腫瘤干細(xì)胞的分選與培養(yǎng)

周瑞婷，何桂媛，李文新，梁貝貝，曾凡軍

（三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，宜昌市中心人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，宜昌 443003)

在惡性腫瘤組織中存在著一類具有高增殖能力、多向分化潛能及壽命長等干細(xì)胞特性的特殊細(xì)胞亞群，即腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell，CSCs），它們在惡性腫瘤的起源、演進(jìn)、浸潤、轉(zhuǎn)移、放化療耐藥、復(fù)發(fā)等方面起到關(guān)鍵作用。這一概念最早由Bonnet[1]于1997年提出，他們通過流式細(xì)胞儀技術(shù)，利用特定表面分子標(biāo)記物CD34+／CD38+在急性髓系白血病細(xì)胞中分離出一小群與造血干細(xì)胞具有相似特征的細(xì)胞。隨后，學(xué)者們陸續(xù)在乳腺癌[2]、前列腺癌[3]、結(jié)腸癌[4]等多種腫瘤組織或細(xì)胞系中證實這類細(xì)胞的存在。然而，惡性腫瘤中CSCs的占比很小，在白血病和乳腺癌中僅分別約占腫瘤細(xì)胞總數(shù)的1%[5]和2%[2]。因此，精準(zhǔn)的分選和成功的培養(yǎng)CSCs是至關(guān)重要的一步。本文詳細(xì)介紹CSCs的分選與培養(yǎng)的方法，并進(jìn)一步分析其優(yōu)勢和局限性。

1 腫瘤干細(xì)胞的分選

CSCs的分選方法總體上可分為依據(jù)其功能分選和細(xì)胞標(biāo)志物分選兩大類。常用的功能篩選試驗包括側(cè)群細(xì)胞分選法、乙醛脫氫酶活性測定法和干細(xì)胞成球試驗；細(xì)胞標(biāo)志物篩選法即結(jié)合CSCs特異性標(biāo)志物和先進(jìn)的細(xì)胞分選技術(shù)，從而分離出高純度的CSCs，其主要包括流式細(xì)胞分選法（fluorescence-activated cell sorting, FACS）、免疫磁珠分選法（magnetic cell sorting, MACS）和激光捕獲顯微切割法（Laser capture microdissection, LCM）。

1.1 功能分選法

CSCs具有一些固有功能屬性，如高ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)、高乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase, ALDH)活性、自我更新、不對稱分裂等，利用這些功能屬性可以高效分離CSCs。

1.1.1 側(cè)群細(xì)胞分選法

側(cè)群(side population, SP）細(xì)胞是Margaret A. Goodell利用核酸染料Hoechst33342和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行造血干細(xì)胞分離時意外發(fā)現(xiàn)的一群特殊細(xì)胞，它特征性地高表達(dá)膜蛋白ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白家族的幾個成員，可以高效率外排染料分子和化療藥物，從而導(dǎo)致SP細(xì)胞耐藥[6]。Haraguchi等[7]從多種胃腸道腫瘤細(xì)胞系分離出SP細(xì)胞，且證實這些細(xì)胞高表達(dá)耐藥性相關(guān)基因ABCG2、ABCB1和CEACAM6等，并表現(xiàn)出CSCs的一些特征。同樣，有學(xué)者通過流式細(xì)胞術(shù)從AML患者[8]、卵巢癌[9]、膠質(zhì)瘤細(xì)胞系[10]、肺癌細(xì)胞系[11]以及乳腺癌細(xì)胞[12]中分離出SP細(xì)胞。雖然SP細(xì)胞分選法不需要細(xì)胞特異性標(biāo)記物進(jìn)行分離，并且可利用此方法從各種組織中富集CSCs，但分離出的群體具有較高異質(zhì)性。此外，由于特異性低、分離細(xì)胞純度低、染料毒性以及染料濃度和染色時間等參數(shù)的影響，該技術(shù)的應(yīng)用受到限制。

1.1.2 乙醛脫氫酶活性測定法

乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase, ALDH）是一組依賴煙酰腺嘌呤核苷酸磷酸（NADP）作為輔酶的催化酶，其生理功能是將內(nèi)源性和外源性醛類物質(zhì)氧化為相應(yīng)的羧酸類物質(zhì)[13]。目前，研究者們也通過檢測腫瘤細(xì)胞內(nèi)ALDH酶的活性來標(biāo)志CSCs。

