抗體分離純化工藝的發(fā)展．金黃色葡萄球菌蛋白A因其對(duì)抗體具有高選擇性和親和力，被廣泛用作抗體親和層析配基[2]，經(jīng)蛋白A親和層析捕獲，一步便可以獲得純度較高的產(chǎn)品，被譽(yù)為抗體分離純化的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”．然而其也存在著價(jià)格昂貴、洗脫條件苛刻、酶穩(wěn)定性差、配基容易脫落和免疫原性高等缺點(diǎn)[3]．以分子模擬等技術(shù)獲得的仿生多肽不僅具有與蛋白A配基相似的親和力和選擇性，還能克服蛋白A配基存在的問題[4-5]，可用作蛋白A的替代配基進(jìn)行抗體的純化，并且已經(jīng)投放于市場[6]．然而天然氨基酸組成的線性多肽容易被生物體內(nèi)的酶降解[7]，可通過引入非天然氨基酸提高配基對(duì)蛋白水解酶的抗性[8-9]，將多肽中的氨基酸替換為其對(duì)映體形式，以便進(jìn)一步提高多肽親和介質(zhì)的使用壽命．

本文以實(shí)驗(yàn)室篩選的仿生多肽FYWHCLDE[10-12]的對(duì)映體形式為親和配基，將其偶聯(lián)于2，2’-二硫二吡啶修飾的Sepharose 6FF上，用?KTA purifier蛋白純化系統(tǒng)和高效液相色譜考察了親和介質(zhì)對(duì)實(shí)際體系的分離效果及其穩(wěn)定性，為制備高穩(wěn)定性多肽親和介質(zhì)提供借鑒．

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與試劑

L/D-FYWHCLDE多肽，純度95%，吉爾生化(上海)有限公司；Sepharose 6FF和細(xì)胞培養(yǎng)上清液，GE Healthcare；人血清，美國Sigma-Aldrich公司；其余試劑來源均為天津產(chǎn)分析純．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多肽酶穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

選取可以降解芳香族氨基酸形成的肽鍵的α-糜蛋白酶，考察L型和D型多肽配基的酶穩(wěn)定性．將多肽溶于適量的二甲基亞砜(DMSO)中，超聲15 s，然后用平衡緩沖液(20 mmol/L pH＝6.0的磷酸緩沖液)進(jìn)行稀釋，配制成1 mg/mL的多肽溶液，取1 mL多肽液，加入20 μL 1 mg/mL的α-糜蛋白酶(多肽和酶質(zhì)量比為50∶1)，混合均勻后置于37℃空氣搖床中振蕩反應(yīng)，用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)測定反應(yīng)0.5、1、2、4、6與8 h后多肽的剩余含量[13]，分析多肽耐蛋白酶水解的能力．

1.2.2 仿生多肽親和介質(zhì)的制備

(1) 功能基團(tuán)的引入[14]．多肽親和介質(zhì)制備流程如圖1所示．稱取4 g經(jīng)去離子水清洗并抽干后的介質(zhì)，用20%、50%和70%的DMSO水溶液分別浸泡5 min后抽干，加入18 mL DMSO、12 mL ECH，0.6 g NaOH顆粒，50℃反應(yīng)4 h，反應(yīng)結(jié)束后用去離子水充分洗滌；取適量抽干的環(huán)氧活化的介質(zhì)于25 mL錐形瓶中，向其中加入6 mL PB(0.5 mol/L， pH＝6.3)緩沖液，再加入2 mol/L 的硫代硫酸鈉溶液3 mL，25℃振蕩反應(yīng)6 h．反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水洗凈介質(zhì)，抽干后轉(zhuǎn)移至離心管中，加入0.2 mol/L NaHCO3溶液3 mL，混合均勻后再向其中加入含有 0.5 g二硫蘇糖醇的1 mmol/L EDTA二鈉溶液3 mL，繼續(xù)反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后用0.2 mol/L NaHCO3溶液和1 mmol/L EDTA 溶液依次進(jìn)行清洗；按體積比3∶2的比例將含有1 mmol/L EDTA二鈉的丙酮溶液和50 mmol/L NaHCO3溶液混合均勻，并用該混合緩沖液充分清洗巰基化后的介質(zhì)，抽干后稱取3 g于25 mL離心管中，加入5 mL上述混合緩沖溶液，再向其中加入0.3 mol/L 2，2’-二硫二吡啶溶液10 mL，振蕩混合均勻．繼續(xù)反應(yīng)1 h，反應(yīng)結(jié)束后用丙酮-水(體積比3∶2)混合溶液和1 mmol/L EDTA二鈉溶液依次進(jìn)行充分的清洗．

