有機管理模式對茶園土壤真菌群落結構及功能的影響

王峰，陳玉真，吳志丹，尤志明，余文權，俞曉敏，楊貞標,5*

有機管理模式對茶園土壤真菌群落結構及功能的影響

王峰1,2,3，陳玉真2，吳志丹2，尤志明2，余文權4，俞曉敏3，楊貞標3,5*

1. 福建農林大學園藝學院，福建 福州 350002；2. 福建省農業(yè)科學院茶葉研究所，福建 福州 350012；3. 福建農林大學海峽聯(lián)合研究院園藝植物生物學及代謝組學研究中心，福建 福州 350002；4. 福建省農業(yè)科學院，福建 福州 350013；5. 美國加利福利亞大學河濱分校，加利福尼亞州 河濱 92506

以兩種不同管理方式（常規(guī)和有機種植）和3個坡位（上、中、下坡位）表層土壤（0～20?cm）為研究對象，通過野外調查、高通量測序、功能預測結合分子生態(tài)網(wǎng)絡分析，研究管理方式和坡位對土壤真菌群落結構、功能特征和共發(fā)生網(wǎng)絡的影響。研究結果表明，管理方式和坡位對土壤真菌多樣性指數(shù)影響不顯著，且不存在交互作用。在門水平，管理方式及不同坡位樣地的優(yōu)勢真菌均為子囊菌門、擔子菌門和被孢霉門，管理方式沒有改變土壤優(yōu)勢真菌的種類，但影響其相對豐度。主坐標分析（PCoA）顯示，管理模式導致茶園土壤真菌群落組成發(fā)生明顯改變，常規(guī)管理方式下不同坡位之間的土壤真菌群落結構有顯著差異（<0.05），而有機種植下不同坡位之間無顯著差異（>0.05）。組間群落差異分析（LEfSe）表明，37個差異物種對管理方式非常敏感，不同管理方式富集了不同的真菌類群。共現(xiàn)性網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)，有機茶園土壤真菌網(wǎng)絡節(jié)點數(shù)、平均聚類系數(shù)、邊數(shù)、網(wǎng)絡中心性和網(wǎng)絡密度均明顯高于常規(guī)茶園，說明其生態(tài)網(wǎng)絡結構更為復雜。不同處理茶園土壤真菌以腐生營養(yǎng)型為主（66.67%～70.18%），有機茶園土壤中內生-垃圾腐生-土壤腐生-未定義腐生真菌、木材腐生真菌和動物病原-內生-植物病原-未定義腐生真菌的豐度顯著高于常規(guī)茶園，而未定義腐生真菌、植物病原真菌和動物病原-植物病原-未定義腐生真菌的豐度則顯著降低。相關性分析和冗余分析結果表明，土壤全磷、有效磷、全鉀、有機質、陽離子交換量和pH值是影響茶園土壤真菌群落結構的主要因子。綜上所述，有機管理方式對茶園土壤真菌群落結構產生顯著影響，提高了土壤有益真菌的數(shù)量（被孢霉屬），增強了土壤真菌網(wǎng)絡穩(wěn)定性和抗干擾能力，降低了病原真菌的豐度（如擬盤多毛孢屬和假擬盤多毛孢屬等），具有良好的生態(tài)環(huán)境效應。

管理方式；坡位；真菌群落結構；共現(xiàn)性網(wǎng)絡分析；FUNGuild功能預測

茶樹（L.）是多年生葉用經濟作物。近年來，在鄉(xiāng)村產業(yè)扶貧政策推動下，我國茶園面積持續(xù)增加，各地區(qū)茶葉總產量和產值創(chuàng)歷史新高，茶產業(yè)成為山區(qū)精準扶貧、帶動農戶增收、促進農民就業(yè)等方面的支柱產業(yè)[1]。然而，由于采用單一化的種植模式，受長期頻繁耕作、噴藥、化肥施用等田間管理因素的影響，從幼齡茶園向成齡、老齡茶園演化過程中茶園土壤理化性質發(fā)生一系列變化[2-5]，從而很大程度上影響了茶園土地生產力、茶葉產量及品質[6-8]。王海斌等[9]發(fā)現(xiàn)，植茶過程中土壤中酸類物質不斷積累促使酸化程度加劇，土壤養(yǎng)分循環(huán)和抗氧化的酶活性降低，土壤微生物種群結構與功能呈現(xiàn)單一化趨勢。Arafat等[10-11]發(fā)現(xiàn)，由于茶園長期單一栽培，茶園土壤pH下降和酚類物質（兒茶素及其衍生物）積累導致土壤有益微生物（鞘氨醇單胞菌、芽孢桿菌和普雷沃氏菌等）相對豐度明顯降低。對連作地新種茶樹生理特性的分析也表明，連作能夠顯著抑制鐵觀音茶苗的生長和生理指標，證實了茶樹連作障礙現(xiàn)象的存在[12]。Yang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，茶葉品質的季節(jié)性變化與土壤真菌多樣性密切相關，其中兒茶素與真菌多樣性呈正相關，總氨基酸和茶氨酸與真菌多樣性呈負相關，表明土壤真菌多樣性有可能作為茶葉品質的生物學指標。Tang等[14]研究也發(fā)現(xiàn)，長期施氮條件下，茶園土壤真菌多樣性與茶葉產量呈負相關，應重視木質素和纖維素分解等真菌在茶園的養(yǎng)分循環(huán)和有機質分解中的作用，以利于茶樹生長。由此可見，長期傳統(tǒng)管理方式下茶園土壤理化性質及土壤微生物環(huán)境的變化可能是導致茶樹連作障礙的主要原因。