ALDH是干細(xì)胞增殖和分化的調(diào)節(jié)劑。2007年, Cheung等[14]首次利用Aldefluor實驗在急性粒細(xì)胞白血病病人的腫瘤細(xì)胞中成功分離出ALDH高表達(dá)的ALDH+細(xì)胞, 并進(jìn)一步證實ALDH+急性髓系白血病細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的多項特性。ALDH不僅可以作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物, 其在腫瘤干細(xì)胞調(diào)控機制中可能具有更重要的作用。ALDH的一些亞型可催化細(xì)胞內(nèi)的全反式視黃醛和9-順-視黃醛成為重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子視黃酸。這種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子可以對細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)過程進(jìn)行調(diào)控, 其中包括細(xì)胞的增殖、分化, 細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞凋亡等[13]。除此之外，ALDH還可能參與腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[15]、腫瘤干細(xì)胞化療耐藥[16]及對放療的抵抗[17]等生物學(xué)過程。

1.1.3 干細(xì)胞成球試驗

成球試驗是目前應(yīng)用最廣泛的3D體外模型，該技術(shù)使用添加生長因子（如表皮生長因子、人堿性成纖維細(xì)胞生長因子等）的無血清培養(yǎng)基，在低吸附培養(yǎng)裝置中培養(yǎng)單細(xì)胞懸液系統(tǒng)[18]。這一方法基于CSCs的錨定非依賴生長特性，即其在生長過程中對外源生長刺激因子的依賴減少，失去生長抑制效應(yīng)，使其在懸浮狀態(tài)下能通過克隆增殖形成球體[19]。而除CSCs之外的其他腫瘤細(xì)胞群則不具有這種特性。干細(xì)胞成球試驗簡單易行，不需要復(fù)雜的設(shè)備，但其難點在于區(qū)分腫瘤細(xì)胞球體和細(xì)胞聚集，而且成球的細(xì)胞為處于增殖期或準(zhǔn)備進(jìn)入增殖期的細(xì)胞，因此該模型中缺乏靜止期CSCs，而靜止期CSCs是腫瘤復(fù)發(fā)的主要來源，故成球細(xì)胞實驗在研究藥物對細(xì)胞的作用方面有一定的局限性。

1.1.4 其他功能分選法

除SP細(xì)胞法和ALDH活性測定法之外，其他常用的功能篩選試驗包括利用其化學(xué)藥物抗性和缺氧抗性[20]、物理屬性[21]及親脂性燃料特性[22]等。前兩種方法簡單便捷，但分選的細(xì)胞異質(zhì)性高。利用CSCs親脂性燃料特性的方法稱為標(biāo)記保留法，該方法基于CSCs的不對稱分裂能力，即此類細(xì)胞相對于其他腫瘤細(xì)胞分裂較慢。因此，如果用特定的親脂性和熒光染料標(biāo)記在其細(xì)胞膜上，CSCs比其他細(xì)胞發(fā)出熒光的時間更長[22]。該方法主要用于乳腺癌中CSCs的分選[23]，最近也有研究者應(yīng)用該方法成功從結(jié)直腸癌標(biāo)本中分離出靜止期CSCs[22]。

1.2 細(xì)胞標(biāo)志物分選法

干細(xì)胞標(biāo)記物是分離和識別CSCs的常用工具，但他們大多來源于造血干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞。結(jié)合干細(xì)胞標(biāo)志物與腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物來確定腫瘤干細(xì)胞特異性的標(biāo)志物, 是當(dāng)前腫瘤干細(xì)胞篩選的重要手段。其中，CD44、CD133、CD24等跨膜糖蛋白被視作可靠的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志，在多種不同的惡性腫瘤細(xì)胞系或模型中，研究者們單獨或聯(lián)合應(yīng)用這些標(biāo)記物成功地分離、鑒定了腫瘤干細(xì)胞（表1）。

表1 用于分選腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記物Tab. 1 Biomarkers used for the isolation of CSCs

