殼聚糖納米粒子的制備和在食品抑菌中的研究進展

譚 嘯，邱婷婷，李若男，周麗莎，趙艷云，陳舜勝，張洪才,*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3.國家淡水水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心（上海），上海 201306；4.俄勒岡州立大學(xué)食品科技學(xué)院，美國 俄勒岡 科瓦利斯 97331-6602）

殼聚糖是甲殼素脫乙?；纬傻漠a(chǎn)物，是常用的天然生物高分子聚合物材料，因其具有無毒、吸附性強、可降解和生物活性高等特性，近年來在食品、醫(yī)藥、環(huán)境和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用。盡管殼聚糖具有一定的廣譜抑菌性能，但與脫乙酰程度和分子質(zhì)量有密切關(guān)系，此外，由于殼聚糖水溶性差，其應(yīng)用也受到了很大的限制。

近年來殼聚糖納米粒子包埋抑菌活性物質(zhì)已成為國內(nèi)外研究的熱點，離子交聯(lián)法是制備殼聚糖納米粒子常用的方式之一（粒徑小于200 nm）。如Zhang Hongcai等通過離子交聯(lián)法制備兒茶素-Zn復(fù)合物裝載的β-殼聚糖納米粒子（粒徑在100 nm左右），研究表明β-殼聚糖納米粒子可顯著提高兒茶素-Zn的抑菌活性，它可作為食品抑菌劑用于食品包裝材料中[1]。Orellano等研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）為1 600 μg/mL，而殼聚糖納米粒子為200 μg/mL，表明殼聚糖納米粒子的抑菌效果比殼聚糖強[2]。Omidi等制備由新型吡啶類化合物接枝的殼聚糖和殼聚糖納米粒子，研究表明新型殼聚糖衍生物納米粒子抑菌效果和抗氧化性都得到顯著提高，其中，對金黃色葡萄球菌的MIC達到81.25 μg/mL[3]。殼聚糖納米粒子不僅具有納米材料的體積效應(yīng)、表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)和介電限域效應(yīng)等優(yōu)點，且存在抗菌性強、包埋率和靈敏度高等特點，已成為食品和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域研究的熱點。因此，本文綜合國內(nèi)外研究介紹了殼聚糖納米粒子的制備方法和殼聚糖納米粒子在食品抑菌應(yīng)用中的研究進展，為天然抑菌劑的開發(fā)提供新的研究思路和理論參考。

1 殼聚糖納米粒子的制備方法

1.1 離子交聯(lián)法

1988 年Bodmeier等首次通過離子交聯(lián)法制備殼聚糖納米粒子[4]，其原理為當(dāng)殼聚糖溶解在酸性介質(zhì)中時，殼聚糖上的氨基轉(zhuǎn)化成帶正電荷的NH3＋，并與帶負電荷的三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，TPP）相互吸引，二者通過分子間的靜電作用相互交聯(lián)形成殼聚糖納米粒子（圖1）。該反應(yīng)條件溫和，可在室溫中進行，TPP無毒且不需要添加其他化學(xué)交聯(lián)劑，可應(yīng)用于食品等領(lǐng)域中。制備殼聚糖納米粒子有諸多影響因素，如殼聚糖的分子質(zhì)量、脫乙酰程度、初始濃度、與TPP的濃度和體積比、體系pH值、攪拌速率和TPP加入方式等。Mohammadi等使用分子質(zhì)量70、190 kDa和684 kDa的殼聚糖分別制備粒徑為60、78 nm和105 nm的納米粒子，結(jié)果表明分子質(zhì)量越低，粒徑越小，抗菌性越強[5]。Fan Wen等研究不同殼聚糖和TPP的比例制備納米粒子，結(jié)果表明當(dāng)殼聚糖和TPP的質(zhì)量比在3:1時，納米粒子的粒徑最?。?38 nm）[6]。Sreekumar等研究了殼聚糖質(zhì)量濃度、殼聚糖的脫乙酰程度、殼聚糖和TPP的物質(zhì)的量之比對離子交聯(lián)法制備殼聚糖納米粒子的影響以及各因素之間的相互作用，結(jié)果表明對于當(dāng)NH2∶PO4物質(zhì)的量之比為3∶2時，殼聚糖質(zhì)量濃度對粒徑的影響較大，且隨殼聚糖濃度的增加粒徑也增加，不同濃度的殼聚糖都能得到從微米到納米的顆粒，但是需要特定的NH2與PO4物質(zhì)的量之比。此外，其還發(fā)現(xiàn)納米顆粒的形成及其粒徑與溶液中鹽的存在有一定的關(guān)系[7]。Kaloti等研究了不同殼聚糖質(zhì)量濃度、殼聚糖與TPP體積比例以及pH值條件下制備納米粒子，納米粒子的尺寸受殼聚糖濃度和混合物比例影響較大，高濃度的殼聚糖和高的殼聚糖與TPP體積比導(dǎo)致納米粒子的尺寸變大。當(dāng)殼聚糖質(zhì)量濃度大于0.5 mg/mL，殼聚糖與TPP的體積比大于2∶1，殼聚糖納米粒子的粒徑為150～350 nm[8]。此外，F(xiàn)àbregas等研究不同攪拌速率對殼聚糖納米粒子粒徑的影響，在相同條件下，當(dāng)攪拌速率為800 r/min時，粒徑105～209 nm的粒子分布最廣[9]。

