山奈酚抑制腦缺血/再灌注大鼠的腦損傷、炎癥、氧化應(yīng)激和凋亡

張麗陽，孫軍，陳迪

（南陽市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，南陽 473000）

缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）發(fā)生后，應(yīng)及早恢復(fù)腦灌流，但腦缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）的過程依然會(huì)造成神經(jīng)損傷，且腦I/R損傷不可避免[1]。目前研究[2-4]顯示，腦I/R引起的腦損傷主要包含炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、興奮性谷氨酸毒性和神經(jīng)元凋亡等。山奈酚（3,4’,5,7-四羥基黃酮，kaempferol，Kae）是一種天然的黃酮類化合物，有抗炎和抗氧化作用[5]。Kae在脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化和動(dòng)物神經(jīng)炎癥模型中的抗炎和抗氧化作用已被廣泛報(bào)道[5-8]，但其對腦I/R引起的腦損傷治療潛力和分子機(jī)制仍不清楚。在本研究中，我們研究了Kae對腦I/R大鼠的治療作用，并探討了其可能的機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 試劑與抗體

Kae（純度≥98%；上海純優(yōu)生物科技有限公司）；TTC染色試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司）；RIPA緩沖液和TUNEL染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；兔源神經(jīng)元核抗原（neuronal nuclei antigen，NeuN）抗體（英國Abcam公司）；兔源Cleaved Caspase-3、Caspase-3、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）抗體（美國CST公司）；兔源β-actin抗體和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；Alexa Fluor 647或HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(H+L)抗體（北京百奧萊博科技有限公司）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（南京建成生物研究所）；3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine，3-NT）ELISA檢測試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

35只清潔級雄性SD大鼠（6～7周齡，210～230 g）購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物生成許可證號：SCXK(鄂) 2020—0019]。所有大鼠被安置在恒溫（22±1）℃、恒濕（50～60）%和12 h/12 h光暗循環(huán)的屏障環(huán)境動(dòng)物房內(nèi)，可自由獲得標(biāo)準(zhǔn)的飲食和飲用水。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型制作與分組

用大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）法誘發(fā)局灶性腦I/R損傷。大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為假手術(shù)（Sham）組（n=11）、MCAO組（n=12）和MCAO+Kae組（n=13）。MCAO組和MCAO+Kae組大鼠參照文獻(xiàn)[9]方法，腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉大鼠后，從頸正中切口，暴露并分離左頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，用縫合線打活結(jié)結(jié)扎翼顎動(dòng)脈同時(shí)遠(yuǎn)心端結(jié)扎頸外動(dòng)脈，將線栓小心地從頸外動(dòng)脈切口插入頸內(nèi)動(dòng)脈，直到線栓的頭部到達(dá)頸內(nèi)動(dòng)脈和大腦中動(dòng)脈的分叉處；1 h后，打開活結(jié)并抽出線栓以通過再灌注恢復(fù)對大腦中動(dòng)脈區(qū)域的血液供應(yīng)。Sham組大鼠除不進(jìn)行縫合線閉塞翼顎動(dòng)脈和插入線栓外接受其余相同的手術(shù)程序。再灌注2 h后，剔除發(fā)生持續(xù)喪失意識或抽搐的大鼠，最終Sham組、MCAO組和MCAO+Kae組各納入11只。再灌注4 h后，MCAO+Kae組每天給予灌胃100 mg/kg Kae[10]，持續(xù)7 d；Sham組和MCAO組給予等體積生理鹽水。

2.2 神經(jīng)功能學(xué)評分

按照Durukan等[11]方法對MCAO術(shù)后7 d各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷進(jìn)行評分，0分表示無神經(jīng)功能缺陷，分?jǐn)?shù)越高則提示神經(jīng)缺陷越嚴(yán)重，12分為意識喪失或死亡。