1.2.1 流式細(xì)胞儀分選法

FACS利用流式細(xì)胞儀可同時對多個標(biāo)記物進(jìn)行定性或定量分析, 是利用特異性標(biāo)記物分離、計數(shù)和分類干細(xì)胞的最常用平臺。傳統(tǒng)的免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)是基于熒光標(biāo)記及熒光發(fā)射光譜檢測的一門綜合性技術(shù), 其多為定性分析,研究者無法獲得細(xì)胞形態(tài)學(xué)、檢測指標(biāo)的亞細(xì)胞定位等信息。成像流式細(xì)胞術(shù)（imaging flow cytometry, IFC）的出現(xiàn)攻克了這一技術(shù)瓶頸，因其整合了流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡成像技術(shù)，既能提供細(xì)胞群的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，又可以獲得單個細(xì)胞的圖像，從而可以更加立體完整的鑒別細(xì)胞。今天，F(xiàn)ACS綜合利用單克隆抗體技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)以及計算機技術(shù)，不僅能夠分離含量極少的細(xì)胞, 還實現(xiàn)了快速精確地對單個細(xì)胞包括生物學(xué)顆粒在內(nèi)等物質(zhì)的理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分選[33,34]。此外，采用質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫組化，結(jié)合高分辨率激光消融，可檢測100余個細(xì)胞和亞細(xì)胞定位的生物標(biāo)記物[33]。這些高通量技術(shù)可能是了解實體瘤中腫瘤干細(xì)胞異質(zhì)性的有力工具。 但另一方面由于其存在成本耗費大、操作技術(shù)要求高以及容易破壞損傷細(xì)胞等缺點, 使其應(yīng)用受到限制。

1.2.2 免疫磁珠分選法

MACS是最標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞分離技術(shù)之一，它是利用與磁珠相連的單抗結(jié)合細(xì)胞表面特異性抗原，從而分選出相應(yīng)的干細(xì)胞群體 。磁珠分選可采用高梯度磁選或低梯度磁選兩種方法。其中，高梯度磁選由磁化的不銹鋼珠或羊毛填充于小容量柱體中組成，它提供了一個均勻的磁場來分離用共軛磁珠標(biāo)記的細(xì)胞。細(xì)胞與羊毛或珠子結(jié)合在一起，通過關(guān)閉磁場以分離被結(jié)合的細(xì)胞。MACS分為正選法和負(fù)選法，前者即磁珠結(jié)合的細(xì)胞被保留，而上清液被丟棄。后者即磁珠結(jié)合不需要的細(xì)胞，游離于上清液的細(xì)胞則為所需細(xì)胞[35]。FACS與MACS的聯(lián)合可近一步提高分離效率，曾有學(xué)者利用FACS對肺組織中CD133+肺癌干細(xì)胞進(jìn)行了分類，并用MACS富集，與陰性對照組相比，NOD/SCID小鼠具有更高的成瘤潛能。這兩種方法的聯(lián)合克服了體外檢測CSCs富集耗時的要求，并證實了CD133可作為肺癌干細(xì)胞標(biāo)志[36]。此外，MACS還與微流控芯片進(jìn)行了良好的集成，以實現(xiàn)以連續(xù)流動的方式對目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行分類。最近，有研究者利用CD24-/CD44+標(biāo)記物，用雙珠免疫磁珠分離法從乳腺癌細(xì)胞系中分離出腫瘤干細(xì)胞。簡言之，在添加CD44磁珠包被抗體之前，先使用非磁珠包裹的抗體，然后使用微流控通道捕獲CD24-/CD44+細(xì)胞。這種雙磁珠免疫磁珠分離可使細(xì)胞分離效率從10.3%（分離前）、19.4%（僅使用抗CD44涂層磁珠）提高到41.7%[37]。MACS已成為細(xì)胞分離的有力工具，但與FACS相比，MACS在CSCs分離中的應(yīng)用受到較多限制，因為MACS不能根據(jù)標(biāo)記的可變表達(dá)來分離細(xì)胞，只能利用細(xì)胞表面標(biāo)記。另外，分離細(xì)胞后磁珠的分離，多個標(biāo)記的分離等一些問題也有待解決。