圖1 多肽親和介質(zhì)制備流程Fig.1 Preparation scheme of peptide affinity chromatography

(2) 多肽配基偶聯(lián)．用去離子水、0.1 mol/L Tris-HCl(pH＝7.5，0.5 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA二鈉)交聯(lián)緩沖液依次清洗上述介質(zhì)，抽干后稱取1 g介質(zhì)于錐形瓶中，向其中加入交聯(lián)緩沖液6 mL，再加入適量的用交聯(lián)緩沖液稀釋的1 mg/mL的多肽液，25℃反應(yīng) 1.5 h．最后，為了避免介質(zhì)尚未反應(yīng)的活性基團(tuán)影響后續(xù)的分離，向錐形瓶中加入適量的半胱氨酸繼續(xù)反應(yīng) 0.5 h進(jìn)行封閉．用反相色譜法(RP-HPLC)測定反應(yīng)前后溶液中多肽的含量，計(jì)算得到多肽親和介質(zhì)的配基密度．

1.2.3 多肽親和介質(zhì)性能評(píng)價(jià)

靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)：將多肽親和介質(zhì)用不同pH值的濃度為20 mmol/L的緩沖液(pH＝4.0和pH＝5.0為檸檬酸鈉緩沖液，pH＝6.0和pH＝7.0為磷酸緩沖液)進(jìn)行活化后抽干，稱取若干份10 mg介質(zhì)于2 mL離心管中，加入1 mL不同濃度的蛋白溶液，反應(yīng)6 h后測定上清液在280 nm處的吸光值，并利用Langmuir方程進(jìn)行擬合，即

式中：qm為蛋白質(zhì)飽和吸附容量，mg/mL；Kd為解離常數(shù)，mg/mL；q和c分別為達(dá)到吸附平衡時(shí)蛋白質(zhì)在固相和液相上的濃度，mg/mL．

動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)：將多肽親和介質(zhì)填裝于1 mL TricornTM5/50層析柱中，用pH＝6.0的磷酸緩沖液為上樣緩沖液，平衡緩沖液中添加0.5 mol/L NaCl為洗脫緩沖液[15-16]，用濃度為1 mg/mL的抗體溶液以0.1 mL/min的流速上樣至流出口濃度為原料液的10%，根據(jù)下式計(jì)算得到多肽親和介質(zhì)的動(dòng)態(tài)吸附容量(DBC)．

式中：cp為hIgG的初始濃度，mg/mL；Vp為出口處蛋白濃度達(dá)到初始濃度的10%時(shí)消耗的hIgG溶液體積，mL；Vb為層析柱床層體積，mL；Vh為系統(tǒng)死體積，mL．

穩(wěn)定性評(píng)價(jià)：將多肽親和介質(zhì)填裝于Ominifit 006BCC-03-05FF層析柱中，用濃度為1 mg/mL的抗體溶液以0.2 mL/min的流速上樣，然后用0.1 mol/L NaOH溶液以0.5 mL/min進(jìn)行原位清洗，每原位清洗2 h進(jìn)行一次上樣，如此循環(huán)，測定經(jīng)過12 h后親和介質(zhì)吸附抗體的DBC變化．

1.2.4 多肽親和介質(zhì)對(duì)實(shí)際體系的分離效果

將親和介質(zhì)填裝于1 mL TricornTM5/50層析柱中，以人血清和細(xì)胞培養(yǎng)上清液為原料，測定介質(zhì)的分離效果，具體步驟如下．

(1) 原料預(yù)處理：取2 mL原料液加入適量的平衡緩沖液混合均勻，過膜后加入到超濾管中離心，用平衡緩沖液補(bǔ)滿超濾管后再次離心，經(jīng)過多次上述過程，將料液中的緩沖液替換為抗體容易吸附的結(jié)合緩沖液．

(2) 利用?KTA purifier蛋白純化層析儀，以0.2 mL/min的流速上樣2 mL．收集穿透峰、洗脫峰和再生峰，用TSKG3000層析柱進(jìn)行測定，并根據(jù)下式計(jì)算得到抗體的純度(P)和回收率(R)．

