鎘、銅、鎳和鉛等重金屬離子抑制牛蛙消化道黏膜POX、NSE、SDH、ACP、ALP和ATPase活性

米紀聰，黃鴻斌，吳煜，陳嫻嫻，張盛周

（安徽師范大學生命科學學院，安徽省重要生物資源保護與利用重點實驗室，蕪湖 241000）

隨著現(xiàn)代工業(yè)的快速發(fā)展，人類增加了對重金屬資源的開發(fā)和利用，大量重金屬隨著工業(yè)廢水流入水體中給不少水環(huán)境造成污染[1]。由于水生生物與水體的密切接觸，水體中的重金屬很容易通過進食、皮膚吸收、隨血液循環(huán)進入水生動物的各個器官和組織[2]。重金屬一旦進入水生生物體內(nèi)不易被代謝和排出，容易在生物體內(nèi)富集積累[3]。不斷積累的重金屬會對生物體各器官造成嚴重損傷，特別是呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)和生殖系統(tǒng)以及消化道[4]。目前對重金屬的生物毒性機理還不是很清楚，不少研究表明重金屬可影響生物體內(nèi)多種酶的活性對水生生物的正常生命活動造成毒害[5]。

牛蛙（Rana catesbiana）隸屬于兩棲綱無尾目蛙科，是世界上最受歡迎的大型食用蛙，自1959年首次從古巴引進中國以來深受廣大消費者的喜愛，是我國主要的商業(yè)型水產(chǎn)養(yǎng)殖動物之一[6,7]。朱聯(lián)九等[8]研究了成體牛蛙消化液蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纖維素酶在消化道的分布以及pH和溫度對這些酶活性的影響。韋金鑫等[9]研究了牛蛙消化道黏膜堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、腺苷三磷酸酶、酯酶和脂酶的分布。但重金屬對牛蛙消化道黏膜中酶活性的影響尚未見報道。本研究用不同濃度重金屬離子溶液處理組織，應(yīng)用酶組織化學方法檢測了Cd2+、Cu2+、Ni2+、Pb2+等4種常見重金屬對牛蛙消化道黏膜過氧化物酶（peroxidase, POX）、非特異性酯酶（nonspecific esterase, NSE）、琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase, SDH）、酸性磷酸酶（acid phosphatase, ACP）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）、腺苷三磷酸酶（adenosine triphosphatase, ATPase）等6種酶活性的影響，旨在探討重金屬離子對牛蛙的毒理作用，為牛蛙的人工潔凈養(yǎng)殖和環(huán)境保護提供基礎(chǔ)資料。

材料與方法

1 實驗材料

人工養(yǎng)殖成體牛蛙10只，重300～430 g，購自蕪湖市黃山西路菜市場。穿刺毀髓，解剖，迅速取出完整的消化道，分別在食道、胃賁門、胃體、胃幽門、十二指腸、空腸、回腸和直腸黏膜切取小塊組織。用磷酸緩沖液（PBS，pH7.4）快速洗凈，吸水紙輕輕吸干，OCT包埋，使用冰凍切片機于-26 ℃下切片，厚度為8 μm，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2 重金屬溶液配置

分別稱取氯化鎘(CdCl2·2.5H2O) 0.228 g；無水硫酸銅(CuSO4) 0.25 g；氯化鎳(NiCl2·6H2O) 0.237 g；硝酸鉛Pb(NO?)? 0.331 g溶于5 mL去離子水配置成0.2 mol/L的Cd2+、Cu2+、Ni2+、Pb2+母液，使用時稀釋成相應(yīng)的工作濃度。重金屬試劑均是國產(chǎn)分析純。

3 重金屬處理方法

選取酶在消化道8個部位中活性最高的部位進行重金屬溶液處理。POX、NSE、ALP、ACP、ATPase設(shè)置0.2 mol/L、0.02 mol/L、0.002 mol/L 3種梯度的重金屬溶液進行處理，由于預(yù)實驗結(jié)果顯示SDH相較于其它幾種酶對重金屬的影響更加敏感，SDH設(shè)置2×10-1～2×10-7mol/L 7種濃度梯度的重金屬溶液進行處理，對照組采用0.7%生理鹽水進行處理。將300 μL重金屬溶液滴加在冰凍切片組織上，室溫（25 ℃）孵育30 min后用去離子水洗去，吸水紙洗去剩余水后用酶組織化學方法染色。