圖1 TPP與殼聚糖離子交聯(lián)制備納米粒子Fig.1 Cross-linking of sodium tripolyphosphate and chitosan for the preparation of nanoparticles

表1 離子交聯(lián)法制備殼聚糖納米粒子的條件Table 1 Preparation conditions for chitosan nanoparticles by ionic cross-linking

納米粒子的粒徑越小，Zeta-電位越高，包埋率和裝載量越高且具有緩釋作用。陳文彬等制備α-生育酚裝載的殼聚糖納米粒子，平均粒徑和包埋率分別為214 nm和51.65%，體外緩釋實驗發(fā)現(xiàn)在12 h內(nèi)，納米粒子存在明顯的突釋，此后緩慢釋放，且在不同的酸堿性環(huán)境中納米粒子呈現(xiàn)不同的緩釋速率[10]。這主要是由于前期納米粒子表面會附著包埋物，較易從體系中釋放出來，而后物質(zhì)的釋放分為體系瓦解、表面侵蝕、擴散等階段，因此較為緩慢。Zhang Hongcai等采用離子交聯(lián)法，使用兩種不同分子質(zhì)量的殼聚糖制備出包埋β-半乳糖苷酶的殼聚糖納米粒子，粒徑分別為584.37 nm和652.46 nm、Zeta-電位分別為26.37 mV和16.46 mV、包埋率分別為68.32%和58.64%。研究表明包埋體系具有良好的緩釋效果，可用于治療乳糖不耐癥或用于奶制品[11]。離子交聯(lián)法制備殼聚糖納米粒子的條件如表1所示。離子交聯(lián)法由于具有制備過程簡單、條件可控、細胞毒性低、生物相容性好和包埋率高等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、環(huán)境和食品等領(lǐng)域。

1.2 其他制備方法

除了離子交聯(lián)法外，乳化交聯(lián)法、化學(xué)交聯(lián)法、凝聚法、噴霧干燥法、乳液液滴聚合法和層層自組裝法也可用來制備殼聚糖納米粒子。

乳化交聯(lián)法是將包埋物與殼聚糖制備成不同類型的乳液。根據(jù)乳液的類型分為單乳法（O/W型、W/O型和O/O型）和復(fù)乳法（W/O/W型和O/W/O型）。然后通過連續(xù)攪拌加入交聯(lián)劑使內(nèi)相固化制備納米粒。常用的交聯(lián)劑有戊二醛、甲醛等。Riegger等采用乳化交聯(lián)法成功制備了殼聚糖納米粒子并裝載了雙氯芬酸和卡馬西平，殼聚糖納米粒子的粒徑隨著殼聚糖分子質(zhì)量的增加而增加，最低粒徑為109.9 nm，最高為200.3 nm[19]。

化學(xué)交聯(lián)法是利用殼聚糖氨基與醛類化合物（戊二醛）進行交聯(lián)發(fā)生氨醛縮合反應(yīng)制備殼聚糖納米粒子的方法。Sadighian等以戊二醛為交聯(lián)劑，與殼聚糖溶液（含鐵離子）進行交聯(lián)反應(yīng)，制備包埋了阿霉素的磁性殼聚糖納米顆粒，阿霉素的有效載藥量達到71%[20]。盡管化學(xué)交聯(lián)法制備的納米粒子穩(wěn)定性好且吸附能力強，但粒徑較大，且戊二醛的添加限制了其在食品中的應(yīng)用。

