人臍帶間充質(zhì)干細胞抑制T細胞免疫作用

陽莉，林惠珠，錢師宇，陳曉燕，陳文捷，盧建溪

(1中山大學附屬第三醫(yī)院生物治療中心，廣州 510000；2暨南大學基礎(chǔ)醫(yī)學與公共衛(wèi)生學院，廣州 510632)

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類具有自我更新和多向分化能力的成體干細胞，來源于中胚層，廣泛存在于骨髓、臍帶、胎盤、臍血、牙齦、脂肪等組織。MSCs具有低免疫原性，同時還具有強大的免疫調(diào)節(jié)能力，被應(yīng)用于治療多種疾病，目前對MSCs的研究涉及到抗炎治療、組織修復(fù)和再生、移植物抗宿主病(GVHD)、自身免疫性疾病等免疫異常和炎癥相關(guān)疾病[1,2]。人臍帶間充質(zhì)干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs）因為取材方便、來源豐富、分化潛能大和增殖能力強，有望成為最具臨床應(yīng)用前景的間充質(zhì)干細胞。MSCs的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)是非抗原特異性和非選擇性的，其對同體或是異體來源的各種免疫細胞如T淋巴細胞、B淋巴細胞、樹突狀細胞、自然殺傷細胞等均具有免疫調(diào)節(jié)作用，通過多向分化與旁分泌作用發(fā)揮組織再生與損傷修護作用[3,4]。深入研究間充質(zhì)干細胞免疫調(diào)節(jié)特性及其作用途徑，是其臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)。

材料與方法

1 實驗材料

研究選取我院產(chǎn)科健康供體來源的臍帶約20cm，共采集8條，并簽署知情同意書。

2 主要儀器與試劑

間充質(zhì)干細胞成脂、成骨、成軟骨誘導分化培養(yǎng)試劑盒（廣州Cyagen公司），間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)液（以色列BI公司）， RPMI 1640 培養(yǎng)液、DMEM低糖培養(yǎng)液（美國Gibco公司），人淋巴細胞分離液（挪威Axis-shield公司），Treg細胞檢測試劑盒、白細胞活化試劑盒（美國BD公司），流式抗體CD29-FITC、CD31-FITC、CD34-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD166-PE、HLA-DR-FITC（美國Bechman Coulter公司），流式抗體FITC-CD3、APC-CD8、PEcy7 IFN-γ、APC IL-17A、FITC-CD8和破膜劑（美國BD公司），CD3細胞分選磁珠（德國Miltenyi公司），Cell Trace? CFSE 細胞增殖試劑盒（美國Thermo Scientific公司），CD3單克隆抗體、CD28單克隆抗體、IL-2（美國Perprotech公司）。離心機為 Centrifuge 5810R（德國Eppendorf公司），二氧化碳培養(yǎng)240i（美國Thermo Scientific公司），CytoFLEX流式細胞儀（美國Bechman Coulter公司）。

3 hUC-MSCs的分離培養(yǎng)

分離臍帶華通氏膠，剪碎后接種于D150培養(yǎng)皿，加入無血清間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基，置37 ℃，體積分數(shù)5% CO2，飽和濕度條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至組織塊周圍爬出細胞，換液、傳代培養(yǎng)至第3代，凍存?zhèn)溆谩１敬喂卜蛛x了8株細胞用于實驗。

4 hUC-MSCs表型鑒定

取體外培養(yǎng)到第3～5代的hUC-MSCs消化重懸成1×106cells /mL，分別取100 μL細胞懸液進行CD29-FITC、CD31-FITC、CD34-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD166-PE、HLA-DR-FITC 標記，經(jīng)流式細胞儀鑒定，證明體外傳代培養(yǎng)對hUC-MSCs細胞表型無影響。

5 hUC-MSCs體外定向誘導成骨、成脂和成軟骨分化

取第3～5代的hUC-MSCs 按 2×104cells/cm2的密度接種于24孔板，細胞融合度達到60%～70%時，小心地吸走培養(yǎng)液，沿板壁緩慢加入500 μL成骨誘導分化完全培養(yǎng)基，每隔3 d更換新鮮的成骨誘導分化完全培養(yǎng)基，置37 ℃，體積分數(shù)5% CO2、飽和濕度條件培養(yǎng)箱中，按成骨誘導分化培養(yǎng)試劑盒誘導培養(yǎng)2～4周；成骨誘導分化結(jié)束后，吸走培養(yǎng)液，加入生理鹽水洗3次，加入500 μL的4%多聚甲醛室溫固定30 min。茜素紅染色后，光學顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

