不同種質(zhì)茶葉籽皂素含量及組成分析

陳宇宏，高穎，韓震，尹軍峰

不同種質(zhì)茶葉籽皂素含量及組成分析

陳宇宏1,2，高穎1*，韓震3，尹軍峰1*

1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081；3. 寧波市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，浙江 寧波 315012

茶皂素是一類在山茶科植物種子中含量豐富且具有特異生物活性的化合物，但不同種質(zhì)茶葉籽中皂素含量及組成尚不清晰。以浙江省同一地區(qū)采集的21個(gè)茶樹品種（系）的茶葉籽為試驗(yàn)材料，對(duì)茶葉籽的基本特征、皂素含量及組成進(jìn)行測(cè)定和分析。結(jié)果表明，不同品種（系）的茶葉籽的百粒質(zhì)量、殼仁比、皂素含量均有顯著性差異（<0.05）。紫外分光光度法和高效液相色譜法（HPLC）測(cè)得21個(gè)茶樹品種（系）的茶葉籽的皂素含量范圍分別為30.82%～48.16%和16.93%～31.82%，其中黃觀音的茶葉籽皂素含量最高。利用高效液相色譜-四極桿-靜電軌道阱質(zhì)譜（UHPLC-Q-Exactive/MS）同時(shí)檢測(cè)出68種茶葉籽皂素單體，其中Theasaponin E1的峰相對(duì)強(qiáng)度最大。正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）顯示，21個(gè)品種（系）的茶葉籽以樹型為依據(jù)被明顯地劃分為2組，組間差異單體物質(zhì)有21種。結(jié)合相關(guān)性分析，高積累的Theasaponin E12、Camelliasaponin B1/B2、Theasaponin A5/A6、Camelliasaponin C1/C2和Assamsaponin G可能是灌木型種質(zhì)資源有別于小喬木型、喬木型種質(zhì)資源的重要特征物質(zhì)。研究結(jié)果為生產(chǎn)茶葉籽皂素原料的選擇和高值化利用奠定了基礎(chǔ)。

茶葉籽；皂素；單體；超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜

我國(guó)茶園面積2021年達(dá)326.5萬hm2，茶葉籽資源非常豐富。長(zhǎng)期以來，由于對(duì)不同遺傳背景下茶葉籽中皂素的種類及組成認(rèn)識(shí)不足等原因，導(dǎo)致茶葉籽這一茶葉生產(chǎn)副產(chǎn)品未得到合理的綜合利用，造成了資源浪費(fèi)和利益損失。茶皂素是茶葉籽中含量較高的化合物，占山茶科種子干重的10%～16%[1]。茶皂素具有優(yōu)良的表面活性，可廣泛應(yīng)用于日化、洗護(hù)和建材等行業(yè)；還具有抗?jié)B消炎、抑菌抗病毒、降血壓血脂、保護(hù)腸胃等生理功能[2-7]，在醫(yī)藥和化妝品行業(yè)應(yīng)用潛力巨大[8]。

茶皂素的基本結(jié)構(gòu)由皂苷元、糖體和有機(jī)酸3部分組成。皂苷元以齊墩果烷為骨架，有7種類型，均屬于-香樹素（-amyrin）衍生物；糖體主要有葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖，常與皂苷元C3位上的羥基以糖苷鍵形式相連；有機(jī)酸主要有當(dāng)歸酸、醋酸、惕格酸和肉桂酸，常與皂苷元C16、C21、C22、C28位上的羥基以酯鍵形式相連。依據(jù)糖體和有機(jī)酸不同以及皂苷元的結(jié)合位點(diǎn)不同，現(xiàn)已在山茶屬植物種子中分離鑒定出77種茶皂素[9]。

近年來，隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，Wu等[10]通過超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF/MS/MS）對(duì)福鼎大白茶茶葉籽中的51種皂素進(jìn)行了定性定量分析；Chen等[11]研究發(fā)現(xiàn)，新鮮成熟種子中的皂素含量最高達(dá)到19%，并隨著種子成熟度上升而下降；且不同結(jié)構(gòu)的皂素具有不同的生物活性。然而，不同茶樹種質(zhì)間的茶葉籽皂素含量及單體組成的差異尚不清楚。

為了解不同種質(zhì)茶葉籽間皂素的含量及組成差異情況，提高茶葉籽的利用率和附加值，本研究利用超高效液相色譜-四極桿-靜電軌道阱質(zhì)譜（Ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole orbitrap mass spectrometry，UHPLC-Q-Exactive/MS）等分析檢測(cè)手段，對(duì)21份茶樹種質(zhì)資源的茶葉籽中的皂素組分及含量進(jìn)行檢測(cè)和分析，旨在為茶葉籽皂素的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料來源于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所種質(zhì)資源圃（120°5′26″E，30°10′52″N），于2021年11月采摘，經(jīng)烘干、人工剝殼、籽仁粉碎過20目篩等步驟，保存于–20℃冰箱備用，樣品信息見表1。

