殼聚糖復(fù)合β-乳球蛋白負(fù)載EGCG納米粒的制備及其對糖尿病小鼠血糖的影響

陳珂，王苑竹，楊曉穎，張冬英，朱強(qiáng)強(qiáng)*

殼聚糖復(fù)合-乳球蛋白負(fù)載EGCG納米粒的制備及其對糖尿病小鼠血糖的影響

陳珂1,2，王苑竹1,2，楊曉穎1,3，張冬英1,3，朱強(qiáng)強(qiáng)1,2*

1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)普洱茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；3. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，云南 昆明 650201

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）作為茶葉中主要生物活性成分，具有良好的生理功能，但低穩(wěn)定性使其容易被氧化降解，生物利用率低。利用羧甲基殼聚糖（CMC）、殼聚糖鹽酸鹽（CHC）、-乳球蛋白（-LG）作為壁材，制備殼聚糖復(fù)合-乳球蛋白負(fù)載EGCG納米粒，通過透射電鏡、結(jié)構(gòu)表征（粒徑、Zeta電位測定）對顆粒微觀形態(tài)進(jìn)行觀察，利用高效液相色譜儀對顆粒包埋率、模擬胃腸液釋放率進(jìn)行測定，最后建立糖尿病小鼠模型，探究包埋后顆粒的降血糖活性。結(jié)果表明，CS--LG-EGCG納米粒結(jié)構(gòu)完整、粒徑10～100?nm、粒子分散；包埋率大于50%，且在腸液和胃液中具有緩釋作用；CS--LG-EGCG納米粒與胰島素?zé)o拮抗作用，與未包埋的EGCG相比，包埋后顆粒具備的緩釋作用可減緩血糖的回升。

EGCG；殼聚糖；-乳球蛋白；模擬胃液；糖尿病

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是綠茶中含量最高且活性最強(qiáng)的兒茶素單體[1]，不僅具有良好的抗氧化性能，還具有抗炎、抗癌等作用[2]。近年來，隨著糖尿病在全球發(fā)病率的不斷升高，EGCG對血糖的調(diào)控作用也被廣泛關(guān)注。有研究指出，EGCG可以顯著抑制淀粉消化酶活性和小腸中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，從而發(fā)揮一定的降血糖作用[3]；此外，EGCG可通過抗氧化特性、激活A(yù)MPK通路保護(hù)胰島細(xì)胞，提高AKT磷酸化水平，維持胰島素功能[4]，進(jìn)而防治糖尿病[5]，且低濃度的EGCG對胰島素治療無拮抗作用[6]。但是，EGCG在加工或儲藏過程中容易受到光照、濕度、輻射等因素的影響，攝入機(jī)體后其功能作用會受到酸性的消化液、酶、自由基的破壞，導(dǎo)致口服生物利用度低。因此，如何實(shí)現(xiàn)EGCG攝入后的穩(wěn)定性并對其進(jìn)行可控運(yùn)載，成為近年來研究的熱點(diǎn)。目前，通過構(gòu)建納米顆粒實(shí)現(xiàn)對功能物質(zhì)的包被成為提高其利用率的手段之一。

納米顆粒的粒徑介于1～100?nm[7]，具有獨(dú)特的表面效應(yīng)和量子尺寸效應(yīng)[8]，主要通過將藥物和食品功能因子溶解、包裹于納米粒子內(nèi)部或吸附于表面，提高功能成分穩(wěn)定性，延緩釋放，延長半衰期[9]。

殼聚糖鹽酸鹽（CHC）和羧甲基殼聚糖（CMC）是兩種不同的水溶性殼聚糖衍生物，具有生物相容性、生物降解性和非毒性，作為常用壁材可以顯著提高功能物質(zhì)口服穩(wěn)定性，價格低廉[10]。-乳球蛋白（-LG）是牛乳中乳清蛋白的主要成分，具有生物活性及配體結(jié)合能力，因其營養(yǎng)價值高、生物降解性好、親和性好、抗胃蛋白酶能力強(qiáng)而被廣泛應(yīng)用于功能性食品中[9-10]。本研究選擇CHC、CMC、-LG作為壁材，通過構(gòu)建負(fù)載EGCG納米粒，獲得一種價格低廉、方法簡便、具有一定營養(yǎng)組分等特點(diǎn)的納米粒，旨在提高EGCG口服生物利用率，促進(jìn)茶葉功能成分的精深加工和應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