1.2.3 激光捕獲顯微切割

LCM的基本原理是利用激光裝置發(fā)出的低能紅外激光脈沖，使收集蓋上的熱塑膜——乙烯乙酸乙烯酯共聚物瞬間溶解，包埋特定細(xì)胞群以獲得目的細(xì)胞。腫瘤微環(huán)境在維持腫瘤干細(xì)胞的干性、腫瘤生長以及轉(zhuǎn)移等過程中扮演著十分重要的角色。LCM主要用于從組織樣本中分離細(xì)胞[38]，因此在整體性研究腫瘤、腫瘤干細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境上具有一定優(yōu)勢。由于腫瘤樣本總體往往較小，為了分選出一定量的CSCs，分選效率至關(guān)重要，在流式細(xì)胞術(shù)分選法和免疫磁珠分選法中，腫瘤樣本的酶解處理會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞數(shù)丟失。而LCM技術(shù)用石蠟包埋標(biāo)本，再通過視覺識別、染色、免疫組化或免疫熒光染色對靶細(xì)胞進(jìn)行鑒定，既可較大程度保留CSC，又可通過解剖可視化識別細(xì)胞[39]。最近，有研究者利用此方法從結(jié)腸癌患者（III期）樣本中分離出ALDH陽性（CSCs群體）和ALDH陰性細(xì)胞，以分析CSCs與普通腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)的差異[40]。此外，HeLa細(xì)胞系的活細(xì)胞也被分離出來，并使用重力轉(zhuǎn)移的激光切割進(jìn)行克隆性擴張[41]。由于技術(shù)的進(jìn)步，LCM的一些局限性（如成像和分離固定細(xì)胞）已經(jīng)得到解決，而其他如繁瑣的樣品制備、樣品完整性的喪失等問題仍亟待解決。

相比基于CSCs功能分選方式，通過細(xì)胞標(biāo)記物分選法得到的腫瘤干細(xì)胞純度更高。但細(xì)胞標(biāo)記物分選法也有一定的缺陷：首先，大多數(shù)腫瘤樣本體積小，所以利用此方法分離的細(xì)胞數(shù)量有限；第二，缺乏特異性和靈敏性俱佳的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物，因此需要聯(lián)合使用干細(xì)胞標(biāo)記物和腫瘤標(biāo)記物，由此增加了分選操作的復(fù)雜程度，并影響結(jié)果的準(zhǔn)確性；第三，由于腫瘤樣本需用酶處理（流式細(xì)胞儀分選法、免疫磁珠分選法），此過程可能嚴(yán)重破壞了腫瘤細(xì)胞表面抗原，分選的靈敏性將大幅降低，這可能是此方法最大的癥結(jié)所在。除此之外，分離細(xì)胞的活力低、成本高以及設(shè)備復(fù)雜等多種因素都會影響實驗的準(zhǔn)確率及效率。