真菌在農業(yè)土壤中廣泛存在，其作為土壤動植物殘體的分解者、互惠者或病原體調節(jié)著土壤養(yǎng)分循環(huán)、有機質形成與分解、土壤肥力保持、動植物殘體分解和抑制病蟲害等重要的土壤生物學過程[15-16]，也是衡量土壤生態(tài)系統(tǒng)功能和作物生產力的重要指標[17]。有研究表明，真菌群落結構通常會因農業(yè)管理模式改變而發(fā)生變化[18]，長期傳統(tǒng)管理方式在很大程度上導致土壤真菌多樣性降低[19]。有機種植體系通過對土壤理化性質的逐步改善為土壤真菌的繁殖提供了適宜的營養(yǎng)環(huán)境，進而提高土壤真菌數(shù)量、活性及多樣性[20-21]，并且可以抑制土壤致病菌的生長[22]。然而，因地理氣候、種植時間、有機肥來源、輪作及有機物覆蓋措施的差異，有機管理方式對土壤真菌的影響并非都是正效應，甚至由于不恰當?shù)亩逊屎褪┯眯笄萦袡C肥可能導致土壤中一些致病菌增加[23-24]。因此，研究不同地區(qū)、不同耕作類型土壤真菌群落結構對管理方式的響應具有重要意義。

以往研究表明，按照有機農業(yè)生產規(guī)程管理，有機茶園土壤養(yǎng)分、微生物數(shù)量和微生物生物量碳明顯增加[25-26]，有機種植能夠促進茶園土壤肥力的良性循環(huán)。然而，茶園土壤真菌群落結構和功能對有機管理方式的響應規(guī)律并不明晰。另外，福建省大多數(shù)茶園是山坡地開墾而來，不同坡面養(yǎng)分在降雨侵蝕過程中的再分配引起土壤理化性質的改變[27]，從而導致土壤微生物群落發(fā)生改變。在此背景下，本研究以相鄰常規(guī)茶園（對照）和有機茶園為對象，基于高通量測序技術、FUNGuild功能預測和分子生態(tài)網(wǎng)絡構建，分析兩種管理方式下茶園土壤真菌多樣性、群落組成及功能沿坡位的變化趨勢，探討其不同坡位上的差異及影響因素，以期為合理評估有機茶園的環(huán)境效益提供基礎數(shù)據(jù)，也可為有機茶園進一步推廣和應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)域位于福建省武夷山市中遠生態(tài)茶業(yè)有限公司茶葉種植基地（117°56' E，27°34' N），該基地茶園為典型的丘陵山地茶園，海拔435?m。研究區(qū)屬于亞熱帶季風氣候區(qū)，全年平均日照時數(shù)1?629?h，年平均氣溫18.2℃，相對濕度70%～85%，年平均降水量1?926.9?mm，降雨集中在每年3月至6月?；貎炔鑸@分常規(guī)茶園和有機茶園兩種類型，均由原生林地開墾而來，坡度為22°，土壤類型為花崗巖母質發(fā)育的紅壤。茶樹品種均為肉桂，種植時間為2000年，雙條行種植，株距40?cm。常規(guī)茶園為大宗機采茶園（采摘輪次為每年春、夏和秋3次），每年施復合肥（以N、P2O5、K2O的質量比為15∶15∶15計）2?250?kg·hm-2，施肥方式為撒施，按照春季追肥期（2月底至3月初）、秋季追肥期（8月中旬至9月初）和冬季基肥期（12月底至次年1月初）3∶3∶4比例施入，梯壁除草，病蟲害防治以化學防治為主。有機茶園按照有機管理方式進行，每兩年施用豆粕餅肥2?250?kg·hm-2，梯壁留草。常規(guī)茶園和有機耕作茶園中間種植杉木保護行。

1.2 土壤樣品采集與處理

在野外實地調查的基礎上，選取同一坡面的常規(guī)茶園（Conventional tea garden，CTG）和有機茶園（Organic tea garden，OTG）作為研究樣地，每種類型茶園從山頂?shù)缴侥_分別在上坡位、中坡位、下坡位各設置3個典型樣方（10?m×10?m），以保證樣方的代表性，共計18個樣方。上坡位距離坡頂約10?m，3個坡位之間各相距約30～50?m，采樣時間為2021年3月。每個樣方按多點混合法取樣，5個采樣點分別位于茶行中線位置、茶行兩邊滴水線和茶行中間，混合為1個土樣。采樣時同步用容積為100?cm3的環(huán)刀采集原狀土樣，用于測定土壤容重。去除可見植被根及小石塊后，將樣品裝入滅好菌的自封袋中，迅速放入盛有冰袋的保溫箱帶回實驗室。部分樣品過2?mm篩后保存于–80℃冰箱，用于土壤微生物多樣性分析，其余樣品自然風干后進行土壤理化性質分析。

1.3 土壤理化性質測定

土壤理化性質測定方法參見《土壤農業(yè)化學分析方法》[28]。土壤pH值采用pH計（pHS-25型）測定，取10?g土壤與超純水以1∶2.5比例混勻并靜置30?min，取上清液測定pH；土壤有機質（Soil organic matter，SOM）采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法；土壤全氮（Total nitrogen，TN）含量采用凱氏定氮法；土壤全磷（Total phosphorus，TP）采用氫氧化鈉堿熔-鉬銻抗比色法；土壤全鉀（Total potassium，TK）采用NaOH熔融-火焰光度計法；土壤堿解氮（Alkaline-N，AN）采用堿解擴散法；土壤速效磷（Available phosphorus，AP）采用0.5?mol·L-1NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法；土壤速效鉀（Available potassium，AK）用乙酸銨浸提（1?mol·L-1）-火焰光度計法；土壤陽離子交換量（Soil cation exchange capacity，CEC）采用乙酸銨法；土壤容重（Soil bulk density，BD）采用環(huán)刀法。