凝聚法是通過降低殼聚糖在溶液中的溶解度，而析出沉淀制備殼聚糖顆粒，可分為單凝聚和復(fù)凝聚。單凝聚法是將芯材分散于高分子壁材中，通過加入凝聚劑（硫酸鹽等）降低殼聚糖溶解度從而析出制備微球。復(fù)凝聚法是指采用兩種帶有不同電荷的壁材包埋芯材，通過調(diào)節(jié)體系的pH值、溶液濃度及溫度等條件，使不同材料之間相互交聯(lián)，溶解度降低，分離得到微粒。Butstraen等采用復(fù)凝聚法制備阿拉伯樹膠-殼聚糖微膠囊，研究了相體積比、攪拌速率和攪拌時間、pH值、反應(yīng)時間、交聯(lián)劑等條件對微膠囊形成的影響，在最佳條件下微膠囊粒徑在5～10 μm之間[21]。雖然凝聚法包埋率較高但制備的粒子粒徑較大，用于食品抑菌中會出現(xiàn)包埋的抑菌劑釋放速率慢和短期抑菌效果差等缺陷。

噴霧干燥法是將芯材分散在壁材溶液中，然后在熱氣流作用下使溶劑迅速蒸發(fā)，壁材將芯材包埋形成微球粉末。噴霧干燥法具有操作簡單、成本低、利于規(guī)模化生產(chǎn)等優(yōu)點。Tavares等采用噴霧干燥法制備乳清蛋白和殼聚糖復(fù)合納米顆粒包埋大蒜提取物，納米顆粒包封性好、表面無裂紋，對大蒜提取物有良好的保護作用且微粒有較好的水溶性，可用于食品工業(yè)中[22]。Li Yue等采用噴霧干燥法制備殼聚糖包埋橘油的微膠囊，微膠囊平均粒徑小于20 μm，具有規(guī)則的形態(tài)，橘油包埋率在90%以上[23]。盡管噴霧干燥法可批量生產(chǎn)，但粒徑大，且包埋物暴露在高溫中易被破壞（氧化、分解），因此不適用于包埋熱敏性物質(zhì)，在食品中的應(yīng)用受到限制。

自組裝是大分子物質(zhì)通過分子間弱的非共價鍵作用，如氫鍵作用、靜電作用和范德華作用等自發(fā)形成特定結(jié)構(gòu)和功能的有序聚集體。Zou Liqiang等采用層層自主裝法將表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）包埋在殼聚糖納米粒子中，包埋率達到90.8%，能有效地減緩EGCG在模擬腸液中的降解[24]。張力等以明膠和殼聚糖為載體，采用自組裝法制備丁香酚-明膠-殼聚糖納米膠囊。殼聚糖、明膠和丁香酚質(zhì)量濃度分別為2、2、5 mg/mL，交聯(lián)30 min制得的納米粒子粒徑為229.09 nm，包埋率達到50.69%，具有一定的緩釋效果。該工藝提高了丁香酚生物利用度，拓寬了其在食品防腐中的應(yīng)用范圍[25]。

自組裝法制備的聚集體，因不需要添加表面活性劑或乳化劑，具有工藝簡單和可調(diào)控等優(yōu)點，是制備納米粒子的重要手段。此外，殼聚糖分子中存在大量的氨基和羥基，可以接枝眾多官能團從而使殼聚糖具有新的功能。然而，自組裝法制備的聚集體粒徑大、物理穩(wěn)定性能差等缺點使其在食品中的應(yīng)用受到限制。但隨著科技的不斷發(fā)展，自組裝法將會在不同領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用。

2 殼聚糖納米粒子包埋物的體外釋放

包埋物裝載的殼聚糖納米粒子可改變包裹物質(zhì)的釋放方式，從而具有明顯控制其釋放和延長包裹物質(zhì)的體內(nèi)外作用。包裹的納米粒子主要通過4 種方式進行釋放：1）從完整的納米粒子基質(zhì)中擴散；2）通過納米粒子的溶脹進行釋放；3）通過納米粒子的分裂進行釋放；4）通過納米粒子的腐蝕進行釋放（圖2[26]）。

包裹物質(zhì)的溶出度是殼聚糖納米粒子的重要質(zhì)量指標(biāo)，能直接反映殼聚糖納米粒子中包裹物質(zhì)的釋放速率，可用于比較殼聚糖納米粒子的性能。包裹物質(zhì)的釋放速率、殼聚糖納米粒子的理化性質(zhì)（如粒徑尺寸和溶液物化性質(zhì)等）和包埋藥物的比例有密切關(guān)系。如親水性物質(zhì)比親脂性物質(zhì)釋放速率快，粒徑越小、納米粒子表面積越大，藥物釋放速率越快。傳統(tǒng)的溶劑蒸發(fā)和噴霧干燥等技術(shù)制備的殼聚糖納米粒子因骨架密度低，活性物質(zhì)只能吸附在殼聚糖納米粒子表面，無法避免突然釋放，而離子交聯(lián)法可在一定程度上避免上述缺陷。

