梧州茶樹種質(zhì)資源的遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析

王留彬，黃麗蘊，滕翠琴，吳立赟，成浩，于翠平*，王麗鴛*

梧州茶樹種質(zhì)資源的遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析

王留彬1，黃麗蘊2，滕翠琴2，吳立赟1，成浩1，于翠平2*，王麗鴛1*

1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/國家茶樹改良中心，浙江 杭州 310008；2. 梧州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣西 梧州 543003

基于SSR標(biāo)記對梧州六堡鎮(zhèn)群體種和南渡鎮(zhèn)野生大茶樹種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進行了分析，并篩選出用于該種質(zhì)資源鑒別的核心分子標(biāo)記。研究結(jié)果如下：（1）17對SSR引物在供試材料中共擴增得到98個等位基因，每對SSR引物擴增的等位位點為3～8個，平均每個位點5.764?7個等位基因；（2）從17個SSR分子標(biāo)記中篩選出8個核心標(biāo)記組合即可區(qū)分每份種質(zhì)資源；（3）六堡鎮(zhèn)茶樹種質(zhì)資源的平均等位基因數(shù)（A）、基因型數(shù)、基因多樣性（H）、多態(tài)性信息含量（PIC）分別為4.647?1、7.000?0、0.675?4、0.628?3，高于南渡鎮(zhèn)野生大茶樹種質(zhì)資源，與栽培種茶樹群體接近；（4）聚類分析表明，六堡鎮(zhèn)茶樹群體部分種質(zhì)資源單獨聚為一類，部分與云南的大葉種茶樹，少量與浙江、貴州地方栽培種聚為一類；而南渡鎮(zhèn)野生茶樹種質(zhì)資源單獨聚為一類，僅有2個六堡鎮(zhèn)的種質(zhì)材料散落其間。綜上所述，梧州茶樹種質(zhì)資源豐富，遺傳多樣性較高，研究結(jié)果為進一步開發(fā)和利用該資源奠定了基礎(chǔ)。

SSR標(biāo)記；遺傳多樣性；梧州市；茶樹

廣西地處華南地區(qū)，與云南、貴州相鄰地區(qū)被認為是茶樹的次生起源中心，憑借優(yōu)越的生態(tài)和地理條件，蘊含十分豐富的茶樹資源[1]。近年來，廣西茶園面積和茶葉產(chǎn)量增長迅速，2019年，茶園面積為77.3?khm2，茶葉總產(chǎn)量為8.28萬t[2]，2020年，茶園面積達到91.3?khm2，茶葉總產(chǎn)量9.13萬t[3]。課題組前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)廣西梧州市具有較多種類的群體種茶樹資源，伴隨產(chǎn)業(yè)的崛起，六堡茶群體種的重要性越發(fā)凸顯。邱瑞瑾等[4]和覃秀菊等[5]分別研究了梧州市六堡茶群體種資源的分布和葉片顯微結(jié)構(gòu)。滕翠琴等[6]在梧州市南渡鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)了集中成片的野生大茶樹群落，并對其表型特征、生長環(huán)境等進行了調(diào)查。這些獨特的種質(zhì)資源在茶葉生產(chǎn)應(yīng)用、品種創(chuàng)新以及維持物種多樣性等方面具有重要的意義。目前，使用DNA分子標(biāo)記對上述種質(zhì)資源的研究尚少。

SSR分子標(biāo)記作為群體遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析中的有效工具，已在茶樹遺傳學(xué)分析中廣泛使用。如：Tan等[7]使用30對SSR標(biāo)記分析了128份中國主栽無性系茶樹品種間的遺傳關(guān)系，證實了40余對茶樹品種的親子關(guān)系。周斌等[8]利用15對SSR引物對50份雷波縣野生茶樹資源進行了遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，推測雷波地區(qū)附近可能是四川野生茶樹的發(fā)源中心。余書平等[9]使用14對SSR標(biāo)記對浙江開化縣不同種質(zhì)資源進行了分析，發(fā)現(xiàn)開化縣茶樹種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富。本研究通過17對SSR引物，分析了梧州六堡鎮(zhèn)和南渡鎮(zhèn)兩個地區(qū)茶樹種質(zhì)資源遺傳多樣性，篩選出鑒定該種質(zhì)資源的核心SSR標(biāo)記。比較了兩地區(qū)茶樹種質(zhì)資源的遺傳信息和親緣關(guān)系，并與多個栽培種進行比較，旨在解析梧州茶樹種質(zhì)資源的分子遺傳背景，為將來梧州市優(yōu)異資源的收集、保護和科學(xué)利用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