主要試劑：EGCG（純度>98%）購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；-LG（純度>90%）購自北京索萊寶科技有限公司；CHC（脫乙酰度>90%）和CMC（脫乙酰度>90%）購自河北豐佳生物科技有限公司；胃蛋白酶（豬胃黏膜）購自上海源葉生物科技有限公司；胰酶購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；乙腈和三氟乙酸購自賽默飛世爾科技公司；鏈脲佐菌素（STZ）購自Sigma公司。

主要儀器：旋渦混合器QL-902、轉(zhuǎn)移脫色搖床TS-8S（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；臺式離心機(jī)CT15RE（日本日立公司）；液相色譜儀1260[安捷倫科技（中國）有限公司]；普力菲爾超純水機(jī)FDT-III-80（上海富詩特儀器設(shè)備有限公司）；Zeta電位及納米粒度分析儀（馬爾文帕納科）；磁力攪拌器CJJ78-1（金壇市大地自動化儀器廠）；透射電子顯微鏡JEM-1200EX2（日本電子）；水浴鍋20111079（杭州奧盛科技有限公司）；血糖儀D156U（三諾生物傳感股份有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 CS--LG-EGCG納米粒的制備

參考文獻(xiàn)[10-11]的方法，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)。稱取12?mg CMC粉末溶于20?mL的30?mmol·L-1磷酸鹽緩沖液（pH=6.5）中，制成0.6?mg·mL-1的CHC溶液；隨后在CHC溶液中加入40?mg EGCG，避光，于旋渦混合器上混勻，制成2?mg·mL-1的CHC-EGCG溶液。稱取29?mg的CMC粉末溶于20?mL的30?mmol·L-1磷酸鹽緩沖液（pH=6.5）中制成1.45?mg·mL-1的CMC溶液。最后稱取50?mg-LG粉末溶于10?mL?30?mmol·L-1磷酸鹽緩沖液（pH=6.5）中,制成5?mg·mL-1的-LG溶液，并在-LG溶液中加入0.02% NaN3以達(dá)到防腐的目的[9]。設(shè)置A、B、C、D 4組樣品，分別按CHC-EGCG∶V-LG∶CMC為1∶1∶1、1∶2∶1、1∶1∶2、1∶2∶2的比例混合，具體步驟：-LG溶液水浴加熱至80℃后，逐滴加入到CHC-EGCG溶液中，渦旋混合，最后逐滴加入CMC溶液。將混合好的溶液置于磁力攪拌器上避光攪拌1?h[12]，超聲5?min使其具有一定的分散性。

1.2.2 CS--LG-EGCG納米粒微觀形態(tài)

通過透射電子顯微鏡（TEM）觀察納米粒形態(tài)結(jié)構(gòu)。將樣品滴在涂有支持膜的銅網(wǎng)上[12]，保持樣品在銅網(wǎng)中2～3?min，然后浸入磷鎢酸染色105?s。自然干燥后，將樣品置于透射電子顯微鏡下觀察。

1.2.3 CS--LG-EGCG納米粒粒徑、Zeta電位測定

取適量納米粒溶液，采用粒度/zeta電位儀測定并記錄粒徑分布及電位情況。

1.2.4 CS--LG-EGCG納米粒包埋率的測定

HPLC條件：ZORBAXSB-C18（250?mm×4.6?mm，5?μm）色譜柱；柱溫為30℃；在檢測EGCG時流動相由乙腈（A）和0.03%三氟乙酸（B）組成，比例為A∶B=60∶40；進(jìn)樣量為10?μL；流速1.0?mL·min-1；檢測波長為280?nm。