同 樣 將 第3～5代 的hUC-MSCs按 照2×104cells/cm2的細胞密度接種在24孔板中，每孔加干細胞培養(yǎng)液500 μL，細胞融合度達到90%時，小心地吸走培養(yǎng)液，沿孔壁緩慢加入500 μL成脂誘導分化培養(yǎng)基，按成脂誘導分化培養(yǎng)試劑盒培養(yǎng)結(jié)束后，吸走培養(yǎng)液，生理鹽水洗3次后，加入500 μL的4%多聚甲醛室溫固定1 h。油紅O染色后，光學顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

取2×105個第3～5代的hUC-MSCs于15 mL透氣離心管中，加入5 mL生理鹽水，300 g，離心5 min，去上清。加入500 μL已添加TGF-β3的成軟骨誘導分化完全培養(yǎng)基，150 r/min，離心5 min，使細胞聚集于離心管底部，直立放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換一次液。連續(xù)培養(yǎng)1月后，吸掉培養(yǎng)液，將軟骨組織加入10%多聚甲醛固定。同時準備人軟骨組織做陽性對照和非軟骨組織做陰性對照，對照組織大小與誘導成軟骨大小相同，同樣10%多聚甲醛固定，切片后阿爾新藍染色，光學顯微鏡下對比觀察切片。

6 外周血T淋巴細胞的制備

用肝素鈉抗凝管采集健康人外周血30 mL，通過密度梯度離心法分離全部單個核細胞。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基懸浮細胞，即獲得人外周血單個核細胞。經(jīng)CD3磁珠分選外周血T淋巴細胞，分選所得的細胞用FITC-CD3標記后流式細胞儀檢測其純度。

7 hUC-MSCs對T淋巴細胞增殖影響檢測

外周血T淋巴細胞標記：取1×106cells/mL分選好的外周血T淋巴細胞，加入CFSE（工作濃度為5 μmo l/L，按1 μL/mL添加），37 ℃避光孵育30 min；加入5倍體積預(yù)冷的含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，冰浴5 min，終止染色；用生理鹽水洗滌3次后重懸，并調(diào)整細胞濃度至1×106cells/mL。

hUC-MSCs與T淋巴細胞共培養(yǎng)：將MSCs與上述標記的T淋巴細胞按5:1的比例共培養(yǎng)，即CD3+T細胞5×105cells/well，hUC-MSCs 1×105cells/well，培養(yǎng)體系總體積為500 μL，加入1 μg/mL CD3單克隆抗體和500 ng/mL CD28單克隆抗體，加入IL-2至終濃度500 IU/mL，同時設(shè)T淋巴細胞單獨培養(yǎng)孔。取106個已分選但未加CD3/CD28單克隆抗體活化的淋巴細胞于另一孔為流式檢測時的空白對照。

細胞增殖流式細胞術(shù)檢測：共培養(yǎng)3 d后，收集對照孔、單獨培養(yǎng)孔和共培養(yǎng)孔的細胞，加入生理鹽水，300 r/min，離心5 min，去掉上清，加入250 μL生理鹽水重懸，上機檢測。CFSE進入活細胞后與胞內(nèi)蛋白結(jié)合釋放綠色熒光，隨著細胞分裂而平均分配至子代細胞，而導致熒光強度遞減，依據(jù)這一特性，可用流式細胞儀FITC通道檢測淋巴細胞增殖的情況[5]。

8 hUC-MSCs調(diào)節(jié)T淋巴細胞亞群檢測

將MSCs與步驟5制備的外周血T淋巴細胞按5:1的比例共培養(yǎng)，即CD3+T細胞5×105cells/well和hUC-MSC 1×105cells/well，培養(yǎng)體系總體積為500 μL，加入1 μg/mL CD3單克隆抗體和500 ng/mL CD28單克隆抗體，加入IL-2至終濃度500 IU/mL，同時設(shè)T淋巴細胞單獨培養(yǎng)孔。取106個已分選但未加CD3/CD28單克隆抗體活化的淋巴細胞于另一孔作為流式檢測時的空白對照。共培養(yǎng)3 d后，按白細胞活化試劑盒說明刺激細胞6h，收集處理好的細胞用APC-CD8和FITC-CD8標記，破膜后，分別進行PE-cy7 IFN-γ和APC IF-17A染色，流式細胞儀檢測Th1（CD8-IFN-γ+）細胞亞群和Th17（CD8-IL-17+)細胞亞群的比例；按Treg細胞檢測試劑盒標記細胞，流式細胞儀檢測Treg細胞（CD4+CD25+FoxP3+）的比例。