19個無性系栽培（ZP）品種（表1）種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所嵊州基地，分別編號1～19，作為對照品種。以梧州市六堡鎮(zhèn)（LB）大中村（111°22′E，23°48′N）的13個六堡茶群體種資源和梧州市南渡鎮(zhèn)（ND）天龍頂（110°51′E，22°42′N，海拔600～700?m）采集的12個野生大茶樹種質(zhì)資源為試驗材料，梧州市六堡鎮(zhèn)大中村13個六堡茶群體種資源編號為20～32，葉片多樣性較高，大、小葉類均有，以中葉類為主。梧州市南渡鎮(zhèn)天龍頂?shù)?2個野生大茶樹種質(zhì)資源編號為33～44，樹型為喬木型。所用材料詳細信息及編號見表1。

1.2 DNA提取及檢測

DNA的提取使用植物基因組提取試劑盒[DP350，天根生化科技（北京）有限公司]，并使用超微量分光光度計（Nano Drop ND-1000，賽默飛世爾科技公司）檢測DNA濃度和純度，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，對DNA質(zhì)量不高或條帶不清楚的DNA樣品重新提取。將每份樣品DNA稀釋到30?ng·μL-1，放置于–20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 候選SSR引物的PCR擴增

從課題組已設(shè)計的SSR引物中[10]挑選多態(tài)性高、條帶清晰的17對SSR引物（引物序列均已上傳至NCBI）用于本試驗，具體引物信息見表2。PCR反應(yīng)體系：Reaction Mix 5.0?μL（含DNA Polymerase、2×PCR Buffer、MgCl2和dNTP），模板DNA 2.0?μL，Primer-F、Primer-R（10?ng·μL-1）各0.2?μL，加ddH2O至10?μL。PCR循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性4?min；94℃變性30?s，52～58℃退火30 s，72℃延伸30?s，共計35個循環(huán)；72℃延伸10?min；4℃保存。

表1 供試材料信息

1.4 擴增產(chǎn)物的PAGE電泳和銀染顯色

PCR擴增使用垂直電泳儀（CBS MGV-202-33，電壓120?V，時間90?min）進行10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），具體配制方法參照文獻[11]。電泳結(jié)束后進行銀染顯色，并用保鮮膜將膠片保存，拍照記錄。

1.5 數(shù)據(jù)處理

將電泳圖中位于目的片段范圍內(nèi)的清晰條帶，依據(jù)分子量大小依次記作A、B、C、D……，因條帶大小不同，基因型分別記錄為AA、AB、BB、AC、AD、CD等（單一條帶為純合基因型，兩個條帶為雜合基因型），條帶缺失記為“-”，計入Excel表，建立起原始基因型數(shù)據(jù)矩陣。利用GenAlEx 6.5.0.3軟件[12]進行基因頻率、雜合度、標(biāo)記鑒別力等一系列遺傳參數(shù)的運算。具體方法參照文獻[9]處理方法。根據(jù)樣本的基因型數(shù)據(jù)，將其轉(zhuǎn)換成PowerMarker v3.25軟件[13]要求的數(shù)據(jù)格式?；凇癗ei.1983”計算樣本間的遺傳距離并進行UPGMA進化樹構(gòu)建。使用FigTreev1.2.4軟件繪制UPGMA進化樹。

表2 17對SSR引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 44份茶樹種質(zhì)SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