表1 供試樣品相關(guān)信息

1.2 儀器與試劑

主要試劑：茶皂素（純度>98%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；香草醛購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；正己烷、濃硫酸、無水乙醇均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙腈、乙酸均為色譜純，購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；純凈水購(gòu)自杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

主要儀器：DK-S26型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；UV3600紫外-可見分光光度計(jì)、LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司；UHPLC-Q-Exactive/MS，美國(guó)Thermo Fisher公司；810R型離心機(jī)，美國(guó)Eppendorf公司；XQ100型粉碎機(jī)，上海廣沙工貿(mào)有限公司；MA35M-000230V1型水分測(cè)定儀，德國(guó)賽多利斯公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 茶葉籽基本特征數(shù)據(jù)測(cè)定

百粒質(zhì)量測(cè)定：茶葉籽經(jīng)人工剝果殼后，在50℃下烘干至恒重。篩除爛籽和雜質(zhì)，每個(gè)品種（系）隨機(jī)抽取100粒茶葉籽進(jìn)行稱重。

殼仁比測(cè)定：將測(cè)定百粒質(zhì)量后的茶葉籽進(jìn)行剝殼，對(duì)籽仁和籽殼稱重，計(jì)算殼仁比。

籽仁含水量測(cè)定：使用水分測(cè)定儀測(cè)定過20目篩的茶葉籽仁含水量。

1.3.2 茶葉籽皂素總量測(cè)定

樣品前處理：稱取0.200?0?g茶葉籽仁粉末，按照1∶15的質(zhì)量體積比加入正己烷，超聲15?min，以6?000?r·min-1離心10?min除去上清液，重復(fù)此步驟；除去正己烷后，按照1∶15質(zhì)量體積比加入70%甲醇，靜置30?min，超聲30?min，以6?000?r·min-1離心10?min，取上清液過0.45?μm濾膜，即得供試液，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，每個(gè)樣品取50?μL混合制備質(zhì)量控制（QC）樣品。

茶葉籽皂素總量分別參考香草醛-濃硫酸比色法[12]和高效液相色譜法（HPLC）[13]進(jìn)行檢測(cè)。

香草醛-濃硫酸法主要步驟：吸取稀釋20倍的樣品0.5?mL，加入0.5?mL 8%香草醛溶液，于冰水浴中加入4?mL 77%硫酸溶液，60℃加熱10?min，冰水浴中冷卻15?min后，以試劑為空白對(duì)照，用1?cm比色皿在550?nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。配制1?mg·mL-1的茶皂素標(biāo)準(zhǔn)品母液，分別吸取標(biāo)準(zhǔn)品母液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5?mL，置于帶塞試管中，加70%甲醇定容至溶液體積為0.5?mL，按上述方法顯色并測(cè)定吸光值，計(jì)算樣品中茶葉籽皂素含量。

HPLC法主要步驟：色譜柱為Symmetry C18柱（4.6?mm×250?mm，5?μm），流動(dòng)相A相為水，B相為甲醇，柱溫為25℃，流速為1.0?mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為210?nm，進(jìn)樣量為10?μL。洗脫程序：0～10?min，90% B。分別配制濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0?mg·mL-1等6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，經(jīng)0.45?μm膜過濾后進(jìn)行HPLC檢測(cè)，分別得出不同濃度下的峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 茶葉籽皂素組成測(cè)定

采用UHPLC-Q-Exactive/MS測(cè)定茶葉籽皂素單體[10]。色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1?mm×100?mm，1.8?μm），流動(dòng)相A相為0.1%甲酸水溶液，B相為乙腈，柱溫為25℃，流速為0.2?mL·min-1，進(jìn)樣量為3?μL。洗脫程序：0?min，35% B；4?min，37% B；26?min，37% B；48?min，45% B；51?min，90% B；52?min，35% B；55?min，35% B。質(zhì)譜條件：采用電噴霧電離（ESI）Q-Orbitrap質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析，并在負(fù)電離全掃描模式下工作。輔助氣體和護(hù)套氣體的流量分別為10?L·min-1和45?L·min-1。輔助氣體加熱器的溫度為300℃，毛細(xì)管溫度為320℃。全掃描和ddMS2的分辨率分別為70?000和35?000，完整的質(zhì)譜掃描范圍設(shè)置為150～2?000/。數(shù)據(jù)采集和處理使用Thermo Xcalibur 3.0軟件。單體初步鑒定是利用化合物的保留時(shí)間、一級(jí)質(zhì)譜的分子離子峰質(zhì)荷比和二級(jí)質(zhì)譜的碎片離子峰組成與多個(gè)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)以及相關(guān)文獻(xiàn)[10-11,14]進(jìn)行比對(duì)，所有單體均通過比較樣品間母離子的相對(duì)強(qiáng)度來計(jì)算相對(duì)含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。所有試驗(yàn)重復(fù)3次，3組獨(dú)立試驗(yàn)。結(jié)果采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用單因素方差分析，<0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行熱圖和柱狀圖繪制；采用SIMCA 14.1對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種質(zhì)茶葉籽的百粒質(zhì)量和殼仁比