1.4 土壤微生物DNA提取和ITS高通量測序

稱取0.5?g新鮮土壤樣品，采用土壤DNA提取試劑（Fast DNA? Spin Kit for Soil，USA）進行提取，提取過程參照說明書進行。提取的DNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品質量，用NanoDrop 2000超微量分光光度計檢驗DNA的濃度和純度，稀釋合格后的樣品保存于–80℃冰箱用于PCR擴增。真菌選用ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）進行擴增。擴增體系為20?μL反應體系：2?μL的10×Buffer，2?μL的dNTPs（2.5?mmol·L-1），0.8?μL的Forward Primer（5?μmol·L-1），0.8?μL的Reverse Primer（5?μmol·L-1），0.2?μL的rTaq Polymerase，0.2?μL的牛血清白蛋白（BSA）和10?ng的模板DNA，補dd H2O至20?μL。擴增條件為：95℃預變性3?min；95℃ 30?s，55℃ 30?s，72℃ 45?s，35個循環(huán)；72℃延伸10?min，10℃直到反應完成。采用Illumina Miseq高通量測序平臺測定代表真菌ITS序列，委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成測序工作。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

MiSeq測序得到的是雙端序列數(shù)據(jù)，首先根據(jù)PE reads之間的overlap關系，將成對的reads拼接（merge）成一條序列，同時對reads的質量和merge的效果進行質控過濾，利用FLASH軟件（Version 1.2.11）根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列，并校正序列方向。質控后獲得的有效數(shù)據(jù)，采用Uparse軟件（version 7.0.1090，http://drive5.com/uparse）按照97%相似性對非重復序列（不含單序列）進行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列。采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，并分別在各分類水平上對每個樣本的群落物種組成進行統(tǒng)計，真菌數(shù)據(jù)庫參考Unite數(shù)據(jù)庫（Release 8.0，http://unite.ut.ee/index.php）。使用QIIME軟件（Version 1.9.1）計算真菌Sbos、Chao1、Shannon、Simpson、ACE指數(shù)以及多樣性距離矩陣，使用R語言（Version 3.3.1）vegan軟件包進行主坐標分析（PCoA）和作圖，研究樣本群落組成的相似性或差異性。采用LEfSe軟件根據(jù)分類學組成對樣本按照不同的分組條件進行線性判別分析（LDA），找出對樣本劃分產生顯著性差異影響的物種（Biomarker），LDA Score的篩選值設置為3.5。土壤真菌群落結構與土壤理化性質之間的相關性采用冗余分析（Redundancy analysis，RDA），采用R語言vegan包進行分析和作圖。利用FUNGuild軟件（Version 1.0）將高通量測序獲得的真菌標志基因（marker）序列信息與已知真菌功能注釋數(shù)據(jù)庫進行比對[29]。下載運行結果后對結果進行篩選，為了提高真菌功能群的可信度，只保留置信度“極可能”（highly probable）和“很可能”（probable）兩個等級。不同處理方差分析（ANOVA）、多重比較（Duncan′s test）及相關分析用SPSS 19.0軟件完成。在美吉云平臺進行共現(xiàn)性網(wǎng)絡分析（NetworkX），采用Spearman correlation（>0.7）分析方法，保留<0.05的相關OTU構建關聯(lián)網(wǎng)絡。

2 結果與分析

2.1 茶園土壤真菌群落α多樣性

通過對18個土壤樣本中真菌ITS基因的高通量測序得到990?365條有效序列，平均長度為239.97?bp。在97%的相似度下進行OTU聚類，18個土壤樣品共獲得2?449個真菌OTU，各樣本的覆蓋率指數(shù)（Coverage）均在99.80%以上（表1）。從物種稀釋曲線可以看出（圖1），絕大多數(shù)樣品的稀釋曲線先快速上升而后轉變?yōu)榫徛厣仙?，表明本研究的測序深度適宜，能夠代表土壤真菌群落組成信息。

樣品的多樣性分析結果顯示（表1），管理方式和坡位對茶園土壤真菌多樣性影響較小?？傮w而言，在坡位尺度上，常規(guī)茶園土壤真菌多樣性大多以上坡位最大，中坡位次之，下坡位最低，有機茶園土壤真菌α多樣性變化趨勢則相反。同一坡位，有機茶園中坡位和下坡位土壤真菌多樣性均高于常規(guī)茶園（中坡位的Shannon指數(shù)除外），上坡位則表現(xiàn)為常規(guī)茶園大于有機茶園。雙因素方差分析結果表明，種植方式和坡位對土壤真菌多樣性指數(shù)影響不顯著，且不存在交互作用。

