天然植物當(dāng)歸中藁本內(nèi)酯含量測定方法的建立

仝文科， 杜紅娜★，朱明月 ，聶曉博 ，張延華 ，崔克爭，孔素葉

（1.中農(nóng)翎翔河北生物科技有限公司，河北行唐 050699；2.石家莊醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河北靈壽 050200；3.行唐縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河北行唐 050699；4.行唐縣畜牧局動物疫病預(yù)防控制中心，河北行唐 050699）

當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis（Oliv.）Diels 的干燥根， 作為117 種藥食同源的可飼用天然植物被列入《飼料原料目錄》。 當(dāng)歸是補(bǔ)血圣藥，素有“十方九歸”之稱。 隨著畜牧業(yè)快速發(fā)展，具有綠色、安全、環(huán)保優(yōu)勢的天然植物被廣泛應(yīng)用于臨床， 天然植物的應(yīng)用必將引領(lǐng)我國畜牧業(yè)向綠色生態(tài)方向發(fā)展。 目前，關(guān)于天然植物的研究也越來越多， 現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸對畜禽機(jī)體血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等均具有顯著的藥理作用。 現(xiàn)代研究表明，當(dāng)歸傳統(tǒng)功效的物質(zhì)基礎(chǔ)主要是揮發(fā)性成分、有機(jī)酸類、多糖類等，當(dāng)歸中揮發(fā)油主要成分為藁本內(nèi)酯、正丁烯基內(nèi)酯、當(dāng)歸酮、香荊芥酚等[1，2]。 目前，藥典“當(dāng)歸”飲片項(xiàng)下只有阿魏酸含量測定方法，沒有對藁本內(nèi)酯進(jìn)行含量規(guī)定。 因此，為了控制天然植物當(dāng)歸中藁本內(nèi)酯的含量，因此，本研究擬建立一種準(zhǔn)確可靠的當(dāng)歸中藁本內(nèi)酯含量測定方法， 為當(dāng)歸飲片中藁本內(nèi)酯的含量測定提供可借鑒的方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters e2695-2998 （美國） 高效液相色譜儀。

Symmetry C18（5 微米，250 毫米×4.6 毫米）色譜柱；e2695 泵，Empower3 數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)；2998 PDA 檢測器。

1.2 藥物與試劑

藁本內(nèi)酯對照品 （上海純優(yōu)生物科技有限公司，供含量測定用，含量以98%計(jì)）。 甲醇：色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.3 藥材

當(dāng)歸藥材購于安國藥材市場， 經(jīng)本公司質(zhì)控部鑒定符合《中華人民共和國獸藥典》2020 版（Ⅱ部）項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定[1]。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Sy 毫米etry C18 （5 微米，250 毫米×4.6 毫米），C18 預(yù)柱。 流動相：甲醇-0.5%醋酸（65：35）。流速：1.0 毫升/分鐘。柱溫：30℃。 檢測波長：324 納米。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取藁本內(nèi)酯約10 毫克， 置10 毫升量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液 （藁本內(nèi)酯對照品貯備液的濃度為1.12 毫克/毫升）。 色譜圖見圖1。

圖1 藁本內(nèi)酯對照品高效液相色譜圖

2.3 線性范圍的考察

分別精密量取藁本內(nèi)酯對照品貯備液（1.12毫克/毫升）0.5 毫升， 三份， 分別置25 毫升、50毫升、100 毫升量瓶中； 分別精密量取藁本內(nèi)酯對照品貯備液1.0 毫升，三份，分別置5 毫升、10毫升、25 毫升量瓶中；精密量取藁本內(nèi)酯對照品貯備液2 毫升置5 毫升量瓶中，上述樣品，均加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。各進(jìn)樣10 微升，記錄色譜圖，分別測定峰面積值，結(jié)果見表1。 并以峰面積值（y）對樣品濃度（x）進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：

