敲低GLI3抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲和下調(diào)促上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白水平

袁博，常占國(guó)，馬磊

（南陽(yáng)市第一人民醫(yī)院腫瘤1血液科，2腫瘤科，南陽(yáng) 473000）

胃癌（gastric cancer, GC）是世界上第3大常見(jiàn)的癌癥相關(guān)死亡原因[1]。在過(guò)去的幾十年中GC的治療取到了很大的進(jìn)步，但目前GC患者的5年生存率依然很低[2]。導(dǎo)致GC預(yù)后不良的原因在很大程度上與癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的GC復(fù)發(fā)有關(guān)[3]。過(guò)去雖然已經(jīng)對(duì)影響胃癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移的靶點(diǎn)進(jìn)行了大量研究，但依然眾多靶點(diǎn)未被發(fā)現(xiàn)。GLI家族鋅指蛋白3（GLI family zinc finger 3, GLI3）是GLI家族主要成員之一，也被報(bào)道在結(jié)直腸癌、宮頸癌、乳腺癌和前列腺癌等多種實(shí)體癌類(lèi)型中顯著上調(diào)，并能促進(jìn)癌進(jìn)展與轉(zhuǎn)移[4-7]，而GLI3在胃癌中的具體作用和機(jī)制仍不清楚。本研究旨在評(píng)估GLI3在胃癌的作用并分析其相關(guān)的機(jī)制。

材料和方法

1 臨床標(biāo)本和細(xì)胞系

從南陽(yáng)市第一人民醫(yī)院獲得經(jīng)腫瘤切除術(shù)的1～3期胃癌患者（共24例）的胃癌和以及癌旁非腫瘤組織標(biāo)本。本方案均經(jīng)本院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)并征得患者的書(shū)面知情同意。正常胃黏膜細(xì)胞株（GES-1）以及胃癌細(xì)胞株（MKN-45、MGC-803、SGC-790和AGS）細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司，并保持培養(yǎng)在補(bǔ)充有10%胎牛血清（FBS，美國(guó)Invitrogen公司）和1%青霉素/鏈霉素（Invitrogen）的DMEM（美國(guó)sigma公司）正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，在37 ℃的5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。

2 免疫組織化學(xué)染色

將胃癌及癌旁組織用4%多聚甲醛固定過(guò)夜，然后將組織用石蠟包埋并用HS-S7220-B病理切片機(jī)（沈陽(yáng)恒松科技有限公司）切成4 μm切片。按照ABC法檢測(cè)試劑盒（PK-4001，北京中山金橋生物科技有限公司）操作步驟，對(duì)組織切片依次進(jìn)行脫蠟、水化、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和血清封閉后，滴加兔抗GLI3單克隆抗體（1:200；南京Bioworld公司）37 ℃下孵育1 h，PBS洗3次，滴加100 μL生物素-山羊抗兔IgG工作液室溫孵育30 min，PBS洗3次，滴加100 μL辣根過(guò)氧化物酶-鏈霉卵白素工作液室溫孵育室溫孵育30 min，PBS洗3次， 0.1% DAB/0.03%H2O2顯色5 min，蘇木素染色液孵育20 s。在IMM 5000光學(xué)顯微鏡[邁格儀器（蘇州）有限公司]下分析陽(yáng)性染色情況。

3 shRNA轉(zhuǎn)染

GLI3短發(fā)夾RNA（shRNA）（GLI3-1 shRNA和GLI3-2 shRNA）及對(duì)照shRNA（sh-Con）質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。取SGC-790和AGS細(xì)胞至含10% FBS和無(wú)抗生素的DMEM培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)至70%匯合時(shí)，更換shRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基（Santa Cruz）孵育6 h，然后用shRNA轉(zhuǎn)染試劑（Santa Cruz）分別將GLI3-1 shRNA、GLI3-2 shRNA或sh-Con質(zhì)粒轉(zhuǎn)入上述倆種細(xì)胞中，并培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞用Western blot鑒定轉(zhuǎn)染效率后，用于后續(xù)研究。

4 細(xì)胞增殖檢測(cè)