標(biāo)準(zhǔn)曲線測定：準(zhǔn)確稱量EGCG，通過倍比稀釋配制出質(zhì)量濃度為1?500、750、375、187.5、93.75、46.875?μg·mL-16個梯度的EGCG標(biāo)準(zhǔn)溶液，高效液相色譜測定峰面積，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，即=0.077?3-0.076?9，（2=0.999?7），其中為EGCG質(zhì)量濃度（μg·mL-1），為峰面積。

包埋率測定：取1.2?mL EGCG納米粒溶液于超濾濃縮離心管（2?mL，截留分子量為3?kDa），4℃條件下4?000×離心30?min，收集離心后的液體，通過HPLC對超濾離心管中游離的EGCG進(jìn)行定量測定。

式中為包埋率，1為EGCG初始濃度，2為超濾離心管液體中EGCG（游離EGCG）濃度。

1.2.5 CS--LG-EGCG納米粒在模擬腸液、胃液中釋放率測定

參考王智能等[13]和Fu等[14]的方法并作適當(dāng)修改。取8?mL濃鹽酸用1?L去離子水稀釋，調(diào)節(jié)pH為1.2，按照10?mg·mL-1的質(zhì)量濃度稱取胃蛋白酶溶于稀鹽酸中，水浴加熱至37℃，配制成模擬胃液（Simulated gastric fluid，SGF）。稱取7.3?g KH2PO4·2H2O加入到1?L去離子水中，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.8后，按照10?μL·mL-1加入胰液，水浴加熱至37℃，配制成模擬腸液（Simulated intestinal fluid，SIF）。將CS--LG-EGCG納米粒按照體積比1∶10分散在模擬腸液和胃液中，置于37℃搖床上平緩搖動，模擬體內(nèi)消化過程。分別在1、2、3?h和4?h收集納米粒懸液。用高效液相色譜法測定游離EGCG含量，計算納米粒對EGCG的釋放率。

式中為釋放率，3為消化后樣品中EGCG濃度，4為初始負(fù)載的EGCG濃度。

1.2.6 CS--LG-EGCG納米?；钚匝芯?/p>

糖尿病小鼠模型建立：采用健康雄性C57BL/6小鼠，購買于常州卡文斯實(shí)驗動物有限公司，許可證號為SCXK（蘇）2021-0013，動物實(shí)驗征得云南農(nóng)業(yè)大學(xué)機(jī)構(gòu)動物護(hù)理和使用委員會批準(zhǔn)。將其中18只小鼠饑餓過夜后，稱重，按體重均值分籠，使用STZ藥物，按照100?mg·kg-1劑量腹腔注射1%的STZ溶液進(jìn)行糖尿病模型誘導(dǎo)[15]，注射完畢后放回籠中正常飼養(yǎng)。每天在13點(diǎn)進(jìn)行血糖檢測，連續(xù)兩周。血糖大于17?mmol·L-1即為造模成功。

納米粒對糖尿病小鼠血糖影響試驗：設(shè)置正常組（Normal）、糖尿病組（Diabetes）、納米顆粒和胰島素聯(lián)用組（CS--LG-EGCG+INS）、納米粒壁材和胰島素聯(lián)用組（CS--LG+INS）、EGCG和胰島素聯(lián)用組（EGCG+INS）、胰島素組（INS）。小鼠饑餓12?h后，稱量體重，根據(jù)體重均值對應(yīng)分組，每組3只。綜合包埋率和釋放率最好的樣品，對CS--LG-EGCG+INS組進(jìn)行灌胃；配制與納米粒組EGCG含量相等的EGCG溶液對EGCG+INS組進(jìn)行300?μL體積灌胃；對Normal組、Diabetes組分別灌胃等體積的生理鹽水；皮下胰島素注射劑量為0.72?U·kg-1。分別在0、0.5、1、2、3、4?h鼠尾取血，檢測血糖含量，制作血糖比例與時間曲線。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism 5和IBM SPSS Statistics 25軟件，利用方差分析計算出各組納米粒的粒徑、Zeta電位均值、包埋率、在模擬胃液和腸液中EGCG釋放率均值，并對糖尿病小鼠的血糖數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CS-β-LG-EGCG納米粒電鏡分析

