ε-聚賴氨酸對(duì)腐生葡萄球菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)與能量代謝的影響

藍(lán)蔚青，張楠楠，陳夢(mèng)玲，謝 晶,*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，食品科學(xué)與工程國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心（上海海洋大學(xué)），上海 201306）

ε-聚賴氨酸（ε-polylysine，ε-PL）是一種具有抑菌功效的陽(yáng)離子多肽，具有抑制效果好、抑菌性廣等優(yōu)點(diǎn)[1]。研究表明，ε-PL的抑菌機(jī)制主要為作用于細(xì)胞膜和細(xì)胞壁導(dǎo)致細(xì)胞死亡，對(duì)細(xì)菌的呼吸作用有一定影響，同時(shí)還可能作用于酶或功能蛋白系統(tǒng)[2-4]。

腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）是食品中的主要腐敗菌，為革蘭氏陽(yáng)性菌，能在食品貯藏過(guò)程中分泌蛋白酶與脂肪酶，導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解與脂質(zhì)氧化，影響其品質(zhì)[5-6]。目前也有相關(guān)學(xué)者開(kāi)展對(duì)腐生葡萄球菌的抑菌機(jī)理研究，如蘇萌萌等[7]研究發(fā)現(xiàn)綠原素能作用于腐生葡萄球菌細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜嚴(yán)重受損，導(dǎo)致膜電位發(fā)生變化，胞內(nèi)大分子物質(zhì)泄漏而達(dá)到抑菌目的；朱亞珠等[8]通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出山梨酸鉀、雙乙酸鈉與異抗壞血酸鈉組成的復(fù)合保鮮劑能明顯降低腐生葡萄球菌的生長(zhǎng)速率，使菌體破裂，核酸與蛋白質(zhì)外泄，導(dǎo)致其死亡。但目前開(kāi)展抗菌多肽對(duì)腐生葡萄球菌作用機(jī)制方面的研究較少。相關(guān)研究表明，抗菌肽抑菌劑破壞細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)后，其進(jìn)入菌體細(xì)胞內(nèi)，可能會(huì)影響細(xì)胞代謝[9]。三羧酸循環(huán)是生物細(xì)胞中重要的代謝途徑，其不僅能提供能量，還是糖、脂肪與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化的樞紐。琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）與蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH）是三羧酸循環(huán)中重要的調(diào)控酶，會(huì)對(duì)三羧酸循環(huán)，甚至整個(gè)細(xì)胞代謝帶來(lái)影響[10]。本研究以ε-PL對(duì)腐生葡萄球菌細(xì)胞膜影響為出發(fā)點(diǎn)，由細(xì)菌生長(zhǎng)曲線、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）酶、電導(dǎo)率、紫外吸收值與掃描電子顯微鏡觀察，研究ε-PL對(duì)腐生葡萄球菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響，并通過(guò)檢測(cè)琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）、蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH）、過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）與過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）等呼吸代謝關(guān)鍵酶活性變化，進(jìn)一步探究ε-PL對(duì)腐生葡萄球菌能量代謝的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）為課題組前期從腐敗大黃魚中分離、篩選、鑒定并保存的菌株。

胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒、AKP測(cè)試盒、超微量總ATP酶測(cè)試盒以及POD、CAT、SDH、MDH試劑盒 南京建成生物工程研究所；氯化鈉、無(wú)水乙醇、戊二醛、磷酸鹽、氯化碘硝基四唑紫（iodonitrotetrazolium chloride，INT）等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BCD-256KF冰箱 青島海爾股份有限公司；MLS-3750滅菌鍋 日本SANYO公司；ZQZY-70B振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；LDZM-40KCS-II立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；VS-1300L-U型超凈臺(tái) 蘇州蘇凈安泰集團(tuán)；M334712全自動(dòng)微生長(zhǎng)曲線分析儀 芬蘭Bioscreen公司；Centrifuge 5810R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；Synergy2自動(dòng)酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司；DDB-11A電導(dǎo)率儀 杭州奇威儀器有限公司；S3400N掃描電子顯微鏡 日本Hitachi株式會(huì)社。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液制備

挑取單菌落于10 mL TSB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)18 h，以1%（體積分?jǐn)?shù)，后同）接種量接入10 mL的TSB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)18 h，4 ℃、3 500 r/min離心15 min，棄去上清液，用0.85%生理鹽水調(diào)整菌液，菌液濃度為106～107CFU/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 最小抑菌濃度測(cè)定