用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）和EdU熒光染色細(xì)胞增殖試劑盒[均亞科因（武漢）生物技術(shù)有限公司]評(píng)估細(xì)胞增殖。CCK-8法：分別將各細(xì)胞按5×103個(gè)/孔接種在96孔板中，培養(yǎng)0～74 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑溶液并37 ℃孵育1 h，F(xiàn)lexA-200酶標(biāo)儀（杭州奧盛儀器有限公司）讀取450 nm波長(zhǎng)的光密度（OD）值。EdU熒光染色：分別將各細(xì)胞按5×103個(gè)/孔接種在96孔板中，加入10 μmol/L EdU試劑37 ℃孵育2 h，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定10 min，DAPI染核。MF-53N熒光顯微鏡（廣州明美光電技術(shù)有限公司）拍攝熒光圖像，并計(jì)數(shù)EdU陽(yáng)性細(xì)胞。

5 細(xì)胞遷移和侵襲測(cè)定

用Transwell小室法評(píng)估細(xì)胞的遷移和侵襲能力。遷移測(cè)定：24孔板的每孔中加入700 μL補(bǔ)充有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，分別將各細(xì)胞按1×104個(gè)/孔（100 μL無(wú)血清但含3% BSA的DMEM培養(yǎng)基）接種在小室的聚碳酸酯膜上，然后將小室鑲套放在24孔板中，37 ℃孵育24 h。擦除膜上側(cè)面細(xì)胞，并將膜下側(cè)細(xì)胞用0.5%結(jié)晶紫染色20 min，光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選4個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞。侵襲測(cè)定需采用基底膜包被小室的聚碳酸酯膜，其余步驟同遷移測(cè)定方法。

6 免疫熒光測(cè)定

將各細(xì)胞鋪板到載玻片，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)粘附后，去除培養(yǎng)基，用兔抗β-連環(huán)蛋白（β-catenin）單克隆抗體（1:200；南京Bioworld公司）在4 ℃過(guò)夜孵育細(xì)胞。PBS洗滌后，用IFKine? Green-驢抗兔IgG[1:500；亞科因（武漢)）物技術(shù)有限公司]室溫孵育1 h，PBS洗滌后，DAPI染核，在Airyscan 2激光掃描共聚焦顯微鏡（卡爾蔡司）下觀察。

7 蛋白質(zhì)印跡分析

收集細(xì)胞并在冰上用RIPA（武漢博士德生物工程有限公司）裂解并提取蛋白。用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）對(duì)蛋白定量后，每個(gè)樣品取20 μg蛋白用WB-600Auto全自動(dòng)蛋白印跡處理系統(tǒng)（廣州博鷺騰生物科技有限公司）進(jìn)行蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜。用5%BSA封膜后，分別加入1:2000稀釋的兔抗β-catenin、N-鈣粘蛋白（N-cadherin）、E-鈣粘蛋白（E-cadherin）和GAPDH一抗（均購(gòu)自南京Bioworld公司）室溫孵育2 h。洗滌膜后，加辣根過(guò)氧化物酶-IPKine小鼠抗兔IgG輕鏈二抗[1:2000；亞科因（武漢）生物技術(shù)有限公司]室溫溫育1 h。通過(guò)ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光[SuperLumia HRP底物ECL Plus超敏試劑盒，亞科因（武漢）生物技術(shù)有限公司]顯影，用GelView6000 ProⅡ多功能圖像工作站（廣州博鷺騰生物科技有限公司）采集圖像，并用光密度法對(duì)標(biāo)記蛋白條帶定量。

8 統(tǒng)計(jì)分析

用GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。 采用方差分析各組的差異，用Tukey法對(duì)各組均數(shù)進(jìn)行多重比較。P值小于0.05被定義為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 GLI3在胃癌組織和胃癌細(xì)胞中高表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)GLI3在正常胃粘膜組織和不同分期的胃癌組織中的表達(dá)顯示，GLI3表達(dá)在癌旁組織的正常胃粘膜中呈陰性，在胃癌組織中呈陽(yáng)性且而隨著分期的增加而增強(qiáng)（圖1A）。在不同的胃癌細(xì)胞系中，與正常胃粘膜細(xì)胞GES-1相比，胃癌細(xì)胞系中GLI3的表達(dá)水平均增高（圖1B）。上述數(shù)據(jù)證明，GLI3在胃癌組織和胃癌細(xì)胞系中表達(dá)上升。