4 酶組織化學方法

牛蛙消化道6種酶的組織化學染色方法和主要底物見表1。 實驗試劑的全名、詳細配制方法及具體操作步驟參見文獻[10]。

表1 6種酶的組織化學染色方法和主要底物Tab. 1 Histochemical staining techniques and main substrates of the six investigated enzymes

5 光密度測定與數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用Olympus BX61型號顯微鏡，在40倍物鏡視野下，觀察切片并拍照記錄。采用Image-ProPlus圖像分析軟件，對酶組織化學染色陽性部位進行光密度分析，測算得到照片中陽性部位的累積光密度（intergrated optical density, IOD)和面積（area），算出平均光密度（mean optical density, MOD），以平均光密度值表示消化道各部位酶活性的強弱；采用單因素方差分析(one-way ANOVA)對各種酶的活性變化進行差異顯著性比較，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

結(jié)果

1 高濃度Cd2+、Ni2+和Cu2+抑制POX活性

POX的酶組織化學陽性顯色結(jié)果為棕黃色和黃色。POX在消化道各段均有分布，其中在直腸酶活性最高。POX在消化道黏膜上皮中分布最多，在固有層中也有少量分布，其反應(yīng)物呈現(xiàn)顆粒狀分布（圖1左）。Cd2+和Ni2+在0.2 mol/L濃度時對POX的活性有相似的抑制效應(yīng)，其抑制程度要強于0.2 mol/L的Cu2+；這3種重金屬在0.02 mol/L和0.002 mol/L濃度時對POX活性無顯著影響；Pb2+則在3種濃度下對其活性均無顯著影響（圖1左，圖3A）。

圖1 Cd2+、Cu2+、Ni2+和Pb2+對POX、NSE、SDH活性影響的組織化學檢測。L，消化道腔；LP，固有層；ME，黏膜上皮；FG，胃底腺體；SB，紋狀緣；比例尺，50 μmFig. 1 Histochemical examination for the effects of Cd2+, Cu2+, Ni2+ and Pb2+ on the activities of POX, NSE and SDH. L, digestive tract lumen; LP, lamina propria; ME, mucosal epithelium; FG, fundus gland; SB, striated border; scale bar, 50 μm

2 Ni2+和Pb2+抑制NSE活性

NSE的酶組織化學陽性顯色結(jié)果為棕紅色。其在消化道各段均有較高活性，其活性在十二指腸部位最高。NSE在十二指腸中主要分布于黏膜上皮中且活性在紋狀緣處最高，在固有層中也有一定量的分布（圖1中）。 Cd2+和Cu2+在3種濃度下均對NSE的活性無顯著影響，而Ni2+在0.2 mol/L時對NSE的活性有顯著的抑制作用，Pb2+則在0.2 mol/L和0.02 mol/L兩種濃度下對NSE活性有顯著的抑制作用（圖3B）。

3 Cd2+、Cu2+、Ni2+和Pb2+均能抑制SDH活性

SDH的酶組織化學陽性顯色結(jié)果為藍紫色。其在消化道各段均有分布，胃體中活性顯著較高。SDH在胃部主要分布于胃底腺處(圖1右)。SDH對重金屬的敏感度遠高于其它5種酶。Cd2+和Cu2+對SDH的活性有著相似的抑制作用，均在2×10-1mol/L到2×10-4mol/L范圍內(nèi)完全抑制其活性，在2×10-5mol/L也有顯著的抑制作用。Pb2+對SDH活性的抑制作用要弱于Cd2+和Cu2+，其在2×10-1mol/L到2×10-3mol/L范圍內(nèi)完全抑制其活性，在2×10-4mol/L濃度下顯著抑制其活性。Ni2+相對其它3種重金屬，對SDH活性抑效應(yīng)最弱，只在2×10-1mol/L濃度下完全抑制，在2×10-2mol/L到2×10-3mol/L范圍內(nèi)顯著抑制其活性（圖3C）。