表1 藁本內(nèi)酯對照品峰面積測定結(jié)果

y =15668678.93 x-1373.53，r = 1.0000

以峰面積值（y）-樣品濃度（x）作圖，得一直線（見圖2）。 試驗(yàn)結(jié)果表明：在0.006～0.480 毫克/毫升范圍內(nèi)， 藁本內(nèi)酯的峰面積值與樣品濃度有良好的線性關(guān)系（見表1）。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.4 供試品溶液的制備

2.4.1 提取方式考察

超聲提取法： 取本品粉末 （過三號篩）0.5克，精密稱定，置100 毫升具塞錐形瓶中，加甲醇50 毫升，超聲提取40 分鐘，過濾，濾液用甲醇定容至100 毫升量瓶，即得；

回流提取法： 取本品粉末 （過三號篩）0.5克，精密稱定，置100 毫升具塞錐形瓶中，加甲醇50 毫升，加熱回流提取1 小時，過濾，濾液用甲醇定容至100 毫升量瓶，即得；

索氏提取法： 取本品粉末 （過三號篩）0.5克，精密稱定，置100 毫升具塞錐形瓶中，加甲醇適量，索提4 小時后，放冷，定容至100 毫升量瓶，即得。

將定容后三份樣品搖勻，濾過，取續(xù)濾液進(jìn)樣，分別測定含量，結(jié)果見表2。

表2 不同提取方法的比較（n=2）

結(jié)果表明， 索氏提取法藁本內(nèi)酯含量相對較高，但是三種方法差異較小，因超聲提取方法簡捷易行，故確定提取方式為超聲提取法。

2.4.2 提取溶媒考察

取本品粉末（過三號篩）0.5 克，精密稱定，置100 毫升具塞錐形瓶中，分別加入不同的提取溶媒50 毫升，稱定重量，超聲提取40 分鐘，提取液放冷后稱定重量， 用提取溶媒補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液進(jìn)樣，分別測定含量，結(jié)果見表3。

表3 不同溶媒提取的比較（n=2）

以上結(jié)果表明， 甲醇所測定的藁本內(nèi)酯含量大，故確定選擇甲醇作為最佳提取溶媒。

2.4.3 提取溶媒用量考察

取本品粉末（過三號篩）0.5 克，精密稱定，置100 毫升具塞錐形瓶中，分別加入不同量的甲醇，稱定重量，超聲提取40 分鐘，提取液放冷后稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液進(jìn)樣，分別測定含量，結(jié)果見表4。

表4 不同溶媒用量提取的比較（n=2）

為保證提取完全，選取50 毫升作為最佳提取溶媒用量。

2.4.4 提取時間考察

取本品粉末（過三號篩）0.5 克，精密稱定，置100 毫升具塞錐形瓶中，加甲醇50 毫升，稱定重量，分別超聲處理不同時間，放冷后用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液進(jìn)樣，分別測定含量，結(jié)果見表5。

表5 不同超聲處理時間的比較（n=2）

以上結(jié)果表明，超聲處理40～60 分鐘，可提取完全，為節(jié)省時間成本，確定最佳超聲處理時間為40 分鐘。

2.4.5 供試品溶液色譜圖

取本品粉末（過三號篩）0.5 克，精密稱定，置100 毫升具塞錐形瓶中，加甲醇50 毫升，稱定重量，超聲處理40 分鐘，放冷后用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液進(jìn)樣，色譜圖見圖3。

圖3 當(dāng)歸供試品溶液高效液相色譜圖

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 重復(fù)性考察

按取樣量0.8∶1.0∶1.2 的比例分別稱取樣品，各平行三份，稱定，按已確定的方法制備供試品溶液，測定峰面積值并計(jì)算藁本內(nèi)酯含量。 試驗(yàn)結(jié)果表明， 藁本內(nèi)酯平均含量為8.00 毫克/克，RSD 值 為 1.24% ，RSD ＜2%，該方法重復(fù)性良好。