百粒質(zhì)量是體現(xiàn)種子大小和充實(shí)程度的一項(xiàng)指標(biāo)，在一定程度上能反映茶葉籽產(chǎn)量。殼仁比反映茶葉籽仁的占比，籽仁中的油脂、淀粉和皂素含量較多，殼仁比越小越有利于茶葉籽中成分的提取。21個(gè)不同品種（系）茶葉籽的百粒質(zhì)量、殼仁比和含水量如表2所示。21份茶葉籽的百粒質(zhì)量和殼仁比具有顯著性差異（<0.05），百粒質(zhì)量范圍在61.95～179.74?g，其中，屬于喬木型茶樹的勐庫(kù)大葉種百粒質(zhì)量最大，而屬于灌木型黃化品系的安吉奶黃優(yōu)系百粒質(zhì)量最小，百粒質(zhì)量總體呈現(xiàn)喬木型茶樹>小喬木型茶樹>灌木型茶樹。殼仁比大于100%表示籽殼比籽仁重，黔湄601茶葉籽的籽殼比籽仁重，金觀音茶葉籽的籽殼與籽仁重量大致相等，其余19個(gè)品種（系）茶葉籽的籽殼均比籽仁輕，其中安吉優(yōu)系和安吉奶黃優(yōu)系籽仁占比較大。21個(gè)品種（系）的茶葉籽含水量為5.63%～7.55%。

2.2 不同種質(zhì)茶葉籽皂素總量比較

前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，籽殼中皂素含量遠(yuǎn)低于籽仁，因此選用籽仁進(jìn)行茶葉籽皂素含量提取和測(cè)定。21個(gè)品種（系）的茶葉籽經(jīng)前置處理后，分別用紫外分光光度法、HPLC法進(jìn)行茶葉籽皂素含量測(cè)定，結(jié)果如表3所示。紫外分光光度法測(cè)得的茶葉籽皂素范圍為30.82%～48.16%，平均值為(39.50±4.95)%；HPLC法測(cè)得的茶葉籽皂素范圍為16.93%～31.82%，平均值為(24.07±4.84)%。兩種檢測(cè)方法均顯示，不同品種（系）間的茶葉籽皂素總含量具有顯著性差異（<0.05）。黃觀音茶葉籽皂素含量最高，紫娟最低，這兩個(gè)品種均為小喬木型，表明茶葉籽皂素總含量與茶樹樹型相關(guān)性較小，與郭華[15]得出的灌木>小喬木=喬木的結(jié)論不一致。對(duì)比不同檢測(cè)方法發(fā)現(xiàn)，紫外分光光度法測(cè)得的茶葉籽皂素含量顯著高于HPLC法，圖1表明個(gè)別品種（系）的含量排序存在差異，但總體品種（系）間含量高低趨勢(shì)較為一致。造成這種結(jié)果的原因可能是不同茶葉籽仁中含有數(shù)量不同的黃酮類等酚類物質(zhì)，會(huì)與香草醛反應(yīng)，導(dǎo)致吸光值上升，干擾檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

表2 不同種質(zhì)茶葉籽的基本特征指標(biāo)

注：同列不同小寫字母表示差異顯著（<0.05），下同

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference (<0.05). The same below

表3 不同種質(zhì)茶葉籽皂素總量

2.3 不同種質(zhì)茶葉籽皂素單體差異

為了解不同品種（系）茶葉籽中皂素組成及相對(duì)含量的差異性，采用UHPLC-Q- Exactive/MS對(duì)茶葉籽提取物中皂素單體進(jìn)行檢測(cè)分析。通過已報(bào)道的茶葉籽皂素單體的質(zhì)荷比和二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行物質(zhì)提取與比對(duì)[10]，共獲得了68個(gè)茶葉籽皂素單體特征離子峰（圖2和表4），QC樣品中的這些物質(zhì)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviation，RSD）小于2%，表示這些數(shù)據(jù)均可進(jìn)一步分析。