采用肉湯稀釋法測(cè)定ε-PL對(duì)腐生葡萄球菌的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC），即7 ℃下培養(yǎng)24 h，明顯抑制微生物生長(zhǎng)的最小濃度[11]。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液，加入無(wú)菌TSB培養(yǎng)液稀釋至106CFU/mL。采用二倍稀釋法將ε-PL在無(wú)菌TSB中依次稀釋，使其終質(zhì)量濃度分別為32、16、8、4、2、1 mg/mL，用無(wú)菌水代替ε-PL作為對(duì)照組。37 ℃下培養(yǎng)24 h。通過(guò)比較ε-PL處理前后的吸光度變化，得出其MIC為1.0 mg/mL。

1.3.3 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的繪制

將已制備的菌懸液按1%接種量分別加至MIC和2 MIC的ε-PL溶液中，以不加ε-PL為對(duì)照組（CK）。37 ℃、170 r/min搖床培養(yǎng)24 h，用全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀每隔1 h自動(dòng)測(cè)定600 nm波長(zhǎng)處的OD值。

1.3.4ε-PL處理后腐生葡萄球菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜通透性的測(cè)定

將制備好的菌懸液按1%接種量加至MIC和2 MIC的ε-PL溶液中，以不加ε-PL為對(duì)照組。37 ℃、170 r/min搖床培養(yǎng)，每隔2 h取樣1次，3 500 r/min離心10 min，取上清液，按照AKP和超微量總ATP酶測(cè)試盒進(jìn)行AKP和ATP酶活力測(cè)定，研究ε-PL對(duì)菌體細(xì)胞壁通透性的影響；測(cè)定上清液在260 nm波長(zhǎng)處的OD值，研究ε-PL對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響；用電導(dǎo)率儀測(cè)定上清液的電導(dǎo)率，研究ε-PL對(duì)細(xì)胞內(nèi)容物泄漏的影響。

1.3.5 掃描電子顯微鏡觀察菌體形態(tài)

將制備好的菌懸液按1%接種量分別加至MIC和2 MIC的ε-PL溶液中，37 ℃、170 r/min搖床培養(yǎng)12 h后，取2.0 mL菌液于4 ℃、8 000 r/min離心5 min，收集沉淀。用2.5%戊二醛溶液重懸，并在4 ℃固定10 h。用磷酸鹽緩沖液洗滌菌體后，再用30%、50%、70%、90%乙醇溶液和無(wú)水乙醇依次進(jìn)行梯度脫水。冷凍干燥后，將其涂于金屬載體上，噴金，進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察。

1.3.6ε-PL處理后腐生葡萄球菌POD和CAT活力的測(cè)定

參考廖石榴等[12]的方法，將制備好的菌懸液按1%接種量加至MIC和2 MIC的ε-PL溶液中，以不加ε-PL為對(duì)照組。37 ℃、170 r/min搖床培養(yǎng)。取10 mL低溫下超聲2 min，4 ℃、5 000 r/min離心12 min。取上清液，用試劑盒測(cè)定POD和CAT活力。

1.3.7ε-PL處理后腐生葡萄球菌SDH和MDH活力的測(cè)定

參考廖石榴等[12]的方法，將制備好的菌懸液按1%接種量加至MIC和2 MIC的ε-PL溶液中，以不加處理液組為對(duì)照。37 ℃、170 r/min搖床培養(yǎng)。取2 mL菌液，3 000 r/min離心15 min。將沉淀物用0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.4）洗滌3 次。向菌體中加入等體積的2 g/L溶菌酶，于38 ℃下作用15 min，取出后冰浴；加入Tris-十二烷基硫酸鈉緩沖液后，4 ℃、5 000 r/min離心15 min，取上清液用試劑盒進(jìn)行SDH和MDH活力測(cè)定。

1.3.8ε-PL處理后腐生葡萄球菌細(xì)胞代謝活力的測(cè)定

參考劉喚明等[13]的方法，將制好的菌懸液按1%接種量加至MIC和2 MIC的ε-PL溶液中，37 ℃作用1 h后，在4 ℃、10 000 r/min條件下離心5 min，收集沉淀物。用生理鹽水洗滌2 次并將菌液濃度調(diào)至108CFU/mL，加入INT，使其終濃度為1 mmol/L，37 ℃作用30 min后，測(cè)定OD630nm，判斷ε-PL對(duì)菌體細(xì)胞代謝活力的影響。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

以SPSS 17.5軟件中的單因素方差分析及Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行數(shù)據(jù)的差異顯著性分析，采用Origin 9.0軟件繪圖。最終實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3 次平行實(shí)驗(yàn)的平均值，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 ε-PL對(duì)腐生葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響