2 3D細(xì)胞培養(yǎng)法

CSCs體外培養(yǎng)常用的方法為在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（如DMEM、RPMI1640 等）中加入抑制細(xì)胞分化的細(xì)胞因子來篩取具有干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞。然而，這些方法為限于平板單層細(xì)胞培養(yǎng)的2D培養(yǎng)方法，不能精確的模擬癌細(xì)胞在體內(nèi)的結(jié)構(gòu)特征及微環(huán)境，比如形態(tài)特征、增殖分化潛能、細(xì)胞與細(xì)胞周圍基質(zhì)的相互作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可以彌補2D培養(yǎng)方法的這些缺陷。3D培養(yǎng)法與2D培養(yǎng)法主要的區(qū)別在于其培養(yǎng)基大多為孔徑小于300 nm的納米纖維或隙孔的支架結(jié)構(gòu)，可供腫瘤細(xì)胞附著以形成三維組織結(jié)構(gòu)或囊體[42]。3D培養(yǎng)法結(jié)合微加工技術(shù)和組織工程等先進(jìn)技術(shù)，構(gòu)建出多種細(xì)胞培養(yǎng)平臺，包括多細(xì)胞球體形成（液體覆蓋培養(yǎng)和掛滴法）、水凝膠培養(yǎng)、生物反應(yīng)器培養(yǎng)、生物印刷等。其中，水凝膠培養(yǎng)法中所使用的膠原蛋白和海藻酸鹽是3D細(xì)胞培養(yǎng)最常用的兩種基質(zhì)[43]。由于腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移與細(xì)胞外基質(zhì)成分的改變密切相關(guān)，因此，與2D培養(yǎng)相比，在腫瘤微環(huán)境與腫瘤轉(zhuǎn)移等研究領(lǐng)域，3D細(xì)胞培養(yǎng)具有明顯優(yōu)勢[44]。①3D細(xì)胞培養(yǎng)可模擬腫瘤中血管的生成：腫瘤血管的生成與腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Timmins等[45]發(fā)現(xiàn)其構(gòu)建的3D細(xì)胞培養(yǎng)模型（3D懸滴多細(xì)胞球體）中在加入內(nèi)皮細(xì)胞后可生成微血管結(jié)構(gòu)，且促血管內(nèi)皮生成因子的表達(dá)明顯上調(diào)?？梢姡哂袃?nèi)皮細(xì)胞的3D多細(xì)胞模型比正常2D培養(yǎng)更接近體內(nèi)條件。②3D細(xì)胞培養(yǎng)可以模擬腫瘤細(xì)胞所處的缺氧環(huán)境：3D培養(yǎng)的球體模擬腫瘤塊中的部分核心細(xì)胞因缺氧而發(fā)生基因突變[46]，缺氧條件可激活一些與CSCs密切相關(guān)的信號通路，例如Wnt、Hedgehog（Hh）和Notch等[47]，而2D培養(yǎng)的細(xì)胞與氧氣均勻接觸，不能觀察到氧濃度梯度的變化。③運用3D細(xì)胞培養(yǎng)模型可以更好的研究腫瘤的化療耐性。CSCs在化療耐藥性中起著重要作用，這也是癥治療失敗的主要原因之一。在2D培養(yǎng)中，接觸藥物的表面積與體積比非常大，這使得藥物很容易被吸收，而3D細(xì)胞培養(yǎng)模型能更好地模擬體內(nèi)情況，用于研究藥物的接種、應(yīng)答和耐藥性[42]。已有研究表明，3D培養(yǎng)模型（3D懸滴多細(xì)胞球體）對與球體結(jié)構(gòu)類型相關(guān)的藥物具有更大的耐藥性[48]。

3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)也存在許多缺陷，相較于2D培養(yǎng)系統(tǒng)，它需要更高的成本和時間、較差的重復(fù)性和自動化，而且部分類型細(xì)胞在2D培養(yǎng)中使用的方案在3D條件下并不適用，其標(biāo)準(zhǔn)化程度較低，尤其是在細(xì)胞毒性相關(guān)試驗方面。此外，3D細(xì)胞培養(yǎng)還需要更大的樣本處理能力和專業(yè)知識[42]。

3 展望

自1994年被報道以來，腫瘤干細(xì)胞這一概念已得到了廣泛的重視，成功地分選和培養(yǎng)是進(jìn)一步研究腫瘤干細(xì)胞的前提，也是難題。20余年來，從側(cè)群細(xì)胞培養(yǎng)到利用細(xì)胞標(biāo)記物篩選，從2D培養(yǎng)到3D培養(yǎng)，從細(xì)胞水平到活體水平，一系列分選、培養(yǎng)法被逐漸確立和發(fā)展。我們認(rèn)識到，一方面，這些技術(shù)上的進(jìn)步將有助于我們揭開腫瘤干細(xì)胞的神秘面紗，另一方面，一些不足仍亟待解決，包括：改善腫瘤組織處理方式以減少細(xì)胞數(shù)丟失和細(xì)胞標(biāo)記喪失；尋找具有高度特異性和靈敏性的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記，或者改進(jìn)分選所用的干細(xì)胞標(biāo)記和腫瘤標(biāo)記物組合；探究更多的分子生物學(xué)技術(shù)（如流式細(xì)胞術(shù)、免疫磁珠分選法）、形態(tài)學(xué)技術(shù)（如LCM）應(yīng)用于腫瘤干細(xì)胞分選的可能性。