不同代次人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性評估

林惠珠，李翠平，錢師宇，陽莉，陳曉燕，陳文捷，盧建溪

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院生物治療中心，2暨南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣州 510000)

干細(xì)胞研究是近年來生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱門方向之一, 其研究成果為許多疾病的治療提供了高效的方法。其中，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs）是在臨床研究中主要采用的干細(xì)胞類型，具有自我更新復(fù)制、多向分化潛能、免疫調(diào)節(jié)功能和抗炎作用，無倫理問題、取材容易、細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增效率高，已經(jīng)成為臨床治療的種子細(xì)胞來源之一[1]。

由于從臍帶組織分離獲得的原代MSCs數(shù)量有限，必需經(jīng)過體外培養(yǎng)增殖才能滿足臨床治療的需求，而當(dāng)干細(xì)胞在體外經(jīng)過一定次數(shù)的細(xì)胞分裂后，會出現(xiàn)生長停滯的復(fù)制性衰老，細(xì)胞老化激活炎癥因子及趨化因子，這些因子通過干細(xì)胞的自分泌和旁分泌效應(yīng)惡化細(xì)胞生存的微環(huán)境，不僅導(dǎo)致干細(xì)胞的數(shù)量及質(zhì)量下降，而且降低干細(xì)胞的再生和修復(fù)能力[2]。細(xì)胞衰老后分泌的一系列相關(guān)炎癥細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子和蛋白酶統(tǒng)稱為衰老相關(guān)分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）。衰老細(xì)胞分泌的常見SASP因子有IL-6、IL-1β、IL-13、TNF-α、G-CSF和GM-CSF[3]。SASP 因子可通過細(xì)胞自分泌加快衰老進(jìn)程，也可通過細(xì)胞旁分泌促進(jìn)衰老。HUC-MSCs在體外長期傳代擴(kuò)增后，其細(xì)胞表型、分化特性、基因組穩(wěn)定性及其SASP表達(dá)水平的變化等問題，決定了其臨床上的應(yīng)用價值及前景。目前，大多數(shù)臨床研究選擇 P3至P5的MSCs[4]進(jìn)行輸注，且建議HUC-MSCs體外培養(yǎng)的代數(shù)最好不超過第10代[5]。

因此，本研究選取第3、5、10代次HUC-MSCs,系統(tǒng)地比較這3個代次的細(xì)胞生物學(xué)特性，旨在明確傳代擴(kuò)增代次對HUC-MSCs基本生物學(xué)特性的影響。

材料與方法

1 材料

1.1 臍帶組織

新鮮臍帶采集于我院產(chǎn)科37～40周健康剖腹產(chǎn)新生兒，所有產(chǎn)婦均自愿捐贈并簽署知情同意書。產(chǎn)婦入選標(biāo)準(zhǔn)：無家族遺傳病史，無傳染病史且HBV、HCV、HIV、CMV、EB病毒、梅毒檢測均為陰性。

1.2 試劑與儀器

間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基（北京友康）、干細(xì)胞溫和消化酶（北京友康）；間充質(zhì)干細(xì)胞成脂、成骨誘導(dǎo)分化試劑（BI）；β-半乳糖苷酶染色試劑盒（碧云天）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天）、蛋白芯片HCYTOMAG-60K-13（Merck Millipore）；RNA提取試劑盒（TaKaRa）、PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）、TB Green Premix Ex TaqTMII（TaKaRa）；抗CD105-PE、CD73-PE、CD90-FITC、CD34-FITC、CD45-FITC、CD11b-FITC、CD19-FITC、HLA-DR-FITC抗體（貝克曼）。倒置顯微鏡（Leica DMil）、CO2培養(yǎng)箱（Thermo）、熱循環(huán)儀（TaKaRa）、GSL120 全自動掃片機(jī)（Leica）、多功能微孔板檢測儀、Luminex200、96實(shí)時熒光定量PCR儀，CytoFLEX流式細(xì)胞分析儀（美國Bechman Coulter）。