使用全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線測(cè)定儀測(cè)定腐生葡萄球菌在不同質(zhì)量濃度ε-PL作用下的生長(zhǎng)情況，結(jié)果如圖1所示。

圖1 ε-PL對(duì)腐生葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig.1 Effect of ε-PL on the growth curve of Staphylococcus saprophyticus

由圖1可知，CK組的腐生葡萄球菌生長(zhǎng)呈“S”型，2～13 h為對(duì)數(shù)期，該階段菌體數(shù)量增長(zhǎng)迅速，13 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。與CK組相比，MIC組與2 MIC組菌體在2～13 h時(shí)的生長(zhǎng)速度減慢，在13 h進(jìn)入穩(wěn)定期，MIC組與2 MIC組菌體數(shù)量小于對(duì)照組?？梢?jiàn)，經(jīng)MIC和2 MICε-PL處理后，腐生葡萄球菌的生長(zhǎng)受到明顯抑制。

2.2 ε-PL對(duì)腐生葡萄球菌AKP活力的影響

AKP大多存在于細(xì)胞壁與細(xì)胞膜間。當(dāng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到破壞，AKP由胞內(nèi)滲出。因此，可通過(guò)檢測(cè)AKP的活力來(lái)判斷其對(duì)菌體細(xì)胞壁的破壞情況[14]。

從圖2可知，在0～2 h時(shí)，3 組樣品的AKP活力增長(zhǎng)較快。2 h后MIC組和2 MIC組的AKP活力要高于對(duì)照組。其中，2 MIC組AKP活力增長(zhǎng)更明顯。表明ε-PL處理能使腐生葡萄球菌的細(xì)胞壁通透性發(fā)生改變，導(dǎo)致AKP活力增加。這是由于ε-PL富含陽(yáng)離子，會(huì)取代細(xì)胞壁表面的Ca2＋、Mg2＋，與負(fù)電性的脂多糖結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而穿過(guò)細(xì)胞壁作用于細(xì)胞膜。這與韓晴[15]的研究結(jié)果一致。

圖2 ε-PL對(duì)腐生葡萄球菌菌體AKP活力的影響Fig.2 Effect of ε-PL on AKP activity of Staphylococcus saprophyticus

2.3 ε-PL對(duì)腐生葡萄球菌總ATP酶活力的影響

ATP酶是廣泛分布在細(xì)胞膜上的酶，其主要是通過(guò)利用ATP水解產(chǎn)生的能量對(duì)Na＋、K＋、Ca2＋、Mg2＋等進(jìn)行由低濃度至高濃度的運(yùn)輸，保持膜內(nèi)外離子濃度的平衡，維持正常的生命活動(dòng)[16]。因此，可通過(guò)ATP酶活力變化分析其對(duì)菌體細(xì)胞能量代謝的影響[17]。

圖3 ε-PL對(duì)腐生葡萄球菌總ATP酶活力的影響Fig.3 Effect of ε-PL on ATPase activity of Staphylococcus saprophyticus

由圖3可知，CK組菌液的ATP酶活力變化不明顯，保持相對(duì)平穩(wěn)。而經(jīng)MIC與2 MIC的ε-PL處理后，其ATP酶活力活力隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而降低?？赡苡捎讦?PL作用于菌體后，導(dǎo)致其細(xì)胞膜受損，造成胞內(nèi)的ATP酶活力下降[18]。因此，ε-PL的抑菌作用可使其能量代謝受到抑制，影響細(xì)胞供能等。該結(jié)果與Lin Lin等[18]的研究結(jié)果一致。

2.4 ε-PL對(duì)腐生葡萄球菌細(xì)胞膜通透性的影響

細(xì)胞膜被破壞后，導(dǎo)致膜內(nèi)物質(zhì)泄漏出來(lái)[19]。因此，可通過(guò)檢測(cè)菌液在260 nm波長(zhǎng)處的光密度來(lái)分析其對(duì)細(xì)胞膜的破壞程度[20]。

由圖4可知，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，MIC組與2 MIC組菌液的OD值增加，且在2 h內(nèi)明顯增加，隨后緩慢增長(zhǎng)，而CK組菌液的OD值始終保持低水平?？梢?jiàn)，ε-PL對(duì)菌體的細(xì)胞膜有一定破壞作用，破壞強(qiáng)度與ε-PL質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。菌液中胞外核酸含量的增加趨勢(shì)與周祺等[21]的結(jié)果一致，表明ε-PL對(duì)菌體細(xì)胞膜有破壞作用。

圖4 ε-PL對(duì)腐生葡萄球菌細(xì)胞膜完整性的影響Fig.4 Effect of ε-PL on cell membrane integrity of Staphylococcus saprophyticus