圖1 GLI3在胃癌組織和胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)。A，免疫組織化學(xué)染色法顯示GLI3在癌旁正常組織、TNM 1-3期胃癌組織中表達(dá)的代表性圖像；比例尺，200 μm。B，正常人胃粘膜細(xì)胞和不同胃癌細(xì)胞系中GLI3表達(dá)的代表性Western blot檢測(cè)結(jié)果和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；與正常人胃粘膜細(xì)胞（GES-1）比較：***P＜0.001；n=4Fig. 1. Expression of GLI3 in gastric cancer tissues and cell lines. A, representative immumohistochemical staining images showing the expression and distribution of GLI3 in para-cancer normal tissue, TNM Stage 1-3 gastric cancer tissue; scale bar, 200 μm. B, representative Western blot detection results and statistical analysis for the expression levels of GLI3 in normal human gastric mucosa cells and different gastric cancer cell lines; compared with normal human gastric mucosa cells (GES-1): ***P＜0.001; n=4

2 敲低GLI3抑制胃癌細(xì)胞增殖

CCK-8法和EdU染色法檢測(cè)顯示：有效敲低GLI3表達(dá)（圖2A）后，SGC-790和AGS細(xì)胞的活力（圖2B）和增殖能力（圖2C）均明顯降低。

圖2 敲低GLI3對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響。A，GLI3 shRNA沉默SGC-790和AGS細(xì)胞中GLI3表達(dá)效率的Western blot檢測(cè)與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；與對(duì)照shRNA比較：**P＜0.01, n=4。B，敲低GLI3對(duì)SGC-790（上）和AGS（下）細(xì)胞活力影響的CCK-8法檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；與對(duì)照shRNA比較：*P＜0.05，***P＜0.001，n=4。C，敲低GLI3對(duì)SGC-790（上）和AGS（下）增殖影響的EdU染色檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；比例尺，100 μm；與對(duì)照shRNA比較：**P＜0.01, ***P＜0.001；n=4Fig. 2 Effect of knocking-down GLI3 on the proliferation of gastric cancer cells. A, Western blot detection and statistical analysis for the efficiency of Gli3 shRNA silencing Gli3 expression in SGC-790 and AGS cells; compared with the control shRNA: **P＜0.01, n=4. B, CCK-8 assay and statistical analysis for the effect of knocking-down GLI3 on cell viability of SGC-790 (upper) and AGS (lower) cells; compared with the control shRNA: *P＜0.05, ***P＜0.001, n=4. C, EdU staining examination and statistical analysis for the effect of knocking-down GLI3 on proliferation of SGC-790 (upper) and AGS (lower) cells; scale bar, 100 μm; compared with the control shRNA: **P＜0.01, ***P＜0.001; n=4

3 敲低GLI3抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲

Transwell檢 測(cè) 顯 示：敲 低GLI3表 達(dá) 后， SGC-790和AGS細(xì)胞的遷移（圖3A）和侵襲（圖3B）均明顯降低。

圖3 敲低GLI3對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響。A，敲低GLI3對(duì)SGC-790和AGS細(xì)胞遷移影響的Transwell法檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；B，敲低GLI3對(duì)SGC-790和AGS侵襲影響的Transwell法檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；比例尺，100 μm；與對(duì)照shRNA比較：**P＜0.01, ***P＜0.001；n=4Fig. 3 Effect of knocking-down GLI3 on the migration and invasion of gastric cancer cells. A, Transwell examination and statistical analysis for the effect of knocking-down GLI3 on migration of SGC-790 and AGS cells; B, Transwell assay and statistical analysis for the effect of knocking-down GLI3 on invasion of SGC-790 and AGS cells; scale bar, 100 μm; compared with the control shRNA: **P＜0.01, ***P＜0.001; n=4