圖1為透射電鏡放大3萬倍后拍攝的圖片。如圖1所示，A、B、C、D 4組樣品的納米粒形態(tài)規(guī)整、呈球形，具有一定分散性，粒徑均值在100?nm以內(nèi)。結(jié)合分散、聚集和顆粒結(jié)構(gòu)情況，認(rèn)為C組樣品，即CHC-EGCG∶V-LG∶CMC為1∶1∶2時，CS--LG-EGCG納米粒呈現(xiàn)相對最佳的形態(tài)。

2.2 CS-β-LG-EGCG納米粒粒徑分析

粒徑通常作為判定納米粒大小的必要指標(biāo)，壁材與EGCG之間通過疏水作用結(jié)合，減少EGCG在環(huán)境中的氧化分解。對CS--LG-EGCG納米粒粒徑測定結(jié)果表明，A、B、C、D 4組樣品均形成顆粒且分布較均一，粒徑值在10～100?nm范圍，粒徑均值結(jié)果如表1所示，大部分納米粒粒徑在40?nm左右，B組樣品納米粒的粒徑最小。聚合物分散性指數(shù)（PDI）結(jié)果顯示，A、B、C、D 4組樣品PDI均小于1，表明納米粒分散較為均勻。

2.3 CS-β-LG-EGCG納米粒Zeta電位分析

Zeta電位是指納米粒表面所帶的電荷值，研究表明，Zeta電位絕對值越大，納米粒穩(wěn)定性越強(qiáng)。4組樣品Zeta均值結(jié)果如表1所示。由于-乳球蛋白等電點(diǎn)約為5.18[16]，本研究中所用的制備納米粒緩沖體系的pH為6.5，高于-乳球蛋白等電點(diǎn)[17]。殼聚糖和-乳球蛋白添加比例的不同，會影響納米粒表面靜電力產(chǎn)生的吸附作用，進(jìn)而影響Zeta電位。結(jié)果顯示，B組和C組的Zeta電位絕對值大于30?mV，表明顆粒表面具有較大的靜電斥力作用，能夠防止顆粒之間相互聚集，具有良好的分散性和穩(wěn)定性。

注：圖A—圖D分別為A、B、C、D 4組樣品。紅色箭頭指示為透射電鏡下觀察到的成形顆粒

2.4 CS-β-LG-EGCG納米粒包埋率分析

高效液相色譜檢測結(jié)果如圖2所示，在保留時間10?min左右，A、B、C、D 4組樣品均檢測出EGCG。根據(jù)EGCG標(biāo)準(zhǔn)曲線以及包埋率計算公式，得到A、B、C、D組樣品的包埋率均大于50%（表2），其中B組和D組包埋效果較佳，包埋率分別為73.27%和70.67%。本研究發(fā)現(xiàn)，-乳球蛋白的添加比例可能對包埋率具有一定的影響，即-乳球蛋白的添加量增加，包埋率上升。此外，在加熱條件下，-乳球蛋白二聚體解聚，使內(nèi)部基團(tuán)暴露，促進(jìn)物質(zhì)間交聯(lián)聚合[9]，增強(qiáng)吸附，提高包埋率。