21份茶葉籽的皂素提取物的總離子流圖相似（圖2），除金萱外均檢出68種皂素單體（表4）。68個(gè)茶葉籽皂素單體中有62個(gè)單體結(jié)構(gòu)確定，與前人文獻(xiàn)報(bào)道一致[9-10,16]，另有6個(gè)未知物質(zhì)。雖然不同茶葉籽中皂素種類相似，但其含量具有顯著性差異（＜0.05）（圖3）。所有品種（系）中皂素單體相對(duì)強(qiáng)度前5的物質(zhì)一致，分別是Theasaponin E1、Theasaponin E12、Theasaponin A9、Assamsaponin A、Assamsaponin B。Theasaponin E1是所有種質(zhì)資源中茶葉籽峰的相對(duì)強(qiáng)度最高的茶葉籽皂素單體（圖3-A），在黃觀音中含量最高，而在紫娟中含量最低。

文獻(xiàn)報(bào)道，山茶屬植物中已發(fā)現(xiàn)的三萜皂苷存在7種皂苷元、26種糖體和9種有機(jī)酸的排列組合[16]。本研究中結(jié)構(gòu)確定的62個(gè)茶葉籽皂素單體均擁有相同的皂苷元，但連接的糖體和有機(jī)酸不相同。其中糖體主要有兩種結(jié)構(gòu)，第一種為-D-Galactopyranosyl(1→2)[-D-xylopyranosyl(1→2)--L-arabinopyranosyl(1→3)]--D-glucuronic acid，包含39個(gè)單體；第二種為-D-Galactopyranosyl(1→2)[-D-glucuronopyranosyl(1→2)--L-arabinopyranosyl(1→3)]--D-glucuronic acid，包含20個(gè)單體。說明茶葉籽皂素中以含有第一種糖體結(jié)構(gòu)的皂素單體為主。另外，結(jié)果顯示金萱中未檢測(cè)到Assamsaponin C，后續(xù)可以選擇不同地區(qū)的金萱進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)分析。

圖1 不同種質(zhì)茶葉籽皂素總量

圖2 基于UHPLC-Q-Exactive/MS茶葉籽皂素總離子流色譜圖（以QC為例）

為研究不同茶葉籽資源的皂素組分差異性，將21個(gè)品種（系）的68個(gè)茶葉籽皂素單體數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLS-DA分析。結(jié)果顯示，21份茶葉籽資源被明顯分成2組（圖4-A），以編號(hào)為1～12的灌木型品種（系）為類別1，聚集在OPLS-DA得分圖左側(cè)；以編號(hào)為13～21的小喬木和喬木型品種（系）為類別2，聚集在得分圖右側(cè)。這些結(jié)果表明，灌木型種質(zhì)資源和小喬木型、喬木型種質(zhì)資源中的茶葉籽皂素單體存在顯著差異。置換檢驗(yàn)結(jié)果顯示（圖4-B），2和2分別為0.27和–0.616，說明OPLS-DA模型沒有過擬合，以變量投影重要性（Variable importance in the projection，VIP＞1）為標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出差異組分21種（圖4-C）。

表4 茶葉籽皂素單體質(zhì)譜信息

圖5所示為21種差異組分在兩個(gè)種質(zhì)資源類別中的相對(duì)強(qiáng)度分布，其中Theasaponin E2、Theasaponin E1、Assamsaponin B、Theasaponin E4/E8、Assamsaponin H、Theasaponins E4/E8等6種單體在灌木型種質(zhì)資源中相對(duì)強(qiáng)度較高（＜0.05），而Theasaponin E12、Camelliasaponin B1/B2、Theasaponin A5/A6、Assamsaponin A、unknown（1157.5771）、Theasaponin B5、Camelliasaponin C1/C2、Theasaponin A9、Theasaponin E10、Theasaponin E6、Theasaponin A7、Camelliasaponin A1/A2、Theasaponin E11、Assamsaponin E、Assamsaponin G等15種單體在小喬木型、喬木型種質(zhì)資源中較高（＜0.05）。單體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，灌木型種質(zhì)資源中以第一種糖體結(jié)構(gòu)的皂素單體為主，而在小喬木型、喬木型種質(zhì)資源中，含有第二種糖體的皂素單體積累得更多。

注：A圖為同一種質(zhì)中各個(gè)皂素單體峰的相對(duì)強(qiáng)度；B圖為不同種質(zhì)間各皂素單體峰的相對(duì)強(qiáng)度

2.4 不同種質(zhì)間標(biāo)志性差異單體

種質(zhì)資源的類型可能是導(dǎo)致茶葉籽皂素差異的潛在原因，所以使用Pearson法對(duì)種質(zhì)資源的基本特征數(shù)據(jù)與茶葉籽皂素總量和差異性單體組分的相對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行相關(guān)性分析（表5）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，百粒質(zhì)量與皂素總含量無顯著相關(guān)性，但與Theasaponin E12、Camelliasaponin B1/B2、Theasaponin A5/A6、Camelliasaponin C1/C2、Assamsaponin G存在極顯著正相關(guān)關(guān)系（＜0.01，0.5＜≤0.8）；另外，殼仁比與皂素含量無顯著相關(guān)性。由2.1章節(jié)可知，小喬木型、喬木型種質(zhì)資源的百粒質(zhì)量大于灌木型，結(jié)合圖5可知，高響應(yīng)強(qiáng)度的Theasaponin E12、Camelliasaponin B1/B2、Theasaponin A5/A6、Camelliasaponin C1/C2和Assamsaponin G，可能是灌木型種質(zhì)資源有別于小喬木型、喬木型種質(zhì)資源重要的標(biāo)志性差異單體。