9 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 6軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，單獨培養(yǎng)組與共培養(yǎng)組之間的比較采用配對樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1 hUC-MSCs的鑒定及體外誘導分化成骨、成脂、成軟骨

人臍帶在體外成功分離培養(yǎng)出MSCs，鏡下可見細胞形態(tài)均一，折光性強，長梭形，呈旋渦狀貼壁生長（圖1A）。hUC-MSCs在體外具有誘導分化成骨、成脂、成軟骨的功能。成脂誘導21 d后可見大而圓的脂滴，油紅O染色后，脂滴紅染（圖1B）；成骨誘導21 d后出現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié)，經(jīng)茜素紅染色后呈紅色（圖1C）；成軟骨誘導21 d后切片觀察，可見經(jīng)阿爾新藍染料染成藍色的軟骨細胞（圖1D）。

圖1 hUC-MSCs體外誘導分化檢測。A，P3代hUC-MSCs形態(tài)；B，油紅染色；C，茜素紅染色；D，阿爾新藍染色Fig.1 Examination of in vitro induced-differentiation of hUC-MSCs. A, morphology of P3 hUC-MSCs; B, Oil Red staining; C, Alizarin Red staining; D, Alcian Blue staining

流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，hUC-MSCs高表達間充質(zhì)干細胞標志物CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166（＞95%），低或不表達造血干細胞表面抗原 CD34、CD45 及其他抗原分子如CD31、HLA - DR（＜2%）(圖2)。這些結(jié)果表明，本實驗室制備的hUC-MSCs純度高，符合國際細胞治療協(xié)會ISCT間充質(zhì)干細胞標準[6]。

圖2 hUC-MSCs表型代表性流式細胞術(shù)分析結(jié)果。CD90、CD73、CD29、CD44、CD166、CD105表達率大于95%，CD34、CD45、HLADR、CD31表達率小于2%，符合MSCs的鑒定標準Fig.2 Representative flow cytometric analysis results of phenotypes of hUC-MSCs. The expression rates of CD90, CD73, CD29, CD44, CD166, CD105 were more than 95% while the expression rates of CD34, CD45, HLA-DR, CD31 were less than 2%. This accorded with the identification standard of surface markers of MSCs

2 hUC-MSCs抑制T淋巴細胞的增殖

外周血單個核細胞用CD3磁珠分選所得的細胞用流式細胞儀檢測其純度＞95%（圖3A）。將CFSE標記的T淋巴細胞與人臍帶間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)3 d后進行流式細胞術(shù)檢測T細胞增殖（圖3B中P4門）顯示，共培養(yǎng)組中T細胞增殖的比例為（2.90±1.61）%，顯著低于單獨培養(yǎng)組中T細胞增殖的比例（29.04±1.47）%（圖3C），由此提示，hUC-MSCs明顯抑制T淋巴細胞的增殖。

圖3 hUC-MSCs對T淋巴細胞增殖的影響。A，T淋巴細胞純度的代表性流式細胞術(shù)檢測結(jié)果。B，hUC-MSCs對T淋巴細胞增殖影響的代表性流式細胞術(shù)檢測結(jié)果；C，與hUC-MSCs對T淋巴細胞增殖影響的統(tǒng)計學分析（n=8）Fig. 3 Effect of hUC -MSCs on proliferation of T lymphocyte. A, representative flow cytometric analysis result of the purity of T lymphocyte. B, representative flow cytometric analysis results of the effect of hUC -MSCs on proliferation of T lymphocyte; C, statistical analysis of the effect of hUC -MSCs on proliferation of T lymphocyte (n=8)

3 hUC-MSCs抑制Th1/Th17淋巴細胞亞群分化

4 hUC-MSCs促進Treg細胞的生成

Th1和Th17淋巴細胞亞群是具有免疫促進作用的輔助性T細胞。流式細胞術(shù)檢測Th1細胞亞群（圖4中十字門右下象限）和Th17細胞亞群（圖4中P4門）的比例顯示，共培養(yǎng)組Th1和Th17亞群的比例分別為（0.95±0.44）%和（0.24±0.20）%，明顯低于單獨培養(yǎng)組Th1和Th17亞群的比例（3.33±0.46）%和（1.23±0.19）%（圖4），由此表明hUC-MSCs抑制Th1和Th17細胞亞群的分化。