4 高濃度Cu2+和Pb2+抑制ACP活性

ACP的酶組織化學陽性顯色結(jié)果為棕黃色。ACP在消化道各段均有分布，在胃幽門處活性最高。ACP在消化道中主要分布在粘膜上皮中，在固有層中也有少量的分布（圖2左）。Cd2+和Ni2+在3種濃度條件下均對ACP的活性無顯著影響。Cu2+和Pb2+僅在0.2 mol/L時對ACP的活性存在顯著抑制作用，且Cu2+的抑制效應(yīng)要強于Pb2+（圖3D）。

圖2 Cd2+、Cu2+、Ni2+和Pb2+對ACP、ALP、ATPase活性影響的組織化學檢測。L，消化道腔；LP，固有層；ME，黏膜上皮；SB，紋狀緣；比例尺，50 μmFig. 2 Histochemical examination for the effects of Cd2+, Cu2+, Ni2+ and Pb2+ on the activities of ACP, ALP and ATPase. L, lumen of the digestive tract; LP, lamina propria; ME, mucosal epithelium; SB, striated border; scale bar, 50 μm

圖3 Cd2+、Cu2+、Ni2+和Pb2+對酶活性影響的統(tǒng)計學分析。 A ，POX；B，NSE；C，SDH；D， ACP；E，ALP；F， ATPase。與對照組比較，** P＜0.01Fig. 3 Statistical analysis for the effects of Cd2+, Cu2+, Ni2+ and Pb2+ on the enzyme activities. A, POX; B, NSE; C, SDH; D, ACP; E, ALP; F, ATPase. ** P ＜ 0.01, compared with control group

5 Cu2+和Pb2+抑制ALP活性

ALP的酶組織化學陽性顯色結(jié)果為藍紫色。ALP在十二指腸處活性最高。ALP在消化道中主要分布于粘膜上皮，且在紋狀緣處呈現(xiàn)出較高的活性（圖2中）。Cd2+和Ni2+對ALP的活性在3種濃度下均無顯著抑制作用。Cu2+在0.2 mol/L濃度下對其活性有著較強的抑制效應(yīng)，在0.02 mol/L和0.002 mol/L時也有一定程度的抑制情況。Pb2+在0.2 mol/L時完全抑制其活性，在0.02 mol/L和0.002 mol/L時則無顯著影響（圖3E）。

6 Cd2+、Cu2+、Ni2+和Pb2+均能抑制ATPase活性

ATPase的酶組織化學顯色結(jié)果為棕黑色。ATPase在消化道各段均有較高的活性，在空腸處活性最高。ATPase在消化道中的分布類似于ALP，也是主要分布于黏膜上皮，從基底部往紋狀緣處活性逐漸升高（圖2右）。4種重金屬對ATPase的活性均有抑制作用，Cd2+在0.2 mol/L和0.02 mol/L濃度下對其活性有顯著的抑制作用，隨著濃度下降抑制效應(yīng)有所降低。Cd2+、Cu2+和Pb2+對酶活性的影響類似，在0.2 mol/L時的抑制效應(yīng)強于0.02 mol/L，在0.002 mol/L時則對ATPase活性無顯著影響。Ni2+在3種濃度下對ATPase均有顯著的抑制作用，且抑制程度相同（圖3F）。

討論

POX通常存在于過氧化物酶體中，其可催化過氧化氫分解、氧化酚類和胺類化合物將有害物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無毒物質(zhì)從而保護細胞免受毒害[11]，并在水生生物的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用[12]。Cd2+對家蠶POX活性的影響存在時間劑量效應(yīng)，在短時間低濃度時會促進其活性，而在高濃度長時間情況下則會抑制其活性[13]。Cu2+在濃度小于50 mg/L時對紅樹植物幼苗POX活性有促進作用，而在75 mg/L時表現(xiàn)出一定程度抑制作用[14]。在本實驗中，使用重金屬體外處理POX，在低濃度時Cd2+、Cu2+、Ni2+對POX活性無顯著影響，在高濃度時會顯著抑制其活性，不同濃度的Pb2+對POX活性均無顯著影響。表明Cd2+、Cu2+、Ni2+污染會抑制牛蛙的解毒能力。

