柚皮素通過增強(qiáng)NRF-2/HO-1信號活性減輕實(shí)驗(yàn)性妊娠高血壓模型大鼠的腎損傷

劉雨，湯容，王曉霜

（1重慶市中醫(yī)院產(chǎn)科，重慶 400021；2電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦女兒童醫(yī)院/成都市婦女兒童中心醫(yī)院產(chǎn)科，成都 610073）

妊娠高血壓綜合征（pregnancy-induced hypertension syndrome，PIH）是產(chǎn)科常見病，約占所有孕產(chǎn)婦的7.9%[1]。在妊娠期發(fā)生的高血壓（49.2%）和產(chǎn)后出血（13.8%）是導(dǎo)致妊娠相關(guān)腎損傷的主要因素，且由PIH誘發(fā)的孕產(chǎn)婦腎損傷也是加劇妊娠不良結(jié)局甚至導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)期嬰兒死亡的促進(jìn)因素之一[2,3]。而PIH誘發(fā)的腎損傷的原因復(fù)雜，機(jī)制并不清楚，尚缺乏特異性治療這種疾病的藥物。因此，對PIH相關(guān)腎損傷藥物的研發(fā)顯得尤為重要。

柚皮素（naringenin, Nar）是一種具有抗炎和抗氧化作用的黃酮類化合物[4]。研究表明，在糖尿病腎病和單側(cè)輸尿管梗阻大鼠模型中，Nar具有腎保護(hù)作用[5,6]。另外，Nar可減輕炎癥性疼痛和神經(jīng)性疼痛[7]。這些研究表明，Nar具有抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛和腎保護(hù)作用。然而，Nar在PIH中是否具有腎臟保護(hù)作用及其機(jī)制尚不清楚。因此，本研究重點(diǎn)觀察Nar在PIH大鼠模型對腎臟的影響及其機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動物

10～11周齡清潔級Wistar大鼠（40只雌性，20只雄性）購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。將大鼠飼養(yǎng)在溫度（23±2）°C和濕度（55±5）%可控的清潔級動物房中飼養(yǎng)，大鼠可自由進(jìn)食和飲水。

2 主要試劑

N-硝基-L-精氨酸甲酯（NG-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME）和Nar（純 度＞98%，北京百靈威科技有限公司）；大鼠尿白蛋白和肌酐ELISA試劑盒（北京冬歌生物科技有限公司）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；HE、PAS和Masson染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；TUNEL檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；兔源抗體：剪切的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Cleaved cysteine aspartate protease-3，Cleaved Caspase-3）、血紅素氧合酶1（heme oxygenase 1，HO-1）、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）和核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，NRF-2）（萬類生物科技有限公司）；SP試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

3 動物模型構(gòu)建與分組處理

用陰道涂片檢測雌性大鼠的動情周期，并將發(fā)情期雌性大鼠與雄性大鼠按2:1合籠交配，選32只交配成功（存在陰道塞且陰道涂片鏡檢有精子，并計(jì)為妊娠第0 d）的雌性大鼠隨機(jī)分為空白對照組、Nar對照組、PIH組和PIH+Nar組，每組8只大鼠。按照文獻(xiàn)[8]描述的方法，從妊娠的第8 d開始每天腹腔注射50 mg/kg L-NAME至妊娠第20 d，以誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性妊娠性高血壓模型以模擬PIH。PIH組和PIH+Nar組按照上述方法構(gòu)建PIH，且Nar對照組和PIH+Nar組大鼠在妊娠第8—20 d每天口服200 mg/kg Nar，而空白對照組和PIH組在同時(shí)間點(diǎn)口服等體積安慰劑。

4 血壓監(jiān)測

在妊娠第1、8、12、14、16、18和20 d，使用大鼠尾動脈血壓測量儀測量大鼠的收縮壓（systolic blood pressure，SBP）。

5 尿白蛋白排泄率的測定

在妊娠第20 d，用代謝籠收集大鼠的24 h尿液，然后用ELISA試劑盒檢測尿液中白蛋白的含量，根據(jù)公式計(jì)算尿白蛋白排泄率：尿白蛋白排泄率=白蛋白含量（mg/mL）×尿液體積（mL）/24 h。