2 方法

2.1 HUC-MSCs的分離與培養(yǎng)

華通氏膠提?。合磧裟殠?，剔除血管和臍帶表皮，將獲得的華通氏膠剪至2～3mm3組織塊貼于培養(yǎng)皿中，加入間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，直至細(xì)胞爬出。

hUC-MSC的收集：將收集的原代細(xì)胞，以8000細(xì)胞/cm2的密度接種于間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到融合度80%～90%時，吸出培養(yǎng)基，生理鹽水洗滌1次，加入溫和消化酶消化收集細(xì)胞，反復(fù)傳代培養(yǎng)。收集P3、P5、P10代次hUC-MSCs建庫，液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 HUC-MSCs的細(xì)胞表型鑒定

收集細(xì)胞融合度為80%～90%的P3、P5、P10代次HUC-MSCs，生理鹽水洗滌后，將細(xì)胞濃度調(diào)成2×106細(xì)胞/mL，按100 μL/管（2×105細(xì)胞）分裝， 分別加入5 μL不同熒光素標(biāo)記的 CD73、CD105、 CD90、CD11b、CD19、CD34、CD45 及HLA-DR單克隆抗體，輕微震蕩混勻，室溫避光孵育15 min；生理鹽水洗滌2遍，加300 μL生理鹽水重懸細(xì)胞， 用CytoFLEX流式細(xì)胞儀檢測以上HUC-MSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)。

2.3 hUC-MSCs的增殖活性

將hUC-MSCs以8000細(xì)胞/cm2的密度接種于6孔板中，連續(xù)培養(yǎng)6 d。每天收集3孔HUC-MSCs計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞增殖曲線。

2.4 hUC-MSCs的核型分析

將HUC-MSCs以8000細(xì)胞/cm2的密度接種于無血清培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至48～72 h，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到60%～70%，加入秋水仙堿繼續(xù)培養(yǎng)2～3 h，收集細(xì)胞，2200 g離心10 min, 棄上清， 加入8 mL 37 ℃預(yù)熱的低滲KCl，反復(fù)混勻細(xì)胞，37 ℃水浴30 min，加入2 mL固定液，室溫固定5 min，2200 g離心10 min, 棄上清，加入固定液重懸細(xì)胞，37℃水浴30 min，2200 g離心10 min，棄上清；根據(jù)沉淀細(xì)胞的量加入相應(yīng)的固定液，制備細(xì)胞滴片；置于80 ℃烤箱2 h；將烤制的細(xì)胞滴片置于37 ℃水浴預(yù)熱的0.25%胰酶中消化20～50 s，再置于Giemsa染色1～2 min，自來水沖洗，置烤箱烘干備用；顯微鏡下觀察并進(jìn)行染色體核型分析[6]。

2.5 hUC-MSCs的成脂與成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化及相關(guān)基因檢測

收集hUC-MSCs，以8000細(xì)胞/cm2的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞生長至融合度80%～90%時，分別更換成脂或成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，以未加誘導(dǎo)液常規(guī)培養(yǎng)的HUC-MSCs為對照組，每2～4 d換液一次，成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)14 d及成骨誘導(dǎo)分化21 d后PBS洗滌細(xì)胞，4%多聚甲醛固定1 h，分別加入油紅O染液及茜素紅染色，鏡檢觀察。同時，收集成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d及成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d細(xì)胞，提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)時熒光定量PCR法檢測與細(xì)胞分化類型相關(guān)的特征性基因（成脂：PPARγ基因、Pref-1基因；成骨：Runx2基因、OPN基因）的表達(dá)，并分別與未誘導(dǎo)分化的細(xì)胞進(jìn)行比較[6]。相關(guān)引物序列詳見表1。