2.2 茶園土壤真菌群落組成及差異物種

2.2.1 土壤真菌群落組成

各樣地茶園土壤真菌OTUs可劃分為14個門、55個綱、136個目、312個科和659個屬。根據(jù)圖2-a，在門水平上，茶園土壤真菌主要包含子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota），其相對豐度分別占31.20%～68.41%、13.09%～36.98%和3.36%～51.33%，占到所有真菌總數(shù)的84.11%～95.62%。與常規(guī)茶園相比，有機管理方式茶園土壤中被孢霉門和羅茲菌門（Rozellomycota）的相對豐度分別顯著提高了749.99%和59.84%（＜0.05），子囊菌門和擔子菌門的相對豐度顯著降低了27.54%～50.06%（＜0.05）。在屬水平上（圖2-b），相對豐度較高（>1%）的為被孢霉屬（）、沙蜥屬（）、青霉菌屬（）、雙擔菌屬（）、籃狀菌屬（）、假黑粉霉屬（）、木霉屬（）、鐮刀屬（）和白杯絲座孢屬（）。常規(guī)茶園中土壤真菌屬水平相對豐度前三位的分別是沙蜥屬（19.18%）、雙擔菌屬（7.68%）和青霉菌屬（6.98%），有機茶園中土壤真菌屬水平相對豐度前三位的分別是被孢霉屬（34.29%）、沙蜥屬（9.11%）和g__unclassified_k__Fungi（5.48%）。與常規(guī)茶園相比，有機茶園土壤中被孢霉屬、短梗蠕孢屬（）和unclassified_f__Microascaceae相對豐度極顯著增加（<0.01），青霉菌屬、雙擔菌屬、籃狀菌屬、假黑粉霉屬、木霉屬、白杯絲座孢屬和unclassified_o__Chaetothyriales的相對豐度極顯著降低（<0.01）。

注：CTGU、CTGM、CTGL分別表示常規(guī)茶園上、中、下坡位樣本，OTGU、OTGM、OTGL分別表示有機茶園上、中、下坡位樣本

表1 管理方式和坡位對茶園土壤真菌α多樣性的影響

注：U，上坡位；M，中坡位；L，下坡位。不同大寫字母表示不同管理方式之間的差異，不同小寫字母表示坡位之間的差異（<0.05）；M×S表示管理方式和坡位交互效應

Note: U, upper slope. M, middle slope. L, lower slope. Different capital letters indicate significant differences between different management practices at the same slope position at the 0.05 level. Different lowercase letters indicate significant differences between different slope positions under the same management practice at the 0.05 level. M×S for joint effect of planting pattern and slope position

2.2.2 土壤真菌多樣性

土壤真菌多樣性用來比較不同環(huán)境條件下真菌群落結構的差異性，基于Bray-Curtis距離算法的PCoA分析可用來研究樣本群落組成的相似性或差異性。由圖3-a可知，常規(guī)管理方式和有機管理方式茶園土壤中的真菌群落結構明顯不同（2=0.444?4；=0.001）。在常規(guī)管理方式茶園中，不同坡位之間的樣品能夠明顯區(qū)分（2=0.689?4；=0.005）（圖3-b）；在有機管理方式茶園中，上坡位和中坡位的茶園土壤樣品較為緊密地聚集在一起，且明顯與下坡位樣品分開（圖3-c）。置換多元方差分析（PERMANOVA）結果表明（表2），不同管理方式土壤真菌群落達到極顯著的差異（<0.01），而不同坡位土壤真菌群落無顯著差異（>0.05），管理方式可以解釋真菌群落41.75%的差異，坡位可以解釋真菌群落12.80%的差異，管理方式對茶園土壤真菌群落結構的影響更大。

圖2 門（a）和屬（b）水平上土壤樣本真菌群落組成

注：a）以不同管理方式分組，b）常規(guī)茶園不同坡位分組，c）有機茶園不同坡位分組

表2 置換多元方差分析結果

2.2.3 土壤真菌LEfSe分析

LEfSe分析中，本研究選擇LDA Score大于3.5的差異物種進行進化分枝圖和柱狀圖展示（圖4），其中常規(guī)茶園和有機茶園分別有16種和21種。常規(guī)茶園土壤中富集的真菌主要包括子囊菌門、擔子菌門和毛霉門（Mucoromycota）的一些物種（圖4-a），如子囊菌門中的散囊菌綱（Eurotiomycetes）、刺盾炱目（Chaetothyriales）、小蔓毛殼科（Herpotrichiellaceae）、梨孢霉屬、、Sporocadaceae、頂多毛孢屬（）、斑替枝孢瓶霉（）和Bartaliniaceae；擔子菌門中的雙擔菌綱（Geminibasidiomycetes）、雙擔菌目、Geminibasidium和Geminibasidiales；毛霉門中的Umbelopsidomycetes。有機茶園土壤中富集的微生物主要包括子囊菌門、擔子菌門和球囊菌門的一些物種，如屬于節(jié)擔菌綱（Wallemiomycetes）中節(jié)擔菌目（Wallemiales）、節(jié)擔菌科（Wallemiaceae）、節(jié)擔菌屬（）；屬于子囊菌綱中（Sordariomycetes）的小囊菌目（Microascales）、黑盤孢科（Melanconidaceae）、黑盤孢屬（）、短梗蠕孢屬（）、小囊菌科（Microascaceae）、無莖真菌屬（）；屬于散囊菌綱（Eurotiomycetes）的外瓶柄霉屬（）；屬于被孢霉綱（Mortierellomycetes）的被孢霉目（Mortierellales）、被孢霉科（Mortierellaceae）和被孢霉屬（）。