圖2 包裹在殼聚糖納米粒子中活性成分的釋放機制[26]Fig.2 Release mechanism of active components in chitosan nanoparticles[26]

3 殼聚糖在食品抑菌中的應(yīng)用

3.1 殼聚糖納米粒子的抑菌機理

殼聚糖納米粒子的抑菌機理見圖3[27]。殼聚糖的氨基（—NH3＋）帶正電荷，而細胞壁中的磷脂帶負電荷，兩者的電荷相互吸引導(dǎo)致細胞膜破裂，從而起到抑菌作用；殼聚糖能夠在細胞核中阻止遺傳因子的轉(zhuǎn)錄進而阻礙蛋白質(zhì)合成；此外，殼聚糖的抑菌特性受諸多因素（脫乙酰程度、分子質(zhì)量、微生物種類、離子強度和pH值等）影響[28]。抑菌機理主要依靠殼聚糖納米粒子的尺寸效應(yīng)，納米尺寸的殼聚糖粒子可進入細菌細胞膜的內(nèi)部，引起細胞表面磷脂雙分子層破裂而導(dǎo)致細胞內(nèi)容物的滲漏，使細胞膜內(nèi)外的滲透壓不平衡而導(dǎo)致細菌死亡。

圖3 殼聚糖納米粒子抗菌活性的可能機制[27]Fig.3 Suggested mechanism of antibacterial activity of chitosan nanoparticles[27]

3.2 殼聚糖納米粒子在食品抗菌中的應(yīng)用

殼聚糖納米粒子比殼聚糖具有更強的抗菌性，在食品保鮮包裝中得到廣泛應(yīng)用。Hajji等采用離子交聯(lián)法制備了最小粒徑為121.6 nm的殼聚糖納米粒子，并在4 ℃下對魚糜進行保藏，發(fā)現(xiàn)在9 d的貯藏期內(nèi)殼聚糖納米粒子的涂覆可以抑制微生物的生長和魚糜脂質(zhì)的氧化，有效延長貨架期[29]。此外，由于殼聚糖納米粒子包埋率高、緩釋性好和條件可控等特性，將殼聚糖納米粒子作為包埋物的輸送和緩釋載體也是國內(nèi)外研究的熱點。Liu Yong等以殼聚糖納米粒子作為α-半乳糖苷酶的包埋材料，在最優(yōu)條件下（pH 5.5、殼聚糖質(zhì)量濃度2 mg/mL、α-半乳糖苷酶質(zhì)量濃度0.2 mg/mL、殼聚糖與TPP體積比為4∶1），酶的包埋率超過60%，活性和熱穩(wěn)定性都得到顯著提高[30]。殼聚糖納米粒子可用于包埋各類精油、溶菌酶、魚精蛋白和多酚類物質(zhì)等天然抑菌劑，用于保鮮果蔬、肉制品、奶制品和水產(chǎn)品。

殼聚糖納米粒子包埋抗菌劑不僅可提高活性物質(zhì)的穩(wěn)定性和延長活性物質(zhì)的釋放時間，也可起到緩釋抗菌劑的作用（圖4）。朱玉林等采用聚合物靜電自組裝法制備乳酸鏈球菌肽（Nisin）-殼聚糖納米顆粒，3 d后Nisin-殼聚糖納米顆粒處理的樣品菌落數(shù)仍在3.7（lg（CFU/mL））左右，表明Nisin（乳酸鏈球菌素）可緩慢釋放，對模擬煉乳體系中的李斯特菌具有較好的抑菌效果[31]。Lin Lin等通過離子交聯(lián)法制備包埋辣木精油的殼聚糖納米粒子，最高包埋率（41.3%）時粒徑為143.8 nm，抗菌實驗表明，殼聚糖納米粒子包埋辣木精油用于奶酪在4 ℃下保藏10 d時，李斯特菌和金黃色葡萄球菌分別減少78.63%和98.67%，且對奶酪的感官品質(zhì)幾乎無影響[32]。Li Feng等通過離子交聯(lián)法制備兒茶素和槲皮素同時裝載的殼聚糖納米顆粒，平均粒徑為180.4 nm，兒茶素和槲皮素的包埋率分別為76.35%和52.23%，且均可在體外持續(xù)釋放，包埋后抑菌性能顯著增強，兒茶素和槲皮素裝載的殼聚糖納米粒子對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑分別為13.2 mm和12.85 mm[33]。