2.3 TTC染色

MCAO術(shù)后7 d，每組各取5只大鼠，麻醉后，通過斷頭取出全腦。全腦在-20 ℃快速冷凍30 min，然后制成連續(xù)2 mm厚的冠狀切片。并將腦片在2% TTC染色液中避光染色20 min，然后用4%多聚甲醛固定4 h。TTC染色結(jié)果用Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行數(shù)字掃描和分析。

2.4 核磁共振成像

剩余大鼠使用吸入麻醉劑（一氧化二氮/氧氣/異氟醚混合氣=68.5% / 30% / 1.5%）麻醉后，將大鼠用非磁性搖籃固定頭部，用小動(dòng)物核磁共振成像（MRI）儀（NM42-040H-I；蘇州紐邁分析儀器股份有限公司）成像。

2.5 微正電子發(fā)射斷層掃描

大鼠使用吸入麻醉劑麻醉后，將大鼠置于掃描床上，用小動(dòng)物微正電子發(fā)射斷層掃描（PET）活體成像儀（法國Inviscan公司）對頭部血流成像。

2.6 TUNEL與NeuN免疫熒光雙染

剩余大鼠麻醉后處死，取左側(cè)腦半球并按常規(guī)法用石蠟包埋后，切成6 μm厚的腦片。腦片經(jīng)脫蠟復(fù)水后，滴加20 mg/mL蛋白酶K并在室溫下作用20 min，用PBS洗滌后，滴加50 μL FITC標(biāo)記TdT酶工作液（TUNEL檢測液）在室溫孵育1 h，用PBS洗滌3次。用10%山羊血清封閉30 min，滴加NeuN抗體（1:500稀釋）室溫孵育2 h，PBS洗滌后，滴加Alexa Fluor 647標(biāo)記羊抗兔IgG(H+L)抗體（1:500稀釋）室溫孵育1 h。在熒光顯微鏡下觀察并獲取圖像，用Image-Pro Plus 6.0計(jì)算TUNEL陽性神經(jīng)元比例。

2.7 試劑盒法測量腦組織中MDA和3-NT水平

取左側(cè)半球腦組織，用10倍體積的冷PBS勻漿后，收集勻漿液并用BCA法對勻漿液中蛋白定量。按照試劑盒說明書步驟，用硫代巴比妥酸法測量勻漿液中MDA水平，用ELISA法測量勻漿液中3-NT水平；然后根據(jù)勻漿中蛋白的含量，將勻漿中MDA和3-NT水平換算成腦組織中MDA和3-NT水平。

2.8 Western blot

取左側(cè)半球腦組織，用10倍體積的冷RIPA緩沖液在冰上勻漿，并以13000 r/min離心15 min，收集上清液。用BCA法對上清液中蛋白定量。每樣品取45 μg蛋白并加入加載緩沖液混合，并在100 ℃加熱10 min后，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。用5%牛血清白蛋白在含吐溫-20的Tris緩沖鹽水（TBST）中封閉膜1 h，然后與抗Cleaved caspase-3（1:500稀釋）、Caspase-3（1:4000稀 釋）、TNF-α（1:2000稀釋）、IL-1β（1:1000稀釋）和β-actin（1:8000稀釋）抗體孵育過夜，用TBST液洗滌3次后，將膜與HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(H+L)二抗（1:1000稀釋）在室溫下孵育2 h，然后用ECL系統(tǒng)顯影。用Image-Pro Plus軟件分析蛋白條帶的光密度值，目的蛋白相對水平=目的蛋白光密度值/β-actin光密度值。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間均數(shù)的倆倆比較采用單因素方差分析后Bonferroni校正。P＜0.05則認(rèn)為差異具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 Kae減輕I/R大鼠腦損傷