3 討論

3.1 茶葉籽皂素總量的檢測(cè)方法

茶皂素是一類結(jié)構(gòu)相似的五環(huán)三萜類物質(zhì)，其紫外吸光較弱，定量檢測(cè)較為困難。以往文獻(xiàn)中報(bào)道的檢測(cè)手段有重量法、比色法、HPLC法等[17]。陳瑩等[18]采用重量法、香草醛-濃硫酸比色法和HPLC法對(duì)不同純度茶皂素進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)3種檢測(cè)方法的結(jié)果無顯著性差異，均適合于茶皂素含量的檢測(cè)。張團(tuán)結(jié)等[19]以水解后的皂素甙元為標(biāo)準(zhǔn)，采用分光光度法和HPLC法對(duì)油茶籽餅中茶皂素定量檢測(cè)，認(rèn)為分光光度法更為簡(jiǎn)單便捷。也有研究表明，HPLC法較香草醛-濃硫酸比色法測(cè)定油茶皂素含量準(zhǔn)確度更高[20]。由于每種方法都有其局限性，不同專家也持有不同的見解，目前暫無公認(rèn)穩(wěn)定、高效、可靠的茶皂素檢測(cè)手段。本研究采用了2種方法對(duì)不同的茶葉籽皂素含量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)香草醛-濃硫酸比色法測(cè)定結(jié)果高于HPLC法，是HPLC法的1.64倍。導(dǎo)致此結(jié)果的原因可能是茶葉籽中含有較多的黃酮類等酚類物質(zhì)，在前處理階段未完全去除，使得這些物質(zhì)與香草醛在酸性條件下發(fā)生反應(yīng)，引起吸光值異常升高。前人文獻(xiàn)中多以油茶籽皂素作為檢測(cè)目標(biāo)，其干擾物質(zhì)含量和種類可能較少，但具體差異尚不清楚，需進(jìn)一步研究。以上說明香草醛-濃硫酸比色法可能使得茶葉籽中皂素的檢測(cè)結(jié)果存在誤差。另外，HPLC法與香草醛-濃硫酸比色法檢測(cè)結(jié)果也存在差異，可能是因?yàn)槟承┰硭貑误w的紫外吸光過弱，不能被高效液相色譜儀的紫外檢測(cè)器捕捉到信號(hào)。這也側(cè)面說明不同茶葉籽資源中皂素單體的種類和含量有區(qū)別。

注：A，OPLS-DA圖，R2X=96.5%，R2Y=97.7%，Q2=96.1%；綠色和藍(lán)色分別代表灌木型種質(zhì)資源、小喬木型和喬木型種質(zhì)資源；B，重復(fù)200次的置換檢驗(yàn)結(jié)果圖；C，VIP＞1的差異組分

圖5 不同類別種質(zhì)資源中差異茶葉籽皂素單體熱圖

表5 不同種質(zhì)資源與茶葉籽皂素的相關(guān)性

注：*表示在0.05水平（雙尾），相關(guān)性顯著。**表示在0.01水平（雙尾），相關(guān)性極顯著

Note: *, the correlation was significant at level 0.05 (two-tailed). **, the correlation was extremely significant at level 0.01 (two-tailed)