2.3 茶園土壤真菌功能類群

利用FUNGuild數(shù)據(jù)庫對常規(guī)茶園和有機茶園土壤真菌群落進行比對研究，結果可分為病理營養(yǎng)型（Pathotroph）、腐生營養(yǎng)型（Saprotroph）、共生營養(yǎng)型（Symbiotroph）、病理-腐生過渡型（Pathotroph-Saprotroph）、病理-腐生-共生過渡型（Pathotroph-Saprotroph-Symbiotroph）、病理-共生過渡型（Pathotroph-Symbiotroph）、腐生-共生過渡型（Saprotroph-Symbiotroph）和腐生-病理-共生過渡型（Saprotroph-Pathotroph-symbiotroph）。從營養(yǎng)類型看（圖5），茶園土壤真菌以腐生營養(yǎng)型為主，豐度為66.67%～70.18%，其次為病理營養(yǎng)型，豐度為8.73%～13.58%。方差分析結果表明，有機管理方式下共生營養(yǎng)型真菌在茶園中的豐度（1.30%）顯著低于常規(guī)種植茶園（5.26%），其他營養(yǎng)類型真菌所占比例變化不顯著。

對上述8種營養(yǎng)類型真菌進一步分類，共劃分出19個主要功能分組（圖6），各樣品中未定義腐生真菌（Undefined Saprotroph）占功能群的比例最大，各個比例的所在范圍為15.36%～36.65%；其次為未知分類真菌（unknown）和真菌寄生-未定義腐生真菌（Fungal Parasite-Undefined Saprotroph），兩者的比例分別為14.36%～22.44%和7.07%～26.11%。與常規(guī)茶園相比，由于施用有機肥和生草覆蓋，有機茶園中土壤中內生-垃圾腐生-土壤腐生-未定義腐生真菌（Endophyte-Litter Saprotroph-Soil Saprotroph-Undefined Saprotroph）、木材腐生真菌（Wood Saprotroph）和動物病原-內生-植物病原-未定義腐生真菌（Animal Pathogen-Endophyte-Plant Pathogen-Undefined Saprotroph）的豐度顯著增加（<0.05），而未定義腐生真菌、植物病原菌（Plant Pathogen）和動物病原-植物病原-未定義腐生真菌（Animal Pathogen-Plant Pathogen-Undefined Saprotroph）的豐度則顯著降低（<0.05）。

2.4 土壤真菌群落結構與土壤理化性質之間的關系

土壤理化性質和真菌群落多樣性的相關性分析見表3。其中土壤真菌Sobs指數(shù)與土壤pH呈顯著正相關；Chao1指數(shù)與土壤AK和pH呈顯著正相關；Shannon指數(shù)與土壤SOM和TN分別呈顯著和極顯著負相關；Simpson指數(shù)與土壤SOM和TN呈極顯著正相關。圖7-a為土壤真菌門群落結構與環(huán)境因子之間的RDA分析圖，前兩個排序軸分別解釋了真菌群落變化的57.22%和13.97%，兩者共解釋了72.19%。茶園土壤有效磷（AP，2=0.663，=0.001）、全鉀（TK，2=0.629，=0.001）、有機質（SOM，2=0552，=0.001）、陽離子交換量（CEC，2=0.551，=0.002）、全磷（TP，2=0.573，=0.006）和pH（2=0.490，=0.007）為主導真菌門群落變化的關鍵環(huán)境因子。在屬水平上（圖7-b），前兩個排序軸分別解釋了真菌群落變化的60.16%和9.99%，兩者共解釋了70.15%。土壤有效磷（AP，2=0.667，=0.001）、全磷（TP，2=0557，=0.002）、全鉀（TK，2=0.552，=0.004）、陽離子交換量（CEC，2=0.493，=0.006）、全氮（TN，2=0.464，=0.007）、pH（2=0.434，=0.014）和有機質（SOM，2=0.405，=0.018）是主導真菌屬群落變化的關鍵環(huán)境因子。

圖4 土壤真菌LEfSe分析的柱狀圖（a）（LDA值>3.5）和進化分支圖（b）

圖5 茶園土壤主要真菌營養(yǎng)型

圖6 茶園土壤主要真菌功能類群

2.5 茶園土壤真菌共現(xiàn)性網(wǎng)絡

為了進一步探究不同管理方式下茶園土壤真菌群落互作關系，基于顯著相關性的方法分別構建了常規(guī)茶園和有機茶園土壤真菌群落的分子生態(tài)網(wǎng)絡圖（圖8），并計算了網(wǎng)絡的拓撲性質（表4）。結果表明，與常規(guī)茶園相比，有機茶園真菌生態(tài)網(wǎng)絡的結構更為復雜，網(wǎng)絡節(jié)點數(shù)、平均聚類系數(shù)、邊數(shù)、網(wǎng)絡中心性和網(wǎng)絡密度均明顯增加，網(wǎng)絡直徑和平均最短路徑長度則明顯減小，這表明有機管理方式茶園土壤真菌網(wǎng)絡規(guī)模更大、關系更復雜、傳遞性更強。此外，有機茶園網(wǎng)絡各節(jié)點間正相關關系優(yōu)勢明顯，說明該區(qū)土壤真菌群落關系趨向相互合作，有助于提升土壤的自我修復潛力。

表3 土壤真菌α多樣性指數(shù)與土壤理化性質之間的Spearman相關性分析

注：SOM，土壤有機質；TN，總氮；AN，堿解氮；TP，總磷；AP，速效磷；TK，總鉀；AK，速效鉀；CEC，陽離子交換量；BK，土壤容重。*，<0.05；**，<0.01

Note: SOM, Soil organic matter. TN, Total nitrogen. AN, Alkaline-N. TP, Total phosphorus. AP, Available phosphorus. TK, Total potassium. AK, Available K. CEC, Cation exchange capacity. BK, Soil bulk density. *,<0.05. **,<0.01

圖7 門水平（a）和屬水平（b）土壤真菌豐度與土壤性質的冗余分析

注：a)，常規(guī)茶園；b)，有機茶園。圖中節(jié)點的大小表示物種豐度大小，不同顏色表示不同的物種；紅色線表示相互作用關系為正相關，綠色線表示相互作用關系為負相關；線的粗細表示相關性系數(shù)的大小