2.5 ε-PL對(duì)腐生葡萄球菌電導(dǎo)率的影響

當(dāng)抑菌劑破壞細(xì)胞膜后，細(xì)菌內(nèi)部電解質(zhì)外泄至培養(yǎng)液中，使電導(dǎo)率增加。因此，可通過(guò)菌液電導(dǎo)率的變化來(lái)分析其細(xì)胞膜的通透性變化[22]。

圖5 ε-PL對(duì)腐生葡萄球菌細(xì)胞膜通透性的影響Fig.5 Effect of ε-PL on cell membrane permeability of Staphylococcus saprophyticus

由圖5可知，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，3 組菌液的電導(dǎo)率均隨之增加。其中，CK組菌液在2 h內(nèi)的電導(dǎo)率增加較明顯，隨后緩慢增長(zhǎng)，并維持在相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。MIC與2 MIC組菌液的電導(dǎo)率始終高于CK組，其與處理液濃度呈正相關(guān)?？赡苁铅?PL破壞細(xì)胞膜，導(dǎo)致菌體膜破裂，胞內(nèi)大量物質(zhì)泄漏，影響其正常代謝，最終導(dǎo)致菌體死亡[23]。

2.6 ε-PL對(duì)腐生葡萄球菌細(xì)胞形態(tài)的影響

CK組與ε-PL處理組中的腐生葡萄球菌掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果如圖6所示。

圖6 ε-PL對(duì)腐生葡萄球菌處理前后掃描電子顯微鏡圖Fig.6 Scanning electron micrographs of Staphylococcus saprophyticus cells treated or not treated with ε-PL

由圖6可知，CK組菌體形態(tài)飽滿、完整未變形；經(jīng)MICε-PL處理后的菌體扭曲變形、表面粗糙。而經(jīng)2 MICε-PL處理后，菌體在扭曲變形的同時(shí)，部分細(xì)胞相互黏結(jié)，形態(tài)破壞較明顯。表明ε-PL能破壞菌體形態(tài)，改變其通透性，達(dá)到抑菌效果。這與Li Yingqiu等[24]研究結(jié)果一致。

2.7 ε-PL對(duì)腐生葡萄球菌POD和CAT活力的影響

POD與CAT是細(xì)胞內(nèi)重要的保護(hù)酶，能清除活性氧自由基，保證細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性[25-26]。其酶活力的降低會(huì)造成菌體的膜系統(tǒng)受損，影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)代謝[12]。

圖7 ε-PL對(duì)腐生葡萄球菌POD和CAT活力的影響Fig.7 Effect of ε-PL against on POD and CAT activity of Staphylococcus saprophyticus

由圖7可知，菌體經(jīng)MIC與2 MICε-PL處理后，其POD和CAT活力低于CK組。隨著ε-PL質(zhì)量濃度的增加，POD和CAT活力相應(yīng)下降?？梢?jiàn)，ε-PL可通過(guò)降低腐生葡萄球菌的POD、CAT活力，減緩其呼吸代謝，從而抑制菌體生長(zhǎng)。

2.8 ε-PL對(duì)腐生葡萄球菌SDH與MDH活力的影響

SDH與MDH是三羧酸循環(huán)過(guò)程中的關(guān)鍵代謝酶[27-28]。因此，通過(guò)檢測(cè)腐生葡萄球菌中SDH和MDH活力可反映菌體的能量代謝狀況[29]。

圖8 ε-PL對(duì)腐生葡萄球菌MDH和SDH活力的影響Fig.8 Effect of ε-PL on MDH and SDH activity of Staphylococcus saprophyticus

如圖8所示，與CK組相比，ε-PL處理組的SDH與MDH活力降低，且隨著ε-PL質(zhì)量濃度的增加，SDH活力逐漸降低，MDH活力的變化趨勢(shì)與SDH相似。結(jié)果表明ε-PL會(huì)降低腐生葡萄球菌的SDH與MDH活力，且ε-PL質(zhì)量濃度越高，酶活力越低。可能是ε-PL主要通過(guò)抑制SDH和MDH活性，使三羧酸循環(huán)受阻，影響菌體正常的能量代謝，導(dǎo)致其細(xì)胞生長(zhǎng)受阻。此結(jié)果和Yang Shuzhen等[30]研究結(jié)果一致。