3.2 茶葉籽皂素與種質(zhì)的關(guān)系

依據(jù)糖體和有機(jī)酸不同以及皂苷元的結(jié)合位點(diǎn)不同，現(xiàn)已在茶（）、油茶（）、山茶（）和茶梅（）4個(gè)山茶屬的種子、花、葉和根中共分離鑒定出188種茶皂素單體結(jié)構(gòu)[16]。Morikawa等[21]研究表明，茶花皂苷在不同品種和地區(qū)間存在差異，中國(guó)臺(tái)灣中北部山區(qū)的茶花樣品中Chakasaponins I-III較高，而中部和南部地區(qū)的樣品中Floratheasaponins A-F含量較高；Fan等[22]通過對(duì)42個(gè)茶樹品種茶葉皂苷含量的篩選，發(fā)現(xiàn)茶葉皂苷含量受到茶樹基因型和生長(zhǎng)條件（如發(fā)育和環(huán)境因素）的影響。但是不同茶樹品種間的茶葉籽皂素單體種類和含量變化仍不清楚。本研究通過對(duì)同一地區(qū)的21個(gè)茶樹品種（系）茶葉籽皂素進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)不同品種（系）間茶葉籽皂素總量、單體種類及含量均有顯著性差異（＜0.05），黃觀音是本研究茶樹種質(zhì)中皂素總量最高的品種，Theasaponin E1是所有品種（系）中離子峰相對(duì)強(qiáng)度最高的單體。OPLS-DA分析結(jié)果表明，灌木型種質(zhì)資源與小喬木型、喬木型種質(zhì)資源的皂素單體構(gòu)成（種類及相對(duì)含量）有明顯差異。結(jié)合種質(zhì)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析獲得標(biāo)志性差異單體物質(zhì)，Theasaponin E12、Camelliasaponin B1/B2、Theasaponin A5/A6、Camelliasaponin C1/C2和Assamsaponin G可能是區(qū)別灌木型與小喬木型、喬木型種質(zhì)資源的標(biāo)志性差異單體。

次生代謝組學(xué)分析揭示，甲羥戊酸（MVA）途徑是山茶屬植物合成茶皂素的主要途徑[11,23]。首先2,3-氧化角鯊烯環(huán)化生成-amyrin型三萜骨架，隨后通過細(xì)胞色素P450單加氧酶（P450s）對(duì)此骨架進(jìn)行氧化修飾和UDP糖基轉(zhuǎn)移酶（UGTs）介導(dǎo)的糖側(cè)鏈修飾而形成皂素[24]。山茶植物組織中已鑒定出100多種三萜皂苷，其結(jié)構(gòu)和功能的多樣性主要是由P450s和UGTs貢獻(xiàn)的，然而由于茶樹基因組的復(fù)雜性，各類皂素單體的合成路徑仍難以評(píng)估。從5組標(biāo)志性差異單體的結(jié)構(gòu)來看，它們所連接的糖基相同，表明可能由相同或相似的UGTs合成，區(qū)別于灌木型茶葉籽皂素單體的合成途徑。

不同結(jié)構(gòu)的茶皂素生物活性各異。有文獻(xiàn)顯示，Thesaponin E1和Thesaponin E2對(duì)乙醇誘導(dǎo)的大鼠胃黏膜病變的抑制活性要強(qiáng)于Theasaponin A2、Assamsaponin A和Assamsaponin D[7]。一些修飾基團(tuán)對(duì)茶皂素的活性至關(guān)重要，如C3位上糖基類型也能夠影響皂素的細(xì)胞毒性及其溶血能力的強(qiáng)弱[25]，C21位和C22位上的乙?；茉黾硬柙硭氐目垢哐Y活性[26]，C22位還是茶皂素抑制過敏反應(yīng)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[27]。Thesaponin E1和Thesaponin E2為同分異構(gòu)體，Thesaponin E1具有抑制小鼠胃排空和加速胃腸運(yùn)輸?shù)墓δ?，而Thesaponin E2沒有此類活性[28]；Thesaponin E2可以降低人們對(duì)蔗糖甜味的感知能力，而Thesaponin E1不能[29]。灌木型茶樹茶葉籽的皂素單體構(gòu)成與小喬木型、喬木型茶樹茶葉籽的皂素單體有明顯區(qū)別，表明這兩類茶樹茶葉籽的生理活性可能也存在差異，在后續(xù)研究中值得關(guān)注。

此外，茶葉籽在成熟過程中，茶葉籽皂素含量先逐漸增加，在9月份達(dá)到最高值后隨成熟度增加而減少[11]。茶葉籽皂素含量的增加與減少與哪些生物合成途徑及基因有關(guān)？茶葉籽中其他物質(zhì)如茶葉籽油、淀粉和蛋白的合成與積累是否會(huì)影響皂素的含量？這些都有待進(jìn)一步研究。

[1] 馬躍青, 張正竹. 茶葉籽綜合利用研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)油脂,2010, 35(9): 66-69.

Ma Y Q, Zhang Z Z. Research advance in comprehensive utilization of tea seeds [J]. China Oils and Fats, 2010, 35(9): 66-69.

[2] Yang W S, Ko J, Kim E, et al. 21-O-angeloyltheasapogenol E3, a novel triterpenoid saponin from the seeds of tea plants, inhibits macrophage-mediated inflammatory responses in a NF-B-dependent manner [J]. Mediators of Inflammation, 2014, 2014: 658351. doi: 10.1155/2014/658351.