2.5.2 精密度考察

取對照品溶液及重復(fù)性考察項(xiàng)下的供試品溶液各10 微升， 重復(fù)進(jìn)樣6 次，試驗(yàn)結(jié)果表明，對照品和供試品溶液藁本內(nèi)酯面積值的RSD 值分別為0.24%和0.29%，RSD＜2%，該方法精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性考察

按已確定的方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24、36 及48小時，分別進(jìn)樣10 微升， 試驗(yàn)結(jié)果表明，樣品中藁本內(nèi)酯峰面積值的RSD值 為 0.31% ，RSD＜2%，供試品溶液在48 小時內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 回收率考察

設(shè)計(jì)三個不同濃度的對照品溶液，取已知含量的樣品約0.25 克，分別精密加入高、中、低三個濃度的藁本內(nèi)酯對照品溶液50 毫升， 每個濃度分別制備3 份供試品溶液進(jìn)行測定，按確定的供試品溶液和色譜條件，分別制備加樣回收供試品溶液并注入高效液相色譜儀，以下列公式計(jì)算回收率，結(jié)果見表6。

表6 回收率考察結(jié)果（n=3）

試驗(yàn)結(jié)果表明： 藁本內(nèi)酯回收率在98%～102%，平均回收率為99.98%，RSD 值為1.35%，RSD＜2%，加樣回收良好。

3 討論

藁本內(nèi)酯為當(dāng)歸揮發(fā)油的主要活性成分，故選擇藁本內(nèi)酯作為控制當(dāng)歸質(zhì)量的指標(biāo)性成分，本研究參照有關(guān)文獻(xiàn)[3-7]，建立高效液相色譜法測定當(dāng)歸中藁本內(nèi)酯含量。 在研究過程中，對供試品溶液制備方法進(jìn)行考察，對提取方式（超聲提取法、回流提取法、索氏提取法）、提取溶媒（水、50%甲醇、70%甲醇、甲醇、95%乙醇）、提取溶媒用量（20 毫升、50 毫升、100 毫升）和提取時間（20 分鐘、30 分鐘、40 分鐘、50 分鐘、60 分鐘）進(jìn)行考察， 在保證藁本內(nèi)酯提取完全的情況下，綜合考慮成本， 確定最佳提取方式為超聲提取，提取溶媒為甲醇，溶媒用量為50 毫升，提取時間40 分鐘。

南海軍等[8]采用氣相色譜測定了不同產(chǎn)地當(dāng)歸藥材中藁本內(nèi)酯的含量，結(jié)果顯示甘肅產(chǎn)當(dāng)歸中藁本內(nèi)酯的含量較高。 本研究，對當(dāng)歸道地藥材種植區(qū)域（甘肅岷縣、甘肅漳縣）進(jìn)行樣品采集，包括新鮮樣品及陳當(dāng)歸樣品的采集，含量測定結(jié)果顯示，道地藥材中藁本內(nèi)酯含量在13～22毫克/克， 新鮮當(dāng)歸藥材中藁本內(nèi)酯的含量要高于陳當(dāng)歸藥材中的含量，而且藁本內(nèi)酯的含量隨著時間有所下降。

經(jīng)多次試驗(yàn)驗(yàn)證， 高效液相色譜測定當(dāng)歸中藁本內(nèi)酯含量的方法，分離效果好、靈敏度高、重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，適用于天然植物當(dāng)歸中藁本內(nèi)酯含量的測定。該方法可為藥典“當(dāng)歸”飲片項(xiàng)下藁本內(nèi)酯質(zhì)量控制提供參考，以便更好地控制當(dāng)歸飲片質(zhì)量，為畜禽產(chǎn)品提供更好的質(zhì)量保障，為畜牧行業(yè)保駕護(hù)航。

（基金項(xiàng)目：石家莊市技術(shù)創(chuàng)新中心項(xiàng)目（中心名稱： 石家莊市天然植物飼料添加劑技術(shù)創(chuàng)新中心）