6 肌酐清除率的測定

在妊娠第20 d，收集尾靜脈血，并分離血清。用ELISA試劑盒分別檢測尿液和血清中肌酐的含量，然后根據(jù)公式計(jì)算肌酐清除率：肌酐清除率= [尿肌酐含量（μmol/L）× 24 h尿液體積（mL）]/{血清肌酐含量（μmol/L）× [1000/體重（g）] ×（1/1440）}。

7 腎組織病理學(xué)分析

在妊娠第21 d，麻醉、處死大鼠，收集腎組織并行石蠟包埋，5 μm厚度切片，經(jīng)脫蠟、復(fù)水后分別行HE、PAS和Masson染色，并在光學(xué)顯微鏡下對腎臟組織學(xué)評分、腎小球硬化指數(shù)和腎小管間質(zhì)纖維化水平進(jìn)行分析。每個HE染色切片隨機(jī)選4個視野，按照文獻(xiàn)[9]方法進(jìn)行腎臟組織學(xué)評分。每個PAS染色切片隨機(jī)選10個腎小球進(jìn)行評分分析，視野中出現(xiàn)伴隨透明物質(zhì)和/或基質(zhì)增加的腎小球毛細(xì)血管簇的塌陷和/或閉塞則認(rèn)定為腎小球硬化；腎小球硬化的嚴(yán)重程度從0到3分級：0，無病變；1，輕度；2，中度； 3，嚴(yán)重。腎小管間質(zhì)纖維化由半定量法評價(jià)，每個Masson染色腎切片隨機(jī)選4個視野，檢查評估區(qū)域內(nèi)的纖維化（藍(lán)色染色），等級分為：0，無纖維化；1，輕度；2，中度；3，嚴(yán)重。

8 腎組織TUNEL染色

取腎切片經(jīng)脫蠟至水后，浸泡于pH6.0的檸檬酸緩沖液中，微波中高火5 min，再自然晾涼。蛋白酶 K工作液37 ℃反應(yīng)30 min，3% H2O2孵育10 min，PBS漂洗切片2次，生物素標(biāo)記的TdT酶反應(yīng)液37 ℃反應(yīng)30 min，浸入PBS漂洗3次后以辣根過氧化物酶-鏈霉親和素工作液37 ℃反應(yīng)30 min，PBS漂洗3次，DAB工作液室溫顯色2 min，蘇木素復(fù)染20 s，顯微鏡下觀察并拍照，用Image J軟件計(jì)數(shù)每個視野下的TUNEL陽性細(xì)胞。

9 腎組織免疫組織化學(xué)染色

取腎切片脫蠟至水、抗原修復(fù)和阻斷內(nèi)源性過氧化物酶（步驟同TUNEL染色）后，用10%正常山羊血清室溫封閉20 min，1:200的Cleaved Caspase-3、HO-1、Bcl-2、Bax和NRF-2一抗37 ℃孵育60 min，PBS漂洗3次，1:100稀釋的生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG聚合物室溫孵育15 min，PBS漂洗3次，1:100稀釋的辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液室溫孵育15 min，PBS漂洗3次，DAB顯色液室溫孵育5 min，蘇木素復(fù)染20s ，顯微鏡下觀察并拍照。用Image J軟件對每個視野下的Cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)以及測量HO-1和NRF-2積分光密度（integrated optical density，IOD）值。

10 腎組織氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

每只大鼠分別取0.1 g腎組織勻漿后按照試劑盒說明書分別檢測勻漿液中MDA、CAT和GSH含量，最后將勻漿液中上述指標(biāo)的含量按照腎組織質(zhì)量轉(zhuǎn)化為單位（g）組織中MDA、CAT和GSH的含量。

11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量資料均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組之間的差異。析因設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)資料采用析因設(shè)計(jì)方差分析，重復(fù)測量數(shù)據(jù)資料采用重復(fù)測量方差分析。P＜0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 柚皮素對PIH大鼠收縮壓無影響