為研究Kae對I/R大鼠腦損傷的影響，對MCAO大鼠連續(xù)給藥Kae 7 d，然后評估神經(jīng)功能、腦梗死和腦血流。與Sham組比較，MCAO組大鼠神經(jīng)功能缺損評分明顯增高（圖1A），說明MCAO組大鼠的神經(jīng)功能缺損；經(jīng)Kae給藥后，神經(jīng)功能有所改善。TTC染色（圖1B、C）顯示，Kae給藥能降低MCAO大鼠的腦梗死灶的體積，且這一現(xiàn)象在MRI（圖1D）中得到驗(yàn)證。另外，用PET/CT觀察了Kae對MCAO大鼠腦血流量的影響，結(jié)果（圖1E）顯示Kae給藥能增加MCAO大鼠缺血邊界區(qū)域的腦血流量。

圖1 Kae對I//R大樹神經(jīng)功能、腦梗死及腦血流的影響。A，神經(jīng)功能缺損評分的定量分析（n=11）；B和C，代表性的腦切片TTC染色圖像（B）和腦梗死體積的定量分析（C）（n=5）；D，代表性MRI圖像；E，代表性PET圖像。與Sham組比較，*P＜0.001；與MCAO組比較， #P＜0.01。Fig. 1 The effect of Kae administration on the neurological function, cerebral infarction and cerebral blood flow of the I/R rats. A, quantitative analysis of neurological deficit score (n=11); B and C, representative images of TTC stained brain sections (B) and quantitative analysis of cerebral infarction volume (C) (n=5); D, representative MRI images; E, representative PET images. *P＜0.001, compared with Sham group; #P＜0.01, compared with MCAO group

2 Kae減少I/R大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元凋亡

用TUNEL和NeuN雙染色定位觀察神經(jīng)元凋亡顯示，與Sham組比較，MCAO組缺血半暗帶中細(xì)胞凋亡（TUNEL陽性細(xì)胞）增多，神經(jīng)元（NeuN陽性細(xì)胞）減少，且神經(jīng)元凋亡（TUNEL和NeuN雙陽性細(xì)胞）增多；與MCAO組比較，MCAO+Kae組細(xì)胞凋亡減少，神經(jīng)元數(shù)量較多，且神經(jīng)元凋亡減少（圖2）。

圖2 Kae給藥對I/R大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元凋亡的影響。A，代表性TUNEL和NeuN雙免疫熒光染色圖像（比例尺=100 μm）；B，TUNEL染色陽性細(xì)胞的定量分析。與Sham組比較，***P＜0.001；與MCAO組比較，##P＜0.01；n=6Fig. 2 The effect of Kae administration on neuronal apoptosis in the brain of the rats with I/R. A, representative double immunofluorescent staining images of TUNEL and NeuN (scale bar, 100 μm); B, quantitative analysis of TUNEL staining positive cells. ***P＜0.001, compared with Sham group; ##P＜0.01, compared with MCAO group; n=6

3 Kae抑制I/R大鼠腦內(nèi)MDA、3-NT、IL-1β、TNF-α和Cleaved caspase-3的升高

與Sham組比較，MCAO組腦組織中MDA和3-NT水平明顯增高（圖4A、B）；與MCAO組比較，Kae給藥后MDA和3-NT水平明顯降低。Western blot檢測與大腦凋亡和炎癥相關(guān)的標(biāo)志蛋白顯示，與Sham組比較，MCAO組腦組織中Cleaved caspase-3、IL-1β和TNF-α水平明顯增高；與MCAO組比較，Kae給藥后上述指標(biāo)明顯降低（圖4C）。

討論

腦I/R是恢復(fù)IS患者腦血灌流過程中所經(jīng)歷的必然步驟，但腦I/R所帶來的腦損傷也不可忽視，甚至其也是導(dǎo)致IS患者不良預(yù)后甚至死亡的主要因素之一[1]。目前尚無避免腦I/R損傷的辦法，因此，如何減輕腦I/R所致的腦損傷成為IS治療研究的主要方向。MCAO/再灌注大鼠模型是目前研究腦I/R損傷的經(jīng)典模型[12]，且絕大多數(shù)IS患者的治療具有滯后性，造成缺血前預(yù)處理方式的應(yīng)用范圍極窄，因此本研究采用MCAO大鼠模型并在再灌注后給藥方式研究Kae對腦I/R損傷的影響，結(jié)果顯示，Kae給藥能改善MCAO大鼠的神經(jīng)功能、減輕腦梗死并增加腦血流，提示Kae可能是潛在的抗腦I/R損傷的藥物。