2.9 ε-PL對(duì)腐生葡萄球菌細(xì)胞代謝活力的影響

細(xì)胞代謝還原活力基于INT原理進(jìn)行測(cè)定。三羧酸循環(huán)過(guò)程中，活細(xì)胞在脫氫酶作用下生成活化氫離子，其將INT還原成甲臜，可根據(jù)甲臜生成速率推測(cè)細(xì)胞代謝活力[31]。ε-PL對(duì)腐生葡萄球菌代謝活力的影響結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 ε-PL對(duì)腐生葡萄球菌細(xì)胞代謝活力的影響Fig.9 Effect of ε-PL on cell metabolism of Staphylococcus saprophyticus

由圖9可知，ε-PL處理組的OD值低于對(duì)照組，且2 MIC組的OD值低于MIC組，說(shuō)明ε-PL能抑制腐生葡萄球菌的代謝活性?？赡苁铅?PL作用于腐生葡萄球菌，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變，內(nèi)容物泄漏，對(duì)其代謝活力產(chǎn)生影響。

2.10 綜合分析結(jié)果

細(xì)胞膜是細(xì)菌結(jié)構(gòu)的重要組成部分，是各種抗菌劑作用的主要場(chǎng)所。當(dāng)細(xì)胞膜被破壞時(shí)，核酸等大分子與Na＋、K＋離子等內(nèi)容物發(fā)生泄漏，由此可判斷細(xì)胞膜完整性[19,22]。圖10模擬還原了ε-PL破壞腐生葡萄球菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及導(dǎo)致其內(nèi)容物泄漏的過(guò)程。

圖10 ε-PL對(duì)腐生葡萄球菌抑制模擬圖[25]Fig.10 Schematic representation of the possible inhibitory mechanism of ε-PL against Staphylococcus saprophyticus[25]

ε-PL可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)膜降低腐生葡萄球菌的AKP與ATP活性，抑制其生長(zhǎng)。ATP酶是一種基礎(chǔ)代謝酶，能催化ATP生成ADP，為細(xì)胞提供能量。ATP酶活性降低可能導(dǎo)致ATP從菌體中溢出，抑制其呼吸代謝。POD與CAT是生物體內(nèi)的重要保護(hù)酶，能清除體內(nèi)氧化自由基[25-26]。而SDH和MDH是三羧酸循環(huán)過(guò)程中的重要酶體系。SDH能催化琥珀酸生成延胡索酸，同時(shí)能將FAD轉(zhuǎn)化為FADH2；MDH能催化蘋果酸生成草酰乙酸，同時(shí)能將NAD＋轉(zhuǎn)化為NADH，而FADH2和NADH是呼吸鏈上的電子供體[27]。ε-PL抑制了菌體中的SDH和MDH活力，表明ε-PL可能阻止腐生葡萄球菌的信息與能量轉(zhuǎn)移。兩種酶能為細(xì)胞提供輔助因子和能量，其活性降低可能會(huì)阻礙碳水化合物的合成與細(xì)胞生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致其死亡。

以上分析表明，含有陽(yáng)離子殘基的ε-PL通過(guò)靜電作用吸引到帶有負(fù)電荷的細(xì)菌表面，當(dāng)ε-PL達(dá)到一定濃度時(shí)，細(xì)胞磷脂膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，滲透性增強(qiáng)，細(xì)胞膜上形成孔洞，然后ε-PL通過(guò)膜上孔洞進(jìn)入細(xì)胞，破壞微生物的正常生理代謝，引起細(xì)胞的物質(zhì)、能量以及信息傳遞中斷，并與細(xì)胞的內(nèi)部物質(zhì)發(fā)生作用，破壞細(xì)胞的核心，造成紫外吸收物的滲出，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)MIC、細(xì)菌生長(zhǎng)曲線、電導(dǎo)率、紫外吸收變化、AKP與ATP酶活力測(cè)定，結(jié)合掃描電子顯微鏡觀察，分析ε-PL對(duì)腐生葡萄球菌的作用機(jī)制。結(jié)果表明，ε-PL對(duì)腐生葡萄球菌的MIC為1.0 mg/mL，其能使細(xì)菌生長(zhǎng)速率減緩，細(xì)胞壁與細(xì)胞膜通透性和完整性受損，內(nèi)容物外泄，最終使菌體死亡。同時(shí)，ε-PL對(duì)腐生葡萄球菌三羧酸循環(huán)過(guò)程中的琥珀酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶抑制作用明顯，直接影響細(xì)胞電子傳遞鏈與呼吸作用，抑制其代謝活力，導(dǎo)致菌體死亡。ε-PL進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，抑制細(xì)胞膜上的ATP酶活力，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)多種代謝途徑受阻，同時(shí)影響細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和多種酶的反應(yīng)活性。后續(xù)研究可考慮在DNA分子水平或結(jié)合蛋白組學(xué)進(jìn)一步探究ε-PL的抑菌機(jī)制。