表4 不同管理方式下土壤真菌分子網(wǎng)絡拓撲性質

3 討論

3.1 有機種植模式對茶園土壤真菌多樣性的影響

有機管理方式是一種能維持土壤、生態(tài)系統(tǒng)和人類健康的可持續(xù)發(fā)展的生產體系，不依賴化學農藥、化肥、生長調節(jié)劑、飼料添加劑等物質，而采用有機肥、生物農藥及生物防治體系滿足農作物的生長需要?？偟膩碚f，由于采取有機肥、覆蓋物及輪作措施，有機管理方式有利于提高土壤微生物的豐度和多樣性[20]，且有機管理方式的土壤真菌群落結構與常規(guī)種植明顯不同[30]。本研究結果表明，中坡位和下坡位有機茶園土壤真菌多樣性指標大多高于常規(guī)茶園，上坡位則表現(xiàn)為常規(guī)茶園大于有機茶園，但無顯著性差異，這與以往的研究結果存在差異[31]。

關于種植模式對真菌多樣性的研究結果不一致，可能與不同區(qū)域有機種植持續(xù)時間、管理方式及地理位置差異有關。相比而言，土壤真菌群落比細菌群落更穩(wěn)定，部分真菌具有多種營養(yǎng)方式，更易受到植被變化和非隨機過程的影響[32]。Li等[33]通過薈萃分析認為真菌菌落受干擾的影響較小，保護性耕作對細菌多樣性有顯著影響，但對真菌群落多樣性無顯著影響，并強調了耕作措施強度和時間的重要性。本研究中，有機茶園管理時間相對較短，且隔年才施用2?250?kg·hm-2豆粕餅肥，因而其對土壤真菌多樣性的影響不明顯。有研究表明，土壤理化性質的改變是種植模式影響土壤微生物的重要途徑[34]。在本研究中卻發(fā)現(xiàn)，常規(guī)茶園土壤pH較低但速效磷含量大量盈余，與有機茶園之間的理化性質差異較大，但二者土壤真菌群落的多樣性差異卻并不顯著。這可能是因為在茶園生態(tài)系統(tǒng)中，茶園植被與土壤理化性質兩者綜合對土壤真菌群落產生影響。同時，有機茶園梯壁采用自然生草模式控制雜草和補充有機肥源，小區(qū)域內的空間環(huán)境變化比常規(guī)茶園大，加之生草覆蓋過程根系分泌物中可能會影響某些特定真菌微生物的繁殖[35]，從而使得地上植物群落、土壤真菌、土壤理化性質和空間結構之間的關系變得更加復雜。

3.2 有機種植模式對茶園土壤真菌群落組成和功能的影響

雖然不同管理方式之間茶園土壤真菌多樣性變化不明顯，但常規(guī)和有機管理方式茶園土壤真菌群落組成及相對豐度發(fā)生了明顯變化，這與以往多數(shù)的研究結果一致[36-37]。在本研究中，兩種管理方式的茶園土壤真菌優(yōu)勢菌群有明顯差異，子囊菌門和擔子菌門是常規(guī)管理方式茶園土壤真菌的優(yōu)勢菌門，而有機管理方式茶園土壤中的優(yōu)勢真菌類群轉變?yōu)樽幽揖T、被孢霉門和擔子菌門。真菌群落組分PCoA分析表明，常規(guī)和有機管理方式下茶園土壤樣品能夠明顯區(qū)分（圖3），這說明有機管理方式改變了茶園土壤微生物群落組成。從坡面尺度來看，常規(guī)管理方式茶園不同坡位之間的樣品能夠明顯區(qū)分，而有機管理方式茶園中上坡位和中坡位的茶園土壤真菌群落聚集在一起，表明有機管理方式降低了茶園土壤真菌群落的坡面空間異質性。丘陵山地坡面上，地形與管理方式決定土壤理化性質及微生物變化的重要因素，坡面養(yǎng)分在降雨侵蝕過程中的再分配是造成其土壤理化性質及微生物分布差異的主要因素[38]。福建省山地茶園大多采用等高梯臺種植方式，梯臺方式將坡面分割成若干梯面，改變了地表微地形，能夠一定程度攔截地表徑流，從而使得土壤養(yǎng)分沿茶園坡面進行再分配，導致不同坡位的土壤真菌群落組成明顯不同；相比常規(guī)種植茶園梯臺清耕作業(yè)而言，自然生草所形成的隔離帶對整體坡面徑流分配和土壤侵蝕過程有分割攔截作用[39]，從而削弱了土壤水分、養(yǎng)分等土壤性質在坡面的空間分布，進而導致有機茶園不同坡位土壤真菌群落的差異性增加，使得不同坡位茶園土壤真菌群落存在明顯重疊區(qū)域。同時，有機茶園中有機肥及自然生草的存在，提供了土壤真菌異質性的生境位[40]，這些區(qū)域可能被高度可變的真菌群落所占據(jù)，使土壤樣品間變異性更大。另外，在常規(guī)和有機管理方式茶園生態(tài)系統(tǒng)中植物并不相同，不同植物釋放的分泌物不同，也可能對土壤真菌群落有一定的影響[41]。