在妊娠第1和第8 d，各組大鼠的SBP無明顯差異；在第12—20 d，空白對照組與Nar對照組大鼠的SBP無明顯差異；與空白對照組比較，PIH組大鼠的SBP明顯升高；與PIH組比較，PIH+Nar組大鼠的SBP無明顯差異（圖1）。

圖1 柚皮素對PIH大鼠收縮壓的影響。與對照組比較，*P＜0.05; n=8Fig. 1 The effect of naringenin on the systolic blood pressure of the PIH rats. *P＜0.05, compared with control group; n=8

2 柚皮素抑制PIH大鼠尿白蛋白排泄率的增加和肌酐清除率的降低

空白對照組和Nar對照組大鼠的尿白蛋白排泄率和肌酐清除率均無明顯差異；與空白對照組比較，PIH組大鼠的尿白蛋白排泄率明顯增加，肌酐清除率明顯降低；與PIH組比較，PIH+Nar組大鼠的尿白蛋白排泄率明顯降低，肌酐清除率明顯增加；與空白對照組和Nar對照比較，PIH+Nar組大鼠的尿白蛋白排泄率仍較高，但肌酐清除率與此倆組相比無明顯差異（圖2）。

圖2 柚皮素對PIH大鼠尿白蛋白排泄率（A）和肌酐清除率（B）的影響。與對照組比較，*P＜0.05；與PIH組比較，#P＜0.05；n=8Fig. 2 The effect of naringenin on the urinary albumin excretion rate (A) and creatinine clearance (B) of the PIH rats. *P＜0.05, compared with control group; #P＜0.05, compared with PIH group; n=8

3 柚皮素減輕PIH大鼠腎病理學(xué)變化

HE染色顯示：空白對照組和Nar對照組腎小管正常；PIH組可見部分腎小管管腔擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞變性，腎間質(zhì)可見少量炎性細(xì)胞侵潤；PIH+Nar組腎小管形態(tài)改變減輕（圖3A上）。PAS染色顯示：空白對照組和Nar對照組腎小球結(jié)構(gòu)清晰，PIH組腎小球水腫、糖原沉積和存在節(jié)段性腎小球硬化，PIH+Nar組腎小球病理學(xué)改變則明顯減輕（圖3A中）。Masson染色顯示：空白對照組和Nar對照組腎小管結(jié)構(gòu)清晰，PIH大鼠腎小管間質(zhì)存在明顯的膠原纖維沉積，PIH+Nar組腎小管間質(zhì)的膠原纖維沉積則明顯減輕（圖3A下）。定量分析顯示（圖3C—D）：空白對照組腎組織評分、腎小球硬化指數(shù)和腎間質(zhì)纖維化指數(shù)與Nar對照組無明顯差異；PIH組腎組織評分、腎小球硬化指數(shù)和腎間質(zhì)纖維化指數(shù)高于空白對照組；PIH+Nar組腎組織評分、腎小球硬化指數(shù)和腎間質(zhì)纖維化指數(shù)均較與PIH組比較明顯降低，但仍高于空白對照組和Nar對照組。

圖3 柚皮素對PIH大鼠腎組織病理學(xué)變化的影響。A，腎組織病理學(xué)的HE（上）、PAS（中）和Masson（下）染色檢測；B，組織學(xué)評分；C，腎小球硬化定量分析D，腎間質(zhì)纖維化定量分析；與對照組比較，*P＜0.05；與PIH組比較，#P＜0.05；n=8Fig. 3 Effect of Naringenin on the pathological changes of renal tissues of the PIH rats. A, detection for the pathological changes of the renal tissue of the PIH rats by HE (upper), PAS (middle) and Masson (lower) staining; B, histological scoring; C, quantitative analysis of glomerulosclerosis; D, quantitative analysis of renal interstitial fibrosis; *P＜0.05, compared with control group; #P＜0.05, compared with PIH group; n=8