2.5 CS-β-LG-EGCG納米粒在SGF和SIF的釋放率分析

根據(jù)包埋率分析結(jié)果，選擇包埋率最高的B組樣品模擬胃腸環(huán)境消化過程。高效液相色譜檢測結(jié)果如圖3和圖4所示，通過釋放率計算公式計算得到CS--LG-EGCG納米粒中EGCG在SGF和SIF不同時間點(diǎn)的釋放率，并繪制變化曲線（圖5）。結(jié)果顯示，納米粒樣品均有EGCG的釋放，且前期隨著時間的增加，納米粒樣品在SGF和SIF中的釋放率也逐漸增加，但超過3?h后，釋放率下降。此外，納米粒在SGF中的釋放率高于在SIF中的釋放率。由此推測，在pH=1.2的胃液環(huán)境下，EGCG的釋放率在3?h時達(dá)到峰值，過長時間可能會使釋放出的游離EGCG受消化酶、溫度以及酸性環(huán)境的影響而發(fā)生氧化解離，導(dǎo)致含量降低。

表1 CS-β-LG-EGCG納米粒粒徑、Zeta電位均值統(tǒng)計表

注：同列不同字母表示有顯著性差異（<0.05）

Note: Different letters in the same column indicate significant difference (<0.05)

注：圖A—圖D分別為A、B、C、D 4組樣品。折線指出的數(shù)字為HPLC檢測出EGCG的保留時間，下同

2.6 CS-β-LG-EGCG納米粒對糖尿病小鼠的血糖調(diào)控作用

如圖6-A所示，在注射STZ兩周后，半數(shù)小鼠血糖均值超過17?mmol·L-1；4周后，所有建模小鼠血糖值均超過17?mmol·L-1，表明本研究糖尿病小鼠模型建立成功。血糖檢測結(jié)果顯示，在灌胃后1?h，4個處理組的血糖值與diabetes組相比均顯著降低（圖6-C）；灌胃3?h后，處理組血糖開始回升，但仍顯著低于diabetes組（圖6-E）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，灌胃處理后各時間段，CS--LG-EGCG+INS組與INS組相比均未表現(xiàn)出顯著性差異，說明CS--LG-EGCG納米粒對胰島素?zé)o拮抗作用，這與前人研究結(jié)果一致[3]。由圖6-G可知，CS--LG-EGCG+INS組在灌胃后0.5～4?h內(nèi)降低了血糖的比例，并且在2～4?h內(nèi)，對比EGCG+INS組，延緩了血糖的回升；同時，灌胃2?h后顯示，CS--LG-EGCG+INS組血糖值顯著低于EGCG+INS組（＜0.05，圖6-D），結(jié)果也說明了CS--LG-EGCG納米粒對比EGCG具備一定緩釋作用，減少了EGCG的氧化降解，保留了EGCG功效，使其在攝入體內(nèi)長時間后仍具備活性。對EGCG輔助胰島素降血糖功效的作用研究，本研究并未得出顯著性結(jié)果，通過查閱降血糖機(jī)制相關(guān)研究文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，EGCG對血糖的調(diào)節(jié)作用是一個緩慢且長期的過程[18]，或需要長期探索才可能得出相關(guān)結(jié)論。

表2 CS-β-LG-EGCG納米粒包埋率

注：同列不同字母表示有顯著性差異（<0.05）

Note: Different letters in the same column indicate significant difference (<0.05)

注：A、B、C、D分別為模擬胃液1、2、3、4?h樣品結(jié)果

注：A、B、C、D分別為模擬腸液1、2、3、4?h樣品結(jié)果

注：***表示在SGF中，與0?h相比，在P<0.001水平顯著相關(guān)；##和###分別表示在SIF中，與0?h相比，在P<0.01和P<0.001水平顯著相關(guān)

注：A為小鼠注射STZ后檢測時間與達(dá)到糖尿病建模標(biāo)準(zhǔn)的小鼠只數(shù)折線圖；B、C、D、E、F分別為灌胃0.5、1、2、3、4?h后，各組小鼠的血糖值圖；G為糖尿病小鼠血糖變化折線圖。N，正常組；DB，糖尿病組；CβE+INS，納米顆粒和胰島素聯(lián)用組；Cβ+INS，納米粒壁材和胰島素聯(lián)用組；E+INS，EGCG和胰島素聯(lián)用組；INS，胰島素組。通過成對比較，*，**，***分別表示在P<0.05，P<0.01，P<0.001水平顯著相關(guān)