同一種作物的長期連續(xù)種植和土地重復利用容易引起土傳病害（多為病原真菌）的發(fā)生，其原因在于長期連作導致有益真菌數(shù)量和種類減少，病原微生物富集[42]，如大麗輪枝菌、尖孢鐮刀菌、黃萎輪枝孢菌、腐霉菌和絲核菌等。有研究表明，實行間作、套作或混作等有機管理方式能夠降低土傳病害的發(fā)生[43]，增加土壤中一些抑病性真菌的相對豐度和組成。通過LEfSe分析，發(fā)現(xiàn)常規(guī)和有機模式下茶園土壤中共有37種菌種存在顯著性差異，其中常規(guī)茶園土壤富集真菌主要集中于散囊菌綱、子囊菌綱和雙擔菌綱，有機茶園則集中于子囊菌綱、被孢霉綱、節(jié)擔菌綱及unclassified_p__Basidiomycota（屬于擔子菌門）。本研究發(fā)現(xiàn)，有機茶園中被孢霉屬、節(jié)擔菌屬、短梗蠕孢屬、粗糙孔菌屬（）的相對豐度顯著高于常規(guī)茶園，尤其是被孢霉屬相對豐度顯著提高了828.26%。已有研究表明，被孢霉屬是被孢霉科中的一個大屬，具備活化土壤中的磷、分解有機物（木質素、纖維素、半纖維素及果膠等）能力，能夠促進植物根系吸收礦質元素[44]，還可以與病原體爭奪營養(yǎng)和產生抗生素物質，加強對病原菌的抑制[45]。被孢霉屬是有機茶園土壤真菌的優(yōu)勢菌屬（相對豐度34.29%），說明自然生草和施用有機肥有利于被孢霉生長繁殖，從而緩解茶樹連作障礙。擬盤多毛孢屬（）和假擬盤多毛孢屬（）是導致茶葉斑病和輪斑病的主要病原菌[46]，常規(guī)茶園中這兩類真菌相對豐度分別為1.01%和0.57%，是有機茶園的6.23倍和23.45倍。值得注意的是，有機茶園土壤中黑盤孢屬（）和鐮刀菌屬（）出現(xiàn)了一定程度的富集，而這兩種病原真菌可侵染茶樹或引發(fā)潰瘍病[47]，這說明自然生草有機茶園需要預防茶樹潰瘍病的發(fā)生。

不同管理方式在改變茶園土壤真菌群落結構的同時，也改變了土壤真菌群落的生態(tài)功能。本研究結果表明，茶園土壤真菌功能類群中腐生營養(yǎng)型真菌比例最大，其次為病理營養(yǎng)型真菌，共生營養(yǎng)型真菌的比例最小。與常規(guī)茶園相比，有機管理方式提高腐生營養(yǎng)型真菌含量的同時，也抑制了病理營養(yǎng)型真菌的生長，說明自然生草和有機肥施用造成腐生營養(yǎng)型真菌富集，同時降低了從宿主細胞獲取營養(yǎng)來源、對植物生長具有負面影響的病理型真菌[48]。從功能分組上可以看出，未定義腐生真菌比例最大，這類真菌類群還無法依據(jù)現(xiàn)有研究結果進行區(qū)分，對其功能的研究仍需深入。與常規(guī)茶園相比，有機茶園土壤中內生-垃圾腐生-土壤腐生-未定義腐生真菌、木材腐生真菌和動物病原-內生-植物病原-未定義腐生真菌的豐度顯著增加，且這類群大多來自腐生真菌（籃狀菌屬、短梗蠕孢屬和粗糙孔菌屬），這可能是自然生草還園為腐生真菌的生長提供了合適的營養(yǎng)環(huán)境。相反，有機茶園土壤中植物病原真菌和動物病原-植物病原-未定義腐生真菌的豐度顯著降低，也進步說明有機管理方式能夠抑制茶園土壤病原菌的繁殖，這可能與有機茶園真菌生態(tài)網(wǎng)絡更為復雜有關。有機茶園真菌網(wǎng)絡節(jié)點數(shù)、邊數(shù)和聚類系數(shù)明顯增加（表4），意味著有機管理方式下茶園土壤真菌物種之間的直接作用增多，間接作用減少，而這種網(wǎng)絡復雜度的增加會導致網(wǎng)絡更加穩(wěn)定，也意味著其抵抗外界干擾能力越強[49]。

3.3 茶園土壤真菌群落變化與土壤理化性質的關系

以往研究表明真菌群落結構受到多種環(huán)境變量的綜合影響，如土壤pH[50]、有機質[51]、速效養(yǎng)分[52]等。本研究表明，土壤有機質、全氮、pH是影響土壤真菌多樣性的重要土壤因子，與多數(shù)的研究結果基本一致[51-52]。土壤pH被認為是影響全球土壤真菌群落分布的重要預測因子[53]，其通過直接或間接地改變土壤養(yǎng)分有效性、酶活性及根系分泌物等影響土壤真菌群落結構。Li等[54]研究結果也表明土壤pH是影響植茶過程中土壤真菌群落結構的重要因素。與常規(guī)茶園相比，由于施用豆粕有機肥和自然生草覆蓋使得有機茶園土壤pH顯著提高了0.36～0.50，因而導致了土壤真菌群落結構的變化。同時，除了土壤pH外，土壤中有機質、磷鉀等營養(yǎng)元素含量與真菌群落密切相關。有研究表明，土壤養(yǎng)分塑造了高原濕地真菌群落的垂直分布[55]，這與本研究中的RDA分析結果一致。由于長期施用化肥，常規(guī)茶園土壤速效磷含量大量盈余（速效磷含量207.08～244.77?mg·kg-1），遠超過高產茶園標準（>20?mg·kg-1），從而導致土壤真菌群落結構的變化。Liu等[56]研究發(fā)現(xiàn)，土壤有效磷含量大于53.6?mg·kg-1是導致真菌多樣性發(fā)生顯著變化的閾值；Lin等[57]發(fā)現(xiàn)長期施磷會降低耕地土壤叢枝菌根真菌多樣性；Li等[58]研究發(fā)現(xiàn)，向土壤中施用大量有效磷可能導致植物有益微生物的消耗，同時增加致病微生物豐度并影響植物健康。因此，對于速效磷含量過高的茶園應當適當減施磷肥或短期內不施磷肥來降低茶園土壤中病原真菌的數(shù)量，還可以通過增施有機肥或種植綠肥來提高土壤pH，從而，刺激土壤有益真菌的繁殖，進而提高茶園土壤抗干擾能力。然而由于土壤微生物結構復雜，土壤理化性質對真菌群落結構的影響往往存在交互作用，且常規(guī)和有機管理方式下茶樹根系數(shù)量和分泌物的差異也并未得到很好闡述，針對這些問題還需通過深入地開展研究。