本研究使用的17對引物呈現(xiàn)出較高水平的多態(tài)性（表3）。除3對引物（CsFM1051、CsFM1839、CsFM1562）擴增目的片段的成功率較低外，其余引物幾乎均能在所有樣品中成功擴增出目的片段?？傮w來看，17對SSR引物共獲得98條等位基因，每對SSR引物擴增出的等位位點為3～8個，平均每個位點檢測到5.764?7個等位基因，平均有效等位位點數(shù)為3.772?2個。在這些SSR分子標(biāo)記中，CsFM1076擴增出的等位基因最少，僅3個。引物CsFM1131、CsFM1801、CsFM1585、CsFM1651、CsFM1715擴增的等位基因為7～8個，這5對引物的有效位點（Ne）均超過4個，說明它們在樣品中擴增多態(tài)性較好，具有較強的鑒別能力。17對引物擴增位點的多態(tài)性信息含量（PIC）為0.315?7～0.803?9，平均值為0.655?1，也說明本研究選用的SSR引物多態(tài)性較好。

2.2 標(biāo)記的鑒別能力

對基因分型數(shù)據(jù)進行復(fù)合位點分析，非同一概率值（PE）使用GenAlEx 6.5.0.3軟件分析得到。結(jié)果如表4所示，17個SSR位點的PE-1值范圍在0.172?8～0.654?7，平均值為0.478?2；PE-2值的范圍在0.062?7～0.481?5，平均值為0.312?2；PE-3的范圍為0.285?9～0.830?6，平均值為0.651?3。如圖1所示，當(dāng)17個SSR位點組合后，2個隨機樣本基因型組合不同的PE-1為1.000?0；若缺失1個位點和去除1個純合位點時，2個隨機樣本基因型組合不同的概率PE-2和PE-3分別為0.998?7和1.000?0，該結(jié)果表明本研究選用的標(biāo)記多態(tài)性較高，用17個SSR標(biāo)記完全可以鑒定出所選用的每一份種質(zhì)材料。

表3 17對SSR標(biāo)記的遺傳參數(shù)

研究結(jié)果顯示，選用的SSR標(biāo)記增多（圖1），其PE值顯著增加，材料的鑒定準確性亦顯著提高。數(shù)據(jù)顯示當(dāng)選用8個核心標(biāo)記時，PE-1、PE-2、PE-3分別超過了0.99、0.96、0.99，即可成功鑒別出每一份材料，因此將PE值排名最高的8個標(biāo)記作為鑒定該種質(zhì)資源的核心標(biāo)記，分別是CsFM1828、CsFM1715、CsFM1131、CsFM1068、CsFM1599、CsFM1801、CsFM1585、CsFM1651。

2.3 2個不同地區(qū)茶樹群體的遺傳多樣性

梧州的六堡鎮(zhèn)大中村和南渡鎮(zhèn)云龍頂相距約133?km。為探明兩地茶樹種質(zhì)資源遺傳多樣性與遺傳距離的差異，本研究將上述二地取樣采集的茶樹資源分別作為單獨群體，并以19個栽培品種作為對照，進行遺傳多樣性分析。結(jié)果顯示（表5），六堡鎮(zhèn)茶樹群體平均等位基因數(shù)為4.647?1個，基因型數(shù)為7.000?0，基因型多樣性為0.675?4，雜合度為0.664?7，多態(tài)性信息含量為0.628?3。六堡鎮(zhèn)茶樹群體的平均等位基因、基因型數(shù)、基因多樣性和多態(tài)性信息含量均接近于栽培種。南渡鎮(zhèn)野生茶樹群體的平均等位基因數(shù)（4.294?1）、基因型數(shù)（5.823?5）、基因多樣性（0.600?9）、多態(tài)性信息含量（0.558?0）均小于六堡鎮(zhèn)茶樹群體，僅雜合度（0.664?9）略高于六堡鎮(zhèn)茶樹群體。