3 討論與結(jié)論

祝宇銘等[19]研究指出，EGCG通過激活下游信號通路AMPK途徑來抑制肝糖異生，通過抑制小腸中-葡萄糖苷酶活性來延緩小腸對糖的消化吸收，對防治糖尿病有一定的積極作用。本研究采取了對糖尿病小鼠灌胃的方式，短時間內(nèi)觀察包埋前后EGCG對小鼠血糖的影響，發(fā)現(xiàn)EGCG對胰島素的吸收不產(chǎn)生顯著影響，且CS--LG-EGCG納米粒減少了EGCG的氧化降解，保留了EGCG功效，使其在攝入體內(nèi)長時間后仍具備活性。EGCG輔助胰島素降血糖功效或許呈劑量及時間依賴性，而CS--LG-EGCG納米粒能否在縮短時間和減少劑量的基礎(chǔ)上，體現(xiàn)同等甚至更佳的降血糖功效，有待進(jìn)一步探究。

本研究以羧甲基殼聚糖、殼聚糖鹽酸鹽、-乳球蛋白為壁材，對EGCG進(jìn)行包埋，制備出結(jié)構(gòu)完整且具有一定分散性的CS--LG-EGCG納米粒。CS--LG-EGCG納米粒包埋率大于50%，且在腸液和胃液中具有緩釋作用，減少了在環(huán)境中的降解，綜合微觀形態(tài)、結(jié)構(gòu)表征以及包埋率情況，按照CHC-EGCG∶V-LG∶CMC為1∶2∶1時得到的納米粒具有相對較好的特性。本研究也表明，CS--LG-EGCG納米粒具有輔助胰島素降血糖的作用，且與胰島素?zé)o拮抗作用；對比未包被的EGCG，其具備的緩釋作用可在一定程度上減緩血糖的回升。

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Preparation of Nanoparticules with Chitosan Complexed-lactoglobulin Loaded EGCG and their Effects on Blood Glucose in Diabetic Mice

CHEN Ke1,2, WANG Yuanzhu1,2, YANG Xiaoying1,3, ZHANG Dongying1,3, ZHU Qiangqiang1,2*

1. Key Laboratory of Pu-erh Tea Science, Ministry of Education, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 2. College of Food Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 3. College of Science, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China

As the main bioactive component in tea, EGCG has abundant physiological functions. However, its low stability makes it easy to be degraded and has low bioavailability. In this experiment, carboxymethyl chitosan (CMC), chitosan hydrochloride (CHC), and-lactoglobulin (-LG) were used as wall materials to encapsulate EGCG. The microscopic morphology of particles were observed through electron microscope microscopic morphological observation, structural characterization (measurement of particle size, Zeta potential). The entrapment efficiency and simulated gastrointestinal fluid release rate were determined by HPLC. Finally, the activities of nanoparticles were explored by measuring the effect of nanoparticles on blood glucose in diabetic mice. The result shows that the prepared CS--LG-EGCG nanoparticles had complete structures, particle size of 10-100?nm, and certain dispersibilities. The entrapment efficiency was greater than 50%, and it had a slow-release effect in intestinal and gastric juices. CS--LG-EGCG nanoparticles had no antagonistic effect with insulin. Compared with uncoated EGCG, the sustained-release effect of the particles can slow down the recovery of blood glucose.

EGCG, chitosan,-lactoglobulin, simulated gastric juice, diabetes

S571.1；R587.1

A

1000-369X(2022)05-731-09

2022-04-11

2022-06-20

云南省基礎(chǔ)研究專項-青年項目（202101AU070084）、云南農(nóng)業(yè)大學(xué)科研啟動基金（KY2019-24）、國家自然科學(xué)基金（31760226）

陳珂，女，碩士研究生，主要從事食品成分與代謝免疫研究，877525918@qq.com。*通信作者：tianjiao125@126.com