4 結論

本研究采用土壤真菌高通量測序技術結合FUNGuild功能比對，研究福建丘陵山區(qū)茶園土壤真菌群落多樣性和功能對不同管理方式和坡位的響應。與常規(guī)茶園相比，有機管理方式對于茶園土壤真菌群落多樣性無明顯變化，但顯著改變了土壤真菌群落結構，這主要與土壤全磷、有效磷、全鉀、有機質、陽離子交換量和pH變化有關。常規(guī)管理方式茶園中不同坡位之間的真菌群落結構能夠明顯區(qū)分，有機管理方式降低了茶園土壤真菌群落的空間異質性。有機管理方式促進腐生營養(yǎng)型真菌的富集，降低了植物病原真菌和動物病原-植物病原-未定義腐生真菌的相對豐度。此外有機種植還可增加真菌群落結構的復雜度和穩(wěn)定性。因此，有機管理方式對茶園土壤真菌群落結構產生顯著影響，提高了土壤有益真菌的數(shù)量，增加了土壤真菌網(wǎng)絡穩(wěn)定性和抗干擾能力，降低病原真菌的豐度，具有良好的生態(tài)環(huán)境效應。

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Effects of Organic Management Mode on Soil Fungal Community Structure and Functions in Tea Gardens

WANG Feng1,2,3, CHEN Yuzhen2, WU Zhidan2, YOU Zhiming2, YU Wenquan4, YU Xiaomin3, YANG Zhenbiao3,5*

1. College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 2. Tea Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350012, China; 3. FAFU-UCR Joint Center for Horticultural Biology and Metabolomics, Haixia Institute of Science and Technology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 4. Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350013, China; 5. Institute of Integrative Genome Biology and Department of Botany and Plant Science, University of California, Riverside, CA 92506, USA

To study the soil fungal community compositions and functional groups under different management practices and slope positions, soil samples derived from the topsoil (0-20?cm) were collected from the upper, middle, and lower slope positions of conventional and organic tea gardens. High-throughput sequencing, functional predictions and the molecular ecological network analysis were performed to investigate the community structures, functional groups and ecological network of soil fungi, respectively. The two-way ANOVA including management practices and slope positions showed that the two-way interaction had no effect on the soil fungal community-diversity. Regardless of the management practices and the slope positions, the predominant fungal phyla were Ascomycota, Basidiomycota and Mortierellomycota. Management practices did not change the compositions of dominant fungal species, but affected their relative abundance. Principal coordinate analysis (PCoA) shows that the soil fungal community structures differed significantly among different management practices. The community structures of soil fungi at different slope positions were noticeably different under the conventional planting pattern (<0.05), but were similar under the organic planting pattern (>0.05). The linear discriminant analysis effect size (LEfSe) analysis shows that 37 biomarkers were very sensitive to the changes in the management, with different management practices enriching for different fungal populations. The numbers of degree, clustering, edges, degree centrality and closeness centrality of the fungal interaction network under the organic planting pattern were all higher than those under the conventional planting pattern, indicating that the fungal networks were more complex in the organic tea garden. Saprotrophic fungi were the dominant fungal group across all tea gardens (66.67%～70.18%). The effects of the management practices on soil fungal functions were obvious. Compared to those under the conventional planting pattern, the average abundance of endophyte-litter saprotroph-soil saprotroph, wood saprotroph and animal pathogen-endophyte-plant pathogen-undefined saprotroph significantly increased, but the average abundance of undefined saprotroph, plant pathogen and animal pathogen-plant pathogen-undefined saprotroph remarkably decreased. The spearman correlation analysis and the redundancy analysis (RDA) show that soil total phosphorus, available phosphorus, total potassium, organic matter, cation exchange capacity and pH were the main factors affecting the abundance and diversity of the soil fungal community. Organic planting drastically changes the structure and the compositions of the soil fungal community, enhances fungal network complexity and stability, and thus is beneficial to maintain the sustainable ecosystem in tea garden soil.

management practices, slope position, fungal community structure, collinear network analysis, FUNGuild functional prediction

S571.1；S143.1

A

1000-369X(2022)05-672-17

2022-02-28

2022-05-06

福建省自然科學基金項目（2021J01489）、國家重點研發(fā)計劃項目（2016YFD0200903）、福建省科技廳公益類科研專項（2020R1029001、2021R1029002）、農業(yè)科技創(chuàng)新聯(lián)盟專項（CXLM202202）

王峰，男，副研究員，主要研究方向為茶樹栽培與環(huán)境生態(tài)，82458lin@163.com。*通信作者：yang@ucr.edu