4 柚皮素減輕PIH大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡

TUNEL染色結(jié)果（圖4A、B）顯示：空白對照組TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)與Nar對照組無明顯差異；與空白對照組比較，PIH組TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，且主要定位于腎小管上皮細(xì)胞；PIH+Nar組TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)較與PIH組明顯減少，但仍高于空白對照組和Nar對照組。免疫組織化學(xué)染色表明：與空白對照組比較，PIH組Cleaved caspase-3和Bax染色陽性細(xì)胞數(shù)均明顯增多，Bcl-2染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，且均主要定位于腎小管上皮細(xì)胞；與PIH組比較，PIH+Nar組Cleaved caspase-3和Bax染色陽性細(xì)胞數(shù)均明顯減少，Bcl-2染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多；PIH+Nar組Cleaved caspase-3和Bax染色陽性細(xì)胞數(shù)仍高于空白對照組和Nar對照組，而Bcl-2染色陽性細(xì)胞數(shù)仍低于空白對照組和Nar對照組。上述結(jié)果說明，PIH能誘導(dǎo)腎臟中腎小管上皮細(xì)胞凋亡，而Nar治療則能抑制PIH誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡。

圖4 柚皮素對PIH大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響。A，代表性的TUNEL染色與Caspase-3、Bcl-2和Bax免疫組織化學(xué)染色圖像（比例尺，100 μm）；B—E，TUNEL（B）以及Cleaved caspase-3（C）、Bcl-2（D）和Bax（E）陽性染色細(xì)胞的定量統(tǒng)計(jì)分析。與對照組比較，*P＜0.05；與PIH組比較，#P＜0.05；n=8Fig. 4 The effect of naringenin on apoptosis of renal tubular epithelial cells in the PIH rats. A, representative images of TUNEL staining, and immunohistochemical staining of Cleaved Caspase-3, Bcl-2 and Bax (scale bar, 100 μm); B to E, quantitative analysis of TUNEL-positive (B), Caspase-3-positive (C), Bcl-2-positive (D) and Bax-positive cells (E). *P＜0.05 compared with control group; #P＜0.05 compared with PIH group; n=8

5 柚皮素降低PIH大鼠腎內(nèi)氧化應(yīng)激水平

空白對照組和Nar對照組的MDA、CAT和GSH含量均無明顯差異；與空白對照組比較，PIH組MDA含量明顯升高，CAT和GSH含量明顯降低；與PIH組比較，PIH+Nar組MDA明顯降低，CAT和GSH含量明顯增加；PIH+Nar組MDA含量仍高于空白對照組和Nar對照組，而CAT和GSH含量與空白對照組和Nar對照組均無明顯差異（圖5）。

圖5 柚皮素對PIH大鼠腎組織內(nèi)氧化應(yīng)激的影響。A，MDA 水平的定量統(tǒng)計(jì)分析；B，CAT水平的定量統(tǒng)計(jì)分析；C，GSH水平的定量統(tǒng)計(jì)分析；與對照組比較，*P＜0.05；與PIH組比較，#P＜0.05；n=8Fig. 5 Effect of naringenin on oxidative stress in the PIH rat renal tissues. A, quantitative analysis of MDA contents; B, quantitative analysis of CAT; quantitative analysis of GSH; *P＜0.05 compared with control group; #P＜0.05 compared with PIH group; n=8

6 柚皮素對PIH大鼠腎組織中NRF-2/HO-1信號活性的影響

免疫組織化學(xué)染色顯示：空白對照組和Nar對照組腎組織中NRF-2和HO-1免疫反應(yīng)性均無明顯差異；與空白對照組比較，PIH組腎組織中NRF-2和HO-1免疫反應(yīng)性均明顯升高；與PIH組比較，PIH+Nar組腎組織中NRF-2和HO-1免疫反應(yīng)性均進(jìn)一步增強(qiáng)，提示Nar治療能增強(qiáng)PIH大鼠腎組織中NRF-2/HO-1信號活性。