式中：S1為洗脫液中抗體的峰面積；S為洗脫液中所有蛋白的峰面積之和；S0為料液中抗體的峰面積；V與V1分別為進(jìn)樣體積和洗脫液體積，mL．

1.2.5 多肽親和介質(zhì)的可重復(fù)利用性評(píng)價(jià)

考慮到實(shí)際的分離體系中組分復(fù)雜，影響因素更多，將多肽親和介質(zhì)填裝于Ominifit 006BCC-03-05FF層析柱中，以人血清為分離體系，測定了多肽親和介質(zhì)經(jīng)過40次循環(huán)后的DBC值變化．具體步驟為：以0.2 mL/min的流速上樣8 mL，再以0.5 mL/min的流速洗脫8 mL和再生8 mL，然后再次用5 mL的平衡緩沖液沖洗至基線平穩(wěn)，將上述流程定義為一個(gè)循環(huán)．首先，用配制的1 mg/mL的抗體溶液測定第1次的DBC值，然后用稀釋的血清進(jìn)行5次上述循環(huán)后，再次用配制的抗體溶液測定多肽親和介質(zhì)吸附 抗體的DBC值，如此測定了經(jīng)過40次循環(huán)后的DBC值．

2 結(jié)果與討論

2.1 多肽耐酶穩(wěn)定性

為了評(píng)估L型和D型多肽配基的酶穩(wěn)定性，本文選取了對(duì)含有芳香族氨基酸的蛋白有較強(qiáng)降解能力的α-糜蛋白酶來降解兩種親和配基，其結(jié)果如圖2所示．從圖中可以看出：隨著孵育時(shí)間的延長，L型多肽配基迅速被酶水解，當(dāng)孵育時(shí)間達(dá)到8 h時(shí)，溶液中剩余的完整的L型多肽配基的含量不足50%，而D型多肽配基被降解的速率相對(duì)較慢，當(dāng)時(shí)間達(dá)到8 h時(shí)，僅不到10%的D型多肽配基被酶降解．Verdoliva等[17]合成了L型和D型四聚三肽配基PAM，在3 h內(nèi)，D-PAM降解了3%左右，而L-PAM幾乎完全被降解．本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相似，說明D型多肽配基對(duì)酶降解的穩(wěn)定性更好，更利于提高層析的使用壽命．

圖2 多肽配基耐α-糜蛋白酶穩(wěn)定性Fig.2 Resistance of peptide affinity ligands to αchymotrypsin

2.2 多肽親和介質(zhì)性能評(píng)價(jià)

制備價(jià)格低廉、選擇性好又穩(wěn)定性高的親和介質(zhì)是突破抗體純化效率低下瓶頸的關(guān)鍵．吸附等溫線是表征親和介質(zhì)對(duì)目的蛋白吸附能力的重要參數(shù)．本文合成了配基修飾密度為31 μmol/mL的兩種多肽親和介質(zhì)，并測定了不同pH值緩沖液中hIgG于兩種多肽親和介質(zhì)上的吸附等溫線，結(jié)果如圖3所示．從圖中可以看出，隨著pH值升高，多肽親和介質(zhì)的抗體吸附量增加并在pH＝6.0下達(dá)到最大值；隨著pH值進(jìn)一步升高，抗體吸附量降低．這一趨勢同樣反映在表1中抗體吸附的qm值上．其中，抗體在D型多肽親和介質(zhì)上具有更高的吸附量qm，在pH＝6.0時(shí)吸附容量達(dá)到129.8 mg/mL．該結(jié)果與文獻(xiàn)[10]報(bào)道的結(jié)果相近，同時(shí)其明顯高于商品化蛋白A色譜介質(zhì)和其他多肽親和介質(zhì)的抗體吸附容量[17-19]．表1的結(jié)果進(jìn)一步顯示，D型多肽親和介質(zhì)上抗體的解離常數(shù)更大，反映出抗體與D型多肽親和介質(zhì)的親和性下降．此外，測定了牛血清白蛋白(BSA)在pH＝6.0條件下于多肽親和介質(zhì)上的吸附等溫線，發(fā)現(xiàn)BSA幾乎不吸附(數(shù)據(jù)未顯示)．

表1 不同pH值下多肽親和介質(zhì)上抗體吸附的Langmuir參數(shù)Tab.1 Langmuir parameters of antibody adsorption on peptide affinity chromatography at different pH values mg/mL