圖4 殼聚糖納米粒子中生物活性物質(zhì)的釋放Fig.4 Schematic diagram showing the release of bioactive ingredients from chitosan nanoparticles

肉桂精油作為一種有效的抗菌劑，存在高揮發(fā)性和低穩(wěn)定性的缺點。Matshetshe等利用β-環(huán)糊精改性殼聚糖納米粒子并包埋肉桂精油，包埋體系的最大包埋率和最優(yōu)粒徑范圍分別達到58.03%和216.14～591.92 nm，其體外釋放依賴于環(huán)境的pH值，當(dāng)pH 4.5時，肉桂精油在120 h內(nèi)的釋放量為71%。殼聚糖納米粒子可有效保護肉桂精油以提高其抗菌效果[34]。Hasheminejad等分兩步制備丁香精油裝載的殼聚糖納米粒子，首先以殼聚糖和丁香精油制備成W/O體系，調(diào)節(jié)pH為4.6，以Tween-80作為表面活性劑，然后加入TPP自發(fā)形成納米粒子。在殼聚糖、丁香精油、TPP質(zhì)量比為1∶1∶1時粒徑為268.47 nm，包埋率為31%。抗菌實驗表明與游離精油和殼聚糖納米粒子相比，殼聚糖納米粒子包埋的丁香精油對黑曲霉的抑制作用得到顯著增強，這種良好的抑菌效果與納米粒子對丁香精油的控釋以及殼聚糖納米粒子本身的抑菌特性有關(guān)[35]。Paomephan等研究表明大粒徑和小粒徑的殼聚糖納米粒子對蔬菜中大腸肝菌（減少3.38（lg（CFU/mL）））和沙門氏菌具有顯著的抑菌效果[36]。Kavaz等制備節(jié)莎草根精油裝載的殼聚糖納米粒子（0.25∶1，m/m），粒徑和包埋率分別為119 nm和40.28%，對大腸桿菌的MIC從10 mg/L減少到5 mg/L[37]。已有較多研究表明殼聚糖納米粒子可作為多種抑菌活性物質(zhì)的包埋體系用于保護和提高抗菌性，并廣泛應(yīng)用于食品保鮮中，然而關(guān)于其可控釋放、更深層次的抗菌機理以及安全性還有待進一步研究。包裹活性物質(zhì)的殼聚糖納米粒子制備方法及其抑菌性能如表2所示，殼聚糖納米粒子的包埋在保護生物活性物質(zhì)的同時，還具有很好的緩釋效果。

表2 殼聚糖納米粒子的制備方法和抑菌性能Table 2 Preparation methods and antibacterial properties of chitosan nanoparticles

4 結(jié) 語

殼聚糖具有可食性、生物相容性、無毒、抗氧化和抗菌性等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于食品、環(huán)境、醫(yī)藥和紡織等領(lǐng)域。近年來對殼聚糖的研究不局限于殼聚糖本身，對于殼聚糖衍生物、殼聚糖復(fù)合膜和殼聚糖納米粒子國內(nèi)外都有廣泛報道。其中殼聚糖納米粒子是近5 年來研究的熱點。盡管殼聚糖納米粒子的制備方法較多，但離子交聯(lián)法制備的殼聚糖納米粒子因具有生物安全性高、粒徑小、條件可控和包埋率高等優(yōu)點，在食品領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。

天然抑菌劑穩(wěn)定性差、易受外界環(huán)境（溫度、光照和pH值等）的影響，殼聚糖納米粒子可作為抑菌劑的載體，用于提高包埋物的生物可利用度和拓寬抑菌劑的應(yīng)用領(lǐng)域。此外，納米粒子還可延緩抑菌劑的釋放從而延長食品的貨架期。如何更加有效地控制活性物質(zhì)的釋放和探討殼聚糖納米粒子的抑菌機制仍是后續(xù)需要解決的難題。

殼聚糖納米粒子的生物安全性問題近年來也受到廣泛關(guān)注，有研究報道殼聚糖納米粒子可能會對保鮮對象的組織細胞有殺傷作用。盡管已有大量文獻報道通過細胞噻唑藍檢測和組織切片發(fā)現(xiàn)殼聚糖納米粒子對細胞活性基本沒有影響，但對納米粒子的生物安全性綜合評價也是其在食品抑菌應(yīng)用中需要重視的問題。