[3] Yang H, Cai R, Kong Z Y, et al. Teasaponin ameliorates murine colitis by regulating gut microbiota and suppressing the immune system response [J]. Frontiers in Medicine, 2020, 7: 584369. doi: 10.3389/fmed.2020.584369.

[4] Yang H, Shao X, Yu G H. Effect of tea saponin on blood pressure in spontaneously hypertensive rats [J]. Chinese Journal of Clinical Healthcare, 2007, 116(5): 388-395.

[5] Yong Y, Chen X, Xing H. Hypolipidemic and antioxidant activities of hydrolyzed saponins from defatted seeds ofAbel [J]. Lation American Journal of Pharmacy, 2013, 32(3): 409-417.

[6] Khan M I, Ahhmed A, Shin J H, et al. Green tea seed isolated saponins exerts antibacterial effects against various strains of gram positive and gram negative bacteria, a comprehensive studyand[J]. Evidence-based Complementary and Alternative Medicine : eCAM, 2019, 2018: 3486106. doi: 10.1155/2018/3486106.

[7] Morikawa T, Li N, Nagatomo A, et al. Triterpene saponins with gastroprotective effects from tea seed (the seeds of) [J]. Journal of Natural Products, 2006, 69(2): 185-190.

[8] 趙世明. 茶皂素的化學(xué)結(jié)構(gòu)及藥理活性研究[J]. 國(guó)外醫(yī)藥(植物藥分冊(cè)), 1998, 13(1): 3-6.

Zhao S M. Study on the chemical structure and pharmacological activity of tea saponin [J]. World Phytomedicines, 1998, 13(1): 3-6.

[9] Guo N, Tong T T, Ren N, et al. Saponins from seeds of[J]. Phytochemistry and Bioactivity, 2018, 149: 42-55.

[10] Wu X J, Jia L Y, Wu J F, et al. Simultaneous determination and quantification of triterpene saponins fromseeds using UPLC-PDA-QTOF-MS/MS [J]. Molecules, 2019, 24(20): 3794. doi: 10.3390/molecules24203794.

[11] Chen C, Zhu H Q, Kang J X, et al. Comparative transcriptome and phytochemical analysis provides insight into triterpene saponin biosynthesis in seeds and flowers of the tea plant () [J]. Metabolites, 2022, 12(3): 204. doi: 10.3390/metabo12030204.

[12] Chen Y F, Yang C H, Chang M S, et al. Foam properties and detergent abilities of the saponins from[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2010, 11: 4417-4425.

[13] 譚搏, 曹福祥, 趙瑩. 油茶餅中茶皂素的定量分析[J]. 精細(xì)化工中間體, 2009, 39(2): 67-69.

Tan B, Cao F X, Zhao Y. Quantitative analysis of tea saponin incake [J]. Fine Chemical Intermediates, 2009, 39(2): 67-69.

[14] 吳學(xué)進(jìn). 茶籽皂素的分離鑒定與定量檢測(cè)[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2018.

Wu X J. Separation, identification and quantification of triterpene saponins in seeds of[D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2018.

[15] 郭華. 高檔茶籽油的提取及茶籽綜合利用技術(shù)研究[D]. 長(zhǎng)沙: 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007.

Guo H. Study of technologies on refining high quality tea seed oil and comprehensively utilizing tea seed [D]. Changsha: Hunan Agricultural University, 2007.

[16] Cui C J, Zong J F, Sun Y, et al. Triterpenoid saponins from the genus: structures, biological activities, and molecular simulation for structure-activity relationship [J]. Food & Function, 2018, 9(6): 3069-3091.

[17] 王羚, 方學(xué)智. 油茶皂素定量分析方法研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè), 2020, 41(11): 278-282.

Wang L, Fang X Z. Research progress in quantitative analysis of tea saponin [J]. The Food Industry, 2020, 41(11): 278-282.

[18] 陳瑩, 劉松柏, 何良興, 等. 油茶籽粕和茶皂素中皂苷的定量檢測(cè)方法研究[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào), 2012, 27(2): 105-111.

Chen Y, Liu S B, He L X, et al. Quantitative analysis of saponin inseed cake and tea saponins [J]. Journal of the Chinese Cereals and Oils, 2012, 27(2): 105-111.

[19] 張團(tuán)結(jié), 熊道陵, 許光輝, 等. 油茶籽餅中茶皂素定量檢測(cè)方法研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2016, 37(4): 53-56.

Zhang T J, Xiong D L, Xu G H, et al. Quantitative analysis of tea saponin from seed cake [J]. Science and Technology of Food Industry, 2016, 37(4): 53-56.

[20] 趙敬娟, 杜先鋒. 油茶皂苷對(duì)照品制備及高效液相色譜定量法的研究[J]. 中國(guó)油脂, 2009, 34(4): 68-72.