圖3 不同pH值下hIgG在多肽親和介質(zhì)上的吸附等溫線Fig.3 Adsorption isotherms of hIgG on peptide affinity chromatography at different pH values

進(jìn)一步探究了抗體在pH＝6.0條件下于兩種多肽親和介質(zhì)上的色譜穿透行為，結(jié)果如表2所示．在0.1 mL/min流速(84 cm/h)下，L型與D型多肽親和介質(zhì)吸附抗體的DBC值分別達(dá)到了28.5 mg/mL和36.1 mg/mL．雖然抗體的DBC值隨著流動(dòng)相流速升高而逐漸降低，但即便在常規(guī)色譜操作流速(0.3～0.5 mg/mL)下D型多肽親和介質(zhì)仍展現(xiàn)出與商品化蛋白A色譜介質(zhì)接近的動(dòng)態(tài)吸附容量[20]．此外，在相同流速下D型較L型親和介質(zhì)具有更高的抗體DBC值，進(jìn)一步反映出D型親和介質(zhì)在抗體純化中的優(yōu)勢及商業(yè)化應(yīng)用潛力．

表2 不同流速下抗體在多肽親和介質(zhì)上的DBCTab.2 Dynamic binding capacities of antibody in peptide affinity chromatograp hy at different flow rates

2.3 實(shí)際體系分離效果

為了進(jìn)一步驗(yàn)證仿生多肽親和介質(zhì)的分離效果，本文進(jìn)行了從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中純化單克隆抗體(mAb)和從人血清中純化hIgG的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示．原料的SEC-HPLC和SDS-PAGE結(jié)果反映出來源不同的人血清和細(xì)胞上清液存在著巨大的成分差異．在色譜分離的過程中，無論是人血清還是細(xì)胞上清液穿透樣品的電泳條帶中均未發(fā)現(xiàn)抗體成分，說明D型多肽親和介質(zhì)具有良好的抗體吸附能力以及選擇性．基于圖4的SEC-HPLC結(jié)果計(jì)算可得，mAb的純度大于98%，回收率為94.97%，這與圖4(d)電泳結(jié)果相吻合，純化效果與文獻(xiàn)報(bào)道的仿生多肽配基HWRGWV[18](P＞94%，R＞84%)和YFKFD[21](P＞93%，R＞86%)相當(dāng)，也與蛋白A色譜純化抗體的結(jié)果基本相當(dāng)[22]．從人血清中純化hIgG的實(shí)驗(yàn)中， hIgG的純度為91.37%，回收率為85%左右，這與圖4(c)電泳結(jié)果中洗脫條帶存在痕量雜質(zhì)的情況一致．分離效果與配基FYE-ABI[23](P＞93.9%，R＞88.9%)相當(dāng)，顯著優(yōu)于Reese等[24]利用Protein A和Protein G色譜介質(zhì)從人血清中分離抗體的收率(68.1%和40.6%)及其他課題組的相關(guān)報(bào)道結(jié)果[25]. 說明該配基具有從復(fù)雜的生物樣品中分離hIgG的潛力．比較兩種體系的分離效果，不難發(fā)現(xiàn)，從血清中純化hIgG的純度和回收率都低于從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中純化的mAb的純度和收率，從SEC-HPLC中可以進(jìn)行這樣的推測，在11.2 min之前出現(xiàn)的幾個(gè)較低的峰可能是抗體的其他亞型，而該多肽親和配基對(duì)抗體的多種亞型都具有親和力，不能在該洗脫條件下實(shí)現(xiàn)各個(gè)抗體亞型之間的分離，這種現(xiàn)象在其他短肽和蛋白A的親和純化中也都存在．Liu等[26]制備了3種短肽(HWRGWV、HYFKFD和HFRRHL)親和介質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其與hIgM、hIgA和hIgG都可以結(jié)合，并且通過改變洗脫緩沖液的pH值，實(shí)現(xiàn)了hIgG與其他兩種抗體的分離．Reese等[24]利用蛋白A親和介質(zhì)完成了IgG和IgM的純化，說明其對(duì)抗體的多種亞型都具有親和力.