NSE存在于包括魚類在內(nèi)的大多數(shù)脊椎動物中，NSE參與脂肪酸甘油酯的消化[15]。NSE在細胞內(nèi)毒素和小分子的加工和抗原提呈中起著至關(guān)重要的作用[16]。郭慧等[17]的研究表明在離體條件下Cd2+和Cu2+在濃度為10-4mol/L 和 10-3mol/L 時均會使羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）血細胞活性和酯酶活性均顯著下降。在濃度為0.1 mg/L Pb2+的脅迫下，櫛孔扇貝（Chlamys farreri）血清和血細胞中的酯酶活性均顯著下降[18]。而本研究中Cd2+和Cu2+在3種濃度下均對酯酶活性無顯著影響，但Pb2+和Ni2+可在高濃度時會抑制NSE的活性，可見重金屬對不同物種的酯酶影響存在一定差異。

SDH是一種氧化還原酶，它參與呼吸鏈中的電子傳遞，以及三羧酸循環(huán)中的琥珀酸分解代謝，其突變會導致多種疾病[19]。SDH在體內(nèi)一些能量代謝較高的部位有較多分布，有關(guān)重金屬對其活性影響的報道較少。單劑量氯化鎘的注射會顯著抑制大鼠睪丸中SDH的活性，并且老齡大鼠中的抑制作用要比年輕大鼠中更明顯[20]。本研究顯示SDH相較其它酶對重金屬更加敏感，Cd2+和Cu2+在2×10-1mol/L到2×10-4mol/L范圍內(nèi)完全抑制其活性，Ni2+和Pb2+在2×10-1mol/L到2×10-4mol/L顯著抑制其活性。表明重金屬污染可能會抑制牛蛙消化道的能量代謝過程而降低其消化吸收機能。SDH對重金屬如此敏感或許可以作為水體中重金屬污染的生物指示物。

ACP廣泛分布于低等和高等生物的所有生命系統(tǒng)中，是一種重要的溶酶體酶，在細胞胞內(nèi)消化中發(fā)揮著重要功能[16]。ALP被認為與脂質(zhì)、葡萄糖、鈣和無機磷酸鹽等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收有關(guān)，常被看作是消化道吸收營養(yǎng)的一種標志酶[21]。因此研究重金屬對ACP、ALP活性的影響有助于了解重金屬對營養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收、運轉(zhuǎn)等的影響。研究表明隨著鎘濃度的升高鯽魚腸道和鰓的ACP、ALP酶活性都顯著下降[22], 鰓ALP活性隨著鉛濃度的升高而顯著減低[23]。在本實驗中，Cd2+和Ni2+在高濃度和低濃度下對ACP和ALP的活性均無顯著影響，Cu2+和Pb2+在0.2 mol/L濃度下顯著抑制ACP和ALP的活性，因此長時間Cu2+和Pb2+的污染可能會降低牛蛙的消化吸收功能。

ATPase是一類將ATP催化水解為ADP和磷酸根離子的水解酶，其普遍存在于細胞膜和細胞器膜上，主要通過水解ATP為物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運提供能量，維持細胞內(nèi)外的離子梯度差，保證各種代謝活動的能量需要[24]。重金屬離子Cd2+和Pb2+在低濃度條件下會對泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）的ATPase活性有誘導作用，而在高濃度條件下產(chǎn)生抑制作用[25]。本實驗中4種重金屬在高濃度均顯著抑制ATPase的活性，進一步表明重金屬的污染會通過抑制牛蛙的能量代謝而降低其消化吸收功能。

總之，本研究采用酶組織化學染色法首次檢測了四種常見重金屬對牛蛙消化道黏膜重要酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)不同重金屬對牛蛙消化道黏膜酶活性存在著不同的抑制作用。其中SDH對重金屬的影響最為敏感，四種重金屬對其活性均有較強程度的抑制作用。同時四種重金屬對ATPase的活性也都存在著不同程度的抑制作用，表明重金屬離子會通過抑制牛蛙能量代謝的過程影響其消化吸收功能。