Zhao J J, Du X F. Sasanquasaponin reference substance preparation and quantitative [J]. China Oils and Fats, 2009, 34(4): 68-72.

[21] Morikawa T, Lee I J, Okugawa S, et al. Quantitative analysis of catechin, flavonoid, and saponin constituents in “tea flower”, the flower buds of, from different regions in Taiwan [J]. Natural Product Communications, 2013, 11(8): 1553-1557.

[22] Fan L M, He Y F, Xu Y J, et al. Triterpenoid saponins in tea () plants: biosynthetic gene expression, content variations, chemical identification and cytotoxicity [J]. International Journal of Food Sciences and Nutrition, 2021, 72(3): 308-323.

[23] 羅祖良, 張凱倫, 馬小軍, 等. 三萜皂苷的合成生物學(xué)研究進(jìn)展[J]. 中草藥, 2016, 47(10): 1806-1814.

Luo Z L, Zhang K L, Ma X J, et al. Research progress in synthetic biology of triterpen saponins [J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2016, 47(10): 1806-1814.

[24] Zhao J, Li P H, Xia T, et al. Exploring plant metabolic genomics: chemical diversity, metabolic complexity in the biosynthesis and transport of specialized metabolites with the tea plant as a model [J]. Critical Reviews in Biotechnology, 2020, 40(5): 667-688.

[25] Oda K, Matsuda T, Murakami S, et al. Adjuvant and haemolytic activities of 47 saponins derived from medicinal and food plants [J]. Biological Chemistry, 2000, 381(1): 67-74.

[26] Yoshikawa M, Morikawa K, Yamamoto Y, et al. Floratheasaponins A-C, acylated oleanane-type triterpene oligoglycosides with anti-hyperlipidemic activities from flowers of the tea plant () [J]. Journal of Natural Products, 2005, 68(9): 1360-1365.

[27] Matsuda S, Nakamura K, Fujimoto R, et al. Medicinal flowers. XXXI. acylated oleanane-type triterpene saponins, Sasanquasaponins I-V, with antiallergic activity from the flower buds of[J]. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 2010, 58(12): 1617-1621.

[28] Murakami T, Nakamura J, Kageura T, et al. Bioactive saponins and glycosides. XVII. Inhibitory effect on gastric emptying and accelerating effect on gastrointestinal transit of tea saponins: structures of assamsaponins F, G, H, I, and J from the seeds and leaves of the tea plant [J]. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 2000, 48: 1720-1725.

[29] Kitagawa I, Hori T, Motozawa T, et al. Structures of new acylated oleanene-type triterpene oligoglycosides, Theasaponins E1 and E2, from the seeds of tea plant,(L.) O. Kuntze [J]. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 1998, 46(12): 1901-1906.

Analysis of the Saponin Contents and Composition in Tea Seeds of Different Germplasms

CHEN Yuhong1,2, GAO Ying1*, HAN Zhen3, YIN Junfeng1*

1. Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 3. General Agricultural Extension Station of Ningbo City, Ningbo 315012, China

Tea saponins are abundant in the seeds ofwith specific biological activities. Their contents and composition in tea seeds of different germplasms remain unclear. In this study, seeds from 21 tea germplasms were collected from the same region of Zhejiang and used as experimental materials to determine the basic characteristics, saponin contents and composition. Correlation analysis between germplasm and saponin composition was also performed. The results show that the seed weight, shell kernel ratio and saponin content of different tea seeds were significantly different (<0.05). The saponin content detected by UV spectral method and HPLC ranged from 30.82% to 48.16% and 16.93% to 31.82%, respectively. ‘Huangguanyin’ had the highest saponin content in tea seeds. Totally 68 tea seed saponin monomers were detected simultaneously using ultrahigh performance liquid chromatography-quadrupole orbitrap mass spectrometer（UHPLC-Q-Exactive/MS）. Theasaponin E1 had the highest relative intensity. Orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) shows that the 21 tea seed germplasmscan be distinguished into 2 groups according to tree type with 21 differentCamelliasaponin B1/B2, Theasaponin A5/A6, Camelliasaponin C1/C2 and Assamsaponin G were the most significant characteristic substances of semi-tree form and arbor form resources. The results of the study laid the foundation for the selection and value-added utilization of tea seed saponins.

tea seed, saponin, monomer, UHPLC-Q-Exactive/MS

S571.1；Q946.8

A

1000-369X(2022)05-705-12

2022-04-25

2022-05-13

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-2016-TRI）、浙江省“萬人計(jì)劃”科技創(chuàng)新人才項(xiàng)目（2018R52024）、財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部：國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-19-02A）、寧波市科技計(jì)劃（202002N3020）

陳宇宏，女，博士研究生，主要從事茶深加工與多元化利用研究。*通信作者：yinggao@tricaas.com，yinjf@tricaas.com