圖4 D型多肽親和介質(zhì)從人血清和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離抗體的SEC-HPLC和SDS-PAGE結(jié)果Fig.4 SEC-HPLC and SDS-PAGE results of the isolation of antibodies from human serum and cell culture supernatant with D-type peptide affinity chromatography

2.4 重復(fù)利用性

通過將兩種多肽配基與α-糜蛋白酶共同孵育，證明了D型多肽配基較L型多肽配基具有更高的酶穩(wěn)定性，但此實(shí)驗(yàn)中影響親和配基穩(wěn)定性的因素比較單一，在實(shí)際的分離體系中，體系組分復(fù)雜，可能產(chǎn)生影響的因素也比較多．因此，本節(jié)以人血清為原液，模擬真實(shí)體系中的分離純化步驟，測定了經(jīng)過40次循環(huán)后，多肽親和介質(zhì)吸附抗體的DBC值變化，更真實(shí)地評(píng)價(jià)了親和介質(zhì)的可重復(fù)利用性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示．從圖中可以觀察到，經(jīng)過40次循環(huán)后，兩種親和介質(zhì)的DBC都有不同程度的降低，橫向比較L型和D型多肽親和介質(zhì)吸附性能的變化，在經(jīng)歷 了40次循環(huán)后L型多肽親和介質(zhì)的DBC下降了14.51%，而D型多肽親和介質(zhì)的DBC僅下降了5.92%，這與此前D型多肽配基具有更好的酶降解耐受性的結(jié)論一致，說明D型多肽親和介質(zhì)比L型多肽親和介質(zhì)更加穩(wěn)定，在使用壽命內(nèi)的價(jià)值更高．

圖5 40次循環(huán)穿透實(shí)驗(yàn)后多肽親和介質(zhì)的DBC變化Fig.5 Changes in the DBC of the peptide affinity chromatography over 40 cycles of breakthrough experiments

在室溫環(huán)境下，通過用0.1 mol/L的NaOH溶液對(duì)兩種多肽親和介質(zhì)進(jìn)行了12 h的原位清洗，每隔2 h測定一次介質(zhì)吸附抗體的DBC值，根據(jù)DBC的變化確定其堿穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示．不難發(fā)現(xiàn)，隨著原位清洗時(shí)間的增長，兩種介質(zhì)吸附抗體的DBC值都呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢，經(jīng)過了12 h后，DBC值降低的比率均保持在一個(gè)較低的范圍(＜8%)．此前Linhult等[27]報(bào)道了蛋白A介質(zhì)在0.1 mol/L NaOH溶液中浸泡7.5 h導(dǎo)致其DBC值下降超過70%．葛佳等[28]以FYEILHC為親和配基，采用0.1 mol/L NaOH為再生溶液，經(jīng)過40個(gè)循環(huán)后，吸附容量未見明顯變化，說明短肽類配基確實(shí)具有較好的堿穩(wěn)定性．橫向?qū)Ρ葍煞N多肽親和介質(zhì)，L型多肽親和介質(zhì)的DBC值下降速率略高于D型多肽親和介質(zhì)，說明D型多肽親和介質(zhì)對(duì)堿的耐性更加 穩(wěn)定.

圖6 0.1 mol/L NaOH溶液原位清洗時(shí)間對(duì)多肽親和介質(zhì)吸附能力的影響Fig.6 Effect of in situ cleaning time of 0.1 mol/L NaOH solution on the adsorption capacity of peptide affinity chromatography

3 結(jié)論

以對(duì)映體天然氨基酸組成的短肽FYWHCLDE為配基，Sepharose 6FF為基質(zhì)，制備了用于抗體分離純化的多肽親和介質(zhì)，并對(duì)多肽配基的酶穩(wěn)定性、多肽親和介質(zhì)的堿穩(wěn)定性和對(duì)實(shí)際體系的分離效果進(jìn)行了測定，得到了如下結(jié)論．

(1) 與α-糜蛋白酶共同孵育8 h后，L型多肽配基被降解了54.72%，而D型多肽配基僅被降解了8.5%，顯示出了較高的酶穩(wěn)定性．

(2) 從人血清中純化抗體獲得了91.37% 的純度和85% 的回收率，從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中純化mAb獲得了98% 的純度和94.97% 的回收率，說明短肽親和介質(zhì)具有從復(fù)雜的體系中分離抗體的能力，但不具備分離不同亞型抗體的能力．

(3) 制備的親和介質(zhì)經(jīng)0.1 mol/L NaOH原位再生12 h后，吸附抗體的DBC值降低了不到8%，以人血清為原料，經(jīng)過40次循環(huán)后，吸附抗體的DBC值降低了5.92%，說明D型多肽親和介質(zhì)具有良好的堿穩(wěn)定性和可重復(fù)利用性．