基于群體之間的遺傳距離（表6），利用UPGMA聚類分析發(fā)現(xiàn)，六堡鎮(zhèn)茶樹群體與栽培種遺傳距離最近為0.129?3，被聚為一類；南渡鎮(zhèn)的野生茶樹群體與他們的遺傳距離較遠（圖2）。由此表明六堡鎮(zhèn)茶樹群體與栽培種親緣關(guān)系較近，南渡鎮(zhèn)茶樹群體與六堡鎮(zhèn)茶樹群體、栽培種均有一定的遺傳距離，這與南渡鎮(zhèn)的茶樹群體是野生大茶樹的研究結(jié)果相一致。

表4 17個SSR數(shù)據(jù)的PE值

注：PE-1表示位點未缺失時的PE值，PE-2表示缺失1個位點時的PE值，PE-3表示去除1個純合位點的PE值。下同

Note: PE-1 represents PE value when one of locus is missing, PE-2 represents PE value when one locus is missing, PE-3 represents PE value when one of homozygous locus is removed. The same below

圖1 不同標(biāo)記組合數(shù)的PE值

表5 3個茶樹群體的遺傳多樣性分析

注：LB，六堡鎮(zhèn)茶樹群體；ND，南渡鎮(zhèn)茶樹群體；ZP，栽培種。下同

Note: LB, Tea plant populations in Liubao town. ND, Tea plant populations in Nandu town. ZP, Cultivar. The same below

表6 3個茶樹群體的遺傳距離

圖2 3個茶樹群體UPGMA聚類圖

2.4 茶樹種質(zhì)資源個體間的聚類分析

為進一步了解梧州市茶樹種質(zhì)資源的遺傳學(xué)地位，根據(jù)17對SSR引物擴增數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果，基于Nei's遺傳距離，采用UPGMA法聚類得到茶樹聚類樹狀圖，將茶樹資源大致分為5個類群（圖3）。其中類群1主要是六堡鎮(zhèn)的LP2、LP3、LP4、LP5，說明它們具有較為相近的遺傳背景。類群2主要為茶樹栽培種，迎霜是福鼎大白茶和云南大葉種的雜交子代，它們具有親緣關(guān)系[14]，在本研究中聚在一類。類群3由部分六堡鎮(zhèn)的種質(zhì)資源和幾個栽培種聚類而成，如LP9、LP1、LP8和大葉種的紫娟、英紅1號、英紅9號。類群4中，LP11、LP12和云抗10號，LP6、LP7、黔眉419和中黃1號分別聚在一類。類群5主要是來自南渡鎮(zhèn)的野生大茶樹，僅有2個六堡鎮(zhèn)的LP10、LP13和南渡鎮(zhèn)群體聚在一類。

3 討論

3.1 梧州茶樹種質(zhì)資源的遺傳多樣性

茶樹種質(zhì)資源及遺傳育種研究以遺傳多樣性為基礎(chǔ)，茶樹的遺傳多樣性研究已從最早的形態(tài)學(xué)標(biāo)記轉(zhuǎn)變?yōu)榉肿訕?biāo)記[15]。SSR分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛使用在茶樹遺傳多樣性及種質(zhì)鑒定研究等方面[9]。徐禮羿等[16]使用8個核心SSR標(biāo)記即可成功識別200份以上的茶樹種質(zhì)資源。本研究使用的17對標(biāo)記即部分來源于上述SSR標(biāo)記，部分來源于Tan等[7]開發(fā)的SSR標(biāo)記，選取的17對引物均具有多態(tài)性。基于復(fù)合位點的非同一性分析發(fā)現(xiàn)，選用8個核心SSR標(biāo)記組合時，便可實現(xiàn)對本研究的44份材料的準確識別。多態(tài)性信息量（PIC）為評價引物多態(tài)性的重要指標(biāo)，當(dāng)PIC>0.5時，該位點為高度多態(tài)位點；當(dāng)0.25＜PIC≤0.5時，該位點為中度多態(tài)位點；當(dāng)PIC≤0.25時，該位點為低度多態(tài)位點[17]；本研究使用的引物平均PIC為0.655?1，PIC>0.5的有14對，占總引物的82.35%；其余3對引物為0.25＜PIC≤0.5，說明篩選的SSR標(biāo)記具有較高的多態(tài)性，可較好地應(yīng)用于茶樹遺傳圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析等研究。