神經(jīng)元凋亡是影響IS患者預(yù)后的運(yùn)動(dòng)、學(xué)習(xí)和語言等各種生理功能的主要因素[4]。在腦缺血發(fā)生后，在缺血半暗帶依然有神經(jīng)元存活，雖然恢復(fù)血液灌流是拯救缺血半暗帶中神經(jīng)元必要策略，但腦I/R依然也會(huì)引起存活的神經(jīng)元發(fā)生二次傷害[4]，因此如何減輕腦I/R后缺血半暗帶中存活的神經(jīng)元的二次損傷尤為關(guān)鍵。本研究顯示，Kae給藥能減少缺血半暗帶中神經(jīng)元凋亡，提示Kae可能有助于腦I/R后的功能恢復(fù)。許多證據(jù)[13-14]表明，神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的再灌注損傷主要是由炎癥損傷引起的，包括小膠質(zhì)細(xì)胞的激活在內(nèi)許多細(xì)胞事件都有助于腦I/R后的炎癥過程。此外，炎癥能導(dǎo)致線粒體功能障礙、降低超氧化物歧化酶活性、擾亂活性氧產(chǎn)生和解毒之間的平衡，且這些氧自由基會(huì)攻擊細(xì)胞膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和糖胺聚糖，進(jìn)而會(huì)進(jìn)一步放大炎癥級聯(lián)反應(yīng)并導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，加重神經(jīng)損傷[15-16]。據(jù)報(bào)道，Kae在脂多糖誘導(dǎo)的炎癥和小膠質(zhì)細(xì)胞活化中具有抗炎和抗氧化損傷作用[6-8,10]，而Kae對腦I/R大鼠的保護(hù)作用尚不完全清楚。本研究顯示，Kae能降低MCAO大鼠腦組織中氧化應(yīng)激標(biāo)記物MDA和3-NT水平以及促炎標(biāo)記物IL-1β和TNF-α和凋亡關(guān)鍵因子Cleaved caspase-3的表達(dá)，提示Kae的神經(jīng)保護(hù)作用可能與抗炎、抗氧化以及抑制神經(jīng)元凋亡有關(guān)。

圖3 . Kae給藥對MCAO大鼠腦組織中MDA、3-NT、IL-1β、TNF-α和Cleaved caspase-3表達(dá)的影響。A，MDA水平的定量分析；B，3-NT水平的定量分析；C，IL-1β、TNF-α和Cleaved Caspase-3表達(dá)水平的代表性Western blot檢測與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。與Sham組比較，***P＜0.001；與MCAO組比較，###P＜0.001；n=6Fig. 3 Effects of Kae administration on the levels of MDA, 3-NT, IL-1β, TNF-α and Cleaved Caspase-3 in the brain of the I/R rats. A, quantitative analysis of MDA levels; B, quantitative analysis of 3-NT levels; C, representative Western blot detection and statistical analysis for levels of IL-1β, TNF-α and Cleaved Caspase-3. ***P＜0.001, compared with Sham group; ##P＜0.01, compared with MCAO group; n=6

綜上所述，Kae對MCAO大鼠具有改善神經(jīng)功能、減輕腦梗死和增加腦灌流的作用；抗氧化、抗炎和降低神經(jīng)元凋亡作用可能是Kae在抗I/R誘導(dǎo)的腦損傷機(jī)制中的關(guān)鍵因素。然而，腦I/R過程中的病理過程是復(fù)雜的，因此Kae在腦I/R中的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制任需進(jìn)一步的研究。此外，本研究結(jié)果為開發(fā)Kae作為一種有潛在的治療中風(fēng)的藥物提供了有利依據(jù)，但其臨床療效有待于進(jìn)一步證實(shí)。