圖4 hUC-MSCs對Th1和Th17淋巴細胞亞群分化的影響。A，hUC-MSCs對Th1和Th17淋巴細胞亞群分化影響的代表性流式細胞術(shù)檢測結(jié)果；B，hUC-MSCs對Th1和Th17淋巴細胞亞群分化影響的統(tǒng)計學分析（n=8）Fig. 4 Effect of hUC-MSCs on the differentiation of Th1 and Th17 subsets of T cells. A, representative flow cytometric analysis results for effect of hUCMSCs on the differentiation of Th1 and Th17 subsets of T cells; B, statistical analysis for the effect of hUC-MSCs on the differentiation of Th1 and Th17 subsets of T cells (n=8)

Treg細胞是具有免疫抑制功能的調(diào)節(jié)性T細胞。流式細胞分析以CD4+細胞進行設(shè)門，分析該群細胞中CD25+FoxP3+細胞比例（圖5中十字門右上象限）顯示：共培養(yǎng)組CD25+FoxP3+細胞比例為（3.00±1.32）%，顯著高于單獨培養(yǎng)組CD25+FoxP3+細胞比例（0.76±0.22）%（圖5），由此表明hUCMSCs能誘導Treg細胞的生成。

圖5 hUC-MSCs對Treg 細胞生成的影響。A，hUC-MSCs對Treg 細胞生成影響的代表性流式細胞術(shù)檢測結(jié)果；B，hUC-MSCs對Treg 細胞生成影響的統(tǒng)計學分析（n=8）Fig. 5 Effect of hUC-MSCs on the formation of Treg cells. A, representative flow cytometric analysis results for effect of hUC-MSCs on the formation of Treg cells; B, statistical analysis for effect of hUC-MSCs on the formation of Treg cells (n=8)

討論

MSCs對先天性免疫和獲得性免疫均具有免疫調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)MSCs不僅增強Treg細胞的免疫調(diào)節(jié)能力，還能抑制DC成熟或促進已成熟DC向未成熟DC方向轉(zhuǎn)化[7,8]，以此來降低機體免疫反應(yīng)，同時MSCs能誘導單核細胞分化為M2型免疫抑制性巨噬細胞，使巨噬細胞分泌IL-10增加，分泌的IL-10進一步抑制T淋巴細胞的增殖，從而達到抗炎癥反應(yīng)的作用[9-11]。總結(jié)現(xiàn)有研究成果，MSCs能通過抑制DC成熟、抑制T細胞活化增殖、誘導M2型巨噬細胞、誘導Treg細胞增殖、維持促炎因子/抑炎因子平衡等多種機制發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。

應(yīng)用流式細胞術(shù)分析Th1/Th17細胞亞群，一般采用CD4設(shè)門，通過檢測CD4+細胞群中IFN-γ和IL-17的表達來確定Th1和Th17細胞的比例?？墒窃诎准毎罨瘎┑拇碳は?，CD4的表達會迅速下調(diào)甚至喪失，使測量值偏低，因此采用CD8反向設(shè)門[12]。因為CD8不受白細胞刺激劑的影響，且絕大多數(shù) CD3+CD8-的細胞都是CD3+CD4+的細胞，可通過 CD3+細胞群中的CD8-IFN-γ+細胞和CD8-IL-17+細胞來分析Th1/Th17細胞亞群的比例。

體內(nèi)環(huán)境中炎癥因子的水平和類型以及機體的免疫狀態(tài)均能影響MSCs的調(diào)節(jié)作用。早期認為MSCs是免疫細胞的抑制劑，但目前的研究顯示MSCs具有促進炎癥反應(yīng)和抑制炎癥反應(yīng)兩方面的能力，這種免疫調(diào)節(jié)的可塑性由免疫微環(huán)境決定，微環(huán)境的炎癥因子水平?jīng)Q定了MSCs的免疫調(diào)節(jié)方向[13]。有關(guān)間充質(zhì)干細胞的免疫調(diào)節(jié)作用途徑與機制至今尚未完全闡明，現(xiàn)在大多數(shù)研究更傾向于間充質(zhì)干細胞分泌的細胞因子對免疫細胞激活、增殖和分化的調(diào)節(jié)作用。因此，需要使用標準化的免疫實驗進一步研究不同免疫狀態(tài)下不同來源MSCs的免疫調(diào)節(jié)趨勢，針對不同的疾病階段進行個體化、差異化治療，這將有助于MSCs的臨床應(yīng)用[14-16]。