本研究以梧州市六堡鎮(zhèn)群體種和南渡鎮(zhèn)野生大茶樹的種質(zhì)為研究材料，通過DNA分子標(biāo)記和聚類分析較為全面地研究了兩地茶樹資源的遺傳多樣性水平和親緣關(guān)系。目前針對上述種質(zhì)資源的研究較少，僅有周炎花等[18]選取了數(shù)個六堡鎮(zhèn)茶樹品種進行了研究，發(fā)現(xiàn)其遺傳多樣性較高。本研究發(fā)現(xiàn)六堡鎮(zhèn)茶樹群體種遺傳多樣性豐富（H：0.675?4，PIC：0.628?3），甚至超過栽培品種（H：0.665?0，PIC：0.617?8），這與本研究調(diào)查的六堡鎮(zhèn)茶樹群體表型特征多樣性相符合；在聚類分析中，4個六堡鎮(zhèn)群體種（LP2、LP3、LP4、LP5）單獨聚為類群1，推測它們具有獨特的遺傳背景。以上結(jié)果表明，六堡鎮(zhèn)群體種遺傳多樣性豐富，具有優(yōu)異資源選育的潛力。

圖3 茶樹種質(zhì)資源聚類分析

滕翠琴等[6]通過對野生大茶樹的資源調(diào)查，發(fā)現(xiàn)南渡鎮(zhèn)的野生大茶樹是梧州市內(nèi)面積最大的野生茶樹資源。我們將從該地收集到的12個種質(zhì)資源單獨分析，發(fā)現(xiàn)其遺傳多樣性水平（H：0.600?9，PIC：0.558?0）接近云南茶樹資源的遺傳多樣性水平（H：0.609，PIC：0.578），高于四川茶樹資源的遺傳多樣性水平（H：0.525，PIC：0.492）[19]，且雜合度（He：0.664?9）高于云南西雙版納地區(qū)野生茶樹的雜合度（He：0.353）[20]。據(jù)此推斷南渡鎮(zhèn)野生大茶樹的遺傳多樣性較高，具有非常重要的利用價值，為深入研究該地區(qū)野生大茶樹提供了良好的種質(zhì)資源。該地區(qū)野生大茶樹的起源、分類是有待今后進一步探究的科學(xué)問題。

3.2 梧州市茶樹種質(zhì)資源的親緣關(guān)系分析

基于Nei′s遺傳距離，本研究中的44份供試茶樹種質(zhì)資源被分為5個類群，其中六堡鎮(zhèn)茶樹群體在5個類群中均有分布。如在類群3中，LP9、LP1、LP8、紫娟、英紅1號和英紅9號聚在了一起。在類群4中LP11、LP12和云抗10號聚在一起。紫娟和云抗10號均是大葉種茶樹品種[14]，英紅1號和英紅9號是由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院從云南省大葉種種質(zhì)資源（）中選育出來的茶樹品種，同屬于大葉種茶樹品種[21]。在形態(tài)調(diào)查中也發(fā)現(xiàn)LP9、LP1、LP8、LP11、LP12具有大葉種茶樹品種的表型特征，表明它們具有一定的親緣關(guān)系。在其他類群中，六堡鎮(zhèn)茶樹群體與浙江、貴州等地的中小葉栽培種茶樹具有較近的親緣關(guān)系。