討論

PIH能累及多種器官，其中腎臟是最先累及且易受損的靶器官之一[10]。一旦發(fā)生腎損傷，則會直接導(dǎo)致體液和代謝失調(diào)，進(jìn)而加重PIH和腎損傷的病情程度，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)腎衰竭[11,12]。因此，加強(qiáng)對PIH患者的腎保護(hù)意識具有重大的積極意義。本研究顯示，Nar雖不能降低PIH大鼠的收縮壓，但能降低尿白蛋白排泄和提高肌酐清除率并改善腎病理學(xué)改變，提示Nar在PIH中具有腎保護(hù)作用。

PIH能導(dǎo)致腎臟發(fā)生氧化應(yīng)激和炎癥，繼而損害腎實(shí)質(zhì)[13]。本研究顯示，Nar則能抑制PIH大鼠腎組織腎小管上皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步證實(shí)了Nar在PIH中的腎保護(hù)作用。腎臟易受氧化應(yīng)激的影響，這也被認(rèn)為是不同高血壓動物模型中腎損傷進(jìn)展的促動因素[14]。因此，為了確定Nar對PIH大鼠腎臟氧化應(yīng)激的影響，我們評估了氧化應(yīng)激的標(biāo)志物MDA、CAT和GSH。MDA是評估脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)氧化或氧化裂解并反映組織過氧化損傷程度的重要標(biāo)志物，CAT和GSH是主要的抗氧化酶[15]。本研究顯示，在Nar治療的PIH大鼠腎組織中檢測到MDA含量回跌以及CAT和GSH含量回升，提示Nar在PIH大鼠的腎損傷中發(fā)揮抗氧化劑作用。

本研究對Nar在PIH大鼠腎臟中的抗氧化應(yīng)激的作用機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步探索。NRF-2/HO-1信號是機(jī)體主要的維持氧化/還原平衡的系統(tǒng)之一。已有研究[16,17]表明，當(dāng)腎臟受到外界氧化損傷刺激時(shí)，腎臟中NRF-2會發(fā)生活化，進(jìn)而通過上調(diào)HO-1和醌氧化還原酶1的表達(dá)來調(diào)節(jié)下游的抗氧化酶（如CAT和GSH等）的表達(dá)；且進(jìn)一步通過增強(qiáng)NRF-2/HO-1活性則能通過上調(diào)抗氧化酶表達(dá)來增強(qiáng)氧自由基的清除來減輕腎組織的氧化損傷。本研究顯示，在Nar治療的PIH大鼠腎組織中檢測到NRF-2和HO-1表達(dá)大幅度增加，表明Nar能增強(qiáng)PIH大鼠腎組織中NRF-2/HO-1的活性。而NRF-2/HO-1信號在Nar對PIH大鼠腎保護(hù)作用中發(fā)揮的作用程度以及是否還有其他信號參與，目前并不清楚，仍有待進(jìn)一步研究。

總之，本研究的發(fā)現(xiàn)表明，Nar可改善PIH大鼠的蛋白尿和腎損傷，其潛在機(jī)制至少部分是通過緩解氧化應(yīng)激來實(shí)現(xiàn)的。另外，Nar的毒副作用小，提示其在將來的PIH治療中可能具有一定的應(yīng)用潛力。

圖6 柚皮素對PIH大鼠腎組織中NRF-2/HO-1信號活性的影響的免疫組織化學(xué)檢測。A，代表性的NRF-2和HO-1免疫組織化學(xué)染色圖像（比例尺，100 μm）；B和C，NRF-2（B）和HO-1（C）免疫反應(yīng)性的定量統(tǒng)計(jì)分析。與對照組比較，*P＜0.05；與PIH組比較，#P＜0.05；n=8Fig. 6 Immunohistochemical examination for the effect of naringenin on NRF-2/HO-1 signal activity in renal tissues of PIH rats. A, representative images of NRF-2 and HO-1 immunohistochemical staining (scale bar, 100 μm); B and C, quantitative analysis of the immunoreactivities of NRF-2 (B) and HO-1 (C); *P＜0.05 compared with control group; #P＜0.05 compared with PIH group; n=8