4 敲低GLI3降低胃癌細(xì)胞β-catenin和N-cadherin水平增加E-cadherin水平

免疫熒光染色顯示：在對(duì)照SGC-790和AGS細(xì)胞中，β-catenin在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均強(qiáng)表達(dá)，而用GLI3 shRNA沉默GLI3表達(dá)后，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中β-catenin表達(dá)均明顯減弱，特別是細(xì)胞核中幾乎不表達(dá)（圖4A）。Western blot檢測(cè)表明，沉默GLI3顯著降低SGC-790和AGS細(xì)胞中β-catenin和N-cadherin水平，增加E-cadherin水平（圖4B）。

圖4 . 敲低GLI3對(duì)胃癌細(xì)胞β-catenin、N-cadherin和E-cadherin水平的影響。A，沉默GLI3表達(dá)對(duì)SGC-790和AGS細(xì)胞內(nèi)β-catenin表達(dá)影響的免疫熒光觀察；比例尺，20 μm。B，沉默GLI3表達(dá)對(duì)SGC-790和AGS細(xì)胞內(nèi)β-catenin、N-cadherin和E-cadherin水平影響的Western blot法檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；與對(duì)照shRNA比較：***P＜0.001；n=4Fig. 4 Effect of knocking-down GLI3 on the levels of β-catenin, N-cadherin and E-cadherin in the gastric cancer cells. A, immunofluorescent observation on the effect of silencing GLI3 expression on the expression of β-catenin in SGC-790 and AGS cells; scale bar, 20 μm. B, Western blot assay and statistical analysis for the effect of silencing GLI3 expression on the levels of β-catenin, N-cadherin and E-cadherin in SGC-790 and AGS cells; compared with the control shRNA, ***P＜0.001; n=4

討論

發(fā)掘能影響胃癌增殖與轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)并闡明其影響胃癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，可能為胃癌患者的個(gè)體化治療提供新的見(jiàn)解[3,8]。眾多報(bào)道[4-7]顯示，GLI3在惡性實(shí)體腫瘤中能發(fā)揮促癌作用，而其在胃癌中的作用尚不清楚。本研究顯示，GLI3表達(dá)隨胃癌進(jìn)展而遞增，敲低GLI3能抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲，表明GLI3可能是胃癌的一個(gè)有前途的生物標(biāo)志物。

癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及癌細(xì)胞招募內(nèi)皮細(xì)胞并形成腫瘤微血管、癌細(xì)胞通過(guò)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）獲得間質(zhì)特性，使它們能夠進(jìn)入血流并侵入人體的其他器官[9]。越來(lái)越多的研究表明EMT在包括胃癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移中起著重要作用[10-11]，并且EMT還能在癌癥侵襲轉(zhuǎn)移的過(guò)程中能促進(jìn)惡性腫瘤進(jìn)展[12]。研究[13-14]顯示，抑制EMT能抑制胃癌細(xì)胞的遷移與侵襲。E-cadherin和N-cadherin是EMT進(jìn)程的重要的上皮表面標(biāo)記分子，E-cadherin表達(dá)降低和N-cadherin表達(dá)增加往往代表著EMT啟動(dòng)，同時(shí)經(jīng)常伴隨著腫瘤細(xì)胞遷移與侵襲的增強(qiáng)[10-14]。本研究結(jié)果顯示，在胃癌細(xì)胞中敲低GLI3能上調(diào)E-cadherin和下調(diào)N-cadherin，提示敲低GLI3能抑制胃癌細(xì)胞EMT。此外結(jié)合前面結(jié)果，敲低GLI3能發(fā)揮對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的抑制作用，進(jìn)一步提示敲低GLI3抑制胃癌細(xì)胞侵襲與遷移可能與其抑制EMT有關(guān)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)敲低GLI3能降低β-catenin表達(dá)豐度。β-catenin是一個(gè)多功能蛋白，其能直接與E-cadherin形成復(fù)合物，也能通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等間接與E-cadherin形成復(fù)合物，進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞EMT；而β-catenin表達(dá)降低的作用相反[15-17]。β-catenin還能與下游分子細(xì)胞周期蛋白D結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞增殖，而下調(diào)β-catenin則抑制胃癌細(xì)胞增殖[18]。以上結(jié)果顯示，敲低GLI3對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲與遷移的抑制作用可能與其抑制EMT與β-catenin表達(dá)有關(guān)。