聚類分析結(jié)果表明，南渡鎮(zhèn)天龍頂野生古茶樹群體單獨聚在一起，并與六堡鎮(zhèn)的茶樹種質(zhì)資源和栽培種茶樹具有一定的遺傳距離，這與前人研究結(jié)果一致[22-23]。在個體聚類分析中，僅有來自六堡鎮(zhèn)的LP10、LP13和南渡鎮(zhèn)的天龍頂野生古茶樹聚在了一起。這些研究結(jié)果表明野生種與栽培茶樹品種在親緣關(guān)系上存在較大的差異性。周斌等[8]同樣發(fā)現(xiàn)雷波野生茶樹與栽培種在親緣關(guān)系上存在較大差異。前人的研究表明，基因交流是導(dǎo)致居群間茶樹種質(zhì)資源遺傳分化的主要原因，長期的基因交流，會導(dǎo)致茶樹資源分化程度較低，遺傳多樣性下降[24]。從本研究的結(jié)果看，南渡鎮(zhèn)野生大茶樹與六堡鎮(zhèn)茶樹群體、栽培種親緣關(guān)系都差異較大，說明群體之間的基因交流較少，仍存在一定程度的分化。南渡鎮(zhèn)野生大茶樹群落周圍樹林密布，環(huán)境復(fù)雜，而茶樹主要依靠昆蟲授粉[23]，推測復(fù)雜的環(huán)境和地理距離使該野生大茶樹群落內(nèi)長期自交。這有可能是該群體遺傳多樣性低于六堡鎮(zhèn)茶樹群體和栽培種遺傳多樣性的原因。

3.3 梧州市茶樹種質(zhì)資源的保護

本研究表明，梧州市茶樹種質(zhì)資源豐富，遺傳多樣性高，具有非常重要的利用價值。如六堡鎮(zhèn)的部分茶樹種質(zhì)和南渡鎮(zhèn)野生茶樹資源與栽培種茶樹親緣關(guān)系較遠，使用該群體的材料與栽培種茶樹進行雜交育種可能會產(chǎn)生較好的雜種優(yōu)勢[25]，這在茶樹品種多樣性方面具有積極的作用。此外由于市場需求，野生茶價格日益增高，導(dǎo)致對野生茶樹過度和破壞性采摘，從而影響野生茶樹資源的遺傳多樣性和種群規(guī)模。因此，需要進一步對梧州市內(nèi)的茶樹種質(zhì)資源進行保護，如對該地區(qū)的野生優(yōu)質(zhì)資源進行扦插擴繁種植，建立資源圃持久保存等。

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Genetic and Phylogenetic Analysis for Germplasm Resources offrom Wuzhou City

WANG Liubin1, HUANG Liyun2, TENG Cuiqin2, WU Liyun1, CHENG Hao1, YU Cuiping2*, WANG Liyuan1*

1. National Centre for Tea Improvement, Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 2. Wuzhou Institute of Agricultural Science, Wuzhou 543003, China

Based on the SSR markers, the genetic diversity and genetic relationship of the germplasm resources of tea plants from Liubao town and Nandu town were fully analyzed in this study. The core molecular markers for the efficient identification of these germplasm resources were successfully screened. The main results show that: (1) 98 alleles were amplified from 17 pairs of SSR primers, and each pair of SSR primers amplified 3-8 alleles, with an average of 5.764?7 alleles per locus. (2) Totally 8 core markers were selected from 17 SSR markers to distinguish each germplasm resource. (3) The average number of alleles (4.647?1), genotypes per marker (7.000?0), genetic diversity (0.675?4), and the polymorphic information content (0.628?3) of native tea trees in Liubao town were higher than wild tea trees in Nandu, and close to the cultivated population. (4) Cluster analysis shows that the majority germplasm resources from Liubao town were clustered together except for several tea plants grouped with large-leaf tea cultivars from Yunnan province and a few resources were grouped into the same cluster with tea cultivars from Zhejiang and Guizhou provinces. The wild tea germplasm resources from Nandu town were grouped into the same cluster with two germplasm materials from Liubao town.In conclusion, it was showed that there are rich tea germplasmresources with high genetic diversity in Wuzhou city. This study might lay a solid foundation for the further studies to develop and utilize these tea resources.

SSR marker, genetic diversity, Wuzhou city,

S571.1

A

1000-369X(2022)05-601-09

2022-03-23

2022-06-13

財政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-19）、浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育重大專項（2021C02067-7）、創(chuàng)新驅(qū)動發(fā)展專項（桂科AA20302018-5）

王留彬，男，博士研究生，主要從事茶樹種質(zhì)資源與育種研究。*通信作者：yucp2018@163.com；wangly@tricaas.com