表1 成脂、成骨基因qRT-PCR引物序列Tab. 1 qRT-PCR primers for expression of adipogenic and osteogenic genes

2.6 β-半乳糖苷酶染色檢測hUC-MSCs衰老狀況

取hUC-MSCs，以8000細(xì)胞/cm2的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞生長至融合度90%后,按β-半乳糖苷酶染色試劑盒說明書進(jìn)行染色。在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個不同區(qū)域計(jì)數(shù)藍(lán)色的β-半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞，拍照、計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)分析[6]。

2.7 hUC-MSCs內(nèi)及其培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的液相芯片檢測

2.7.1 培養(yǎng)上清收集

用無菌管收集hUC-MSCs培養(yǎng)3 d后的上清，3000 r/min離心20 min，取2 mL上清于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.7.2 細(xì)胞總蛋白提取

取hUC-MSCs，按每107個細(xì)胞加入500 μL蛋白裂解液，在冰上加入蛋白裂解液后充分勻漿，10000 g 4 ℃離心5 min，取上清于-80℃保存?zhèn)溆?，另取一份以BCA法測定細(xì)胞總蛋白濃度。

2.7.3 上機(jī)檢測

取hUC-MSCs培養(yǎng)上清和蛋白樣本勻漿液用人細(xì)胞因子固定化磁珠分析以下13種細(xì)胞因子：白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素4、白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素10、白細(xì)胞介素12P40、白細(xì)胞介素13、白細(xì)胞介素17A、粒細(xì)胞集落刺激因子（GCSF）、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子（Eotaxin）、干擾素γ（IFNγ）、干擾素-α2、腫瘤壞死因子α（TNF-α），所有檢測均在Luminex200分析儀上進(jìn)行，所得數(shù)據(jù)均用Milliplex Analyst 5.1 software分析。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均采用Graphpad Prism 8統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，對兩組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

填埋場處于徑流區(qū)，為半地填埋式，占地面積約為15 000 m2，深4.5 m，總庫容15 000 m3，由10個填埋區(qū)組成，共設(shè)置2個檢漏井。廢渣主要源于鋁礦加工，經(jīng)淋濾作用可能產(chǎn)生氟化物和氰化物等含有害成份的浸出液。在填埋場北東側(cè)和南側(cè)設(shè)3個50 m深的水文地質(zhì)勘察鉆孔，具體位置分布如圖1中所示。

結(jié)果

1 傳代擴(kuò)增代次對hUC-MSCs形態(tài)無明顯影響

3個代次的hUC-MSCs均貼壁生長，細(xì)胞形態(tài)為長而扁平的梭形細(xì)胞，類似于成纖維細(xì)胞，呈極性整齊排列，集落呈渦旋狀，P3和P5的HUC-MSCs大小較為均一，而P10的個別細(xì)胞胞體有所增大（圖1）。

圖1 三個代次hUC-MSCs的形態(tài)學(xué)比較。比例尺，100 μmFig.1 Morphological comparison of three passages of hUC-MSCs. Scale bar, 100 μm

2 傳代擴(kuò)增代次不影響HUC-MSCs免疫表型

細(xì)胞融合度為80%～90%的P3、P5、P10代次HUC-MSCs流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：3個代次HUC-MSCs均高表達(dá)CD73、CD90及CD105（陽性率≥95%），不表達(dá)或低表達(dá)CD11b、CD19、CD34、CD45及HLA-DR（陽性率≤2%）（圖2，表2）。

圖2 不同代次hUC-MSCs免疫表型的流式細(xì)胞術(shù)檢測Fig. 2 Flow cytometry examination of immunophenotype of hUC-MSCs at different passages

表2 不同代次HUC-MSCs表面標(biāo)志物陽性率比較 (±s，%)Tab. 2 Comparison of positive rates of surface markers on hUC-MSCs at different passages (±s, %)

表2 不同代次HUC-MSCs表面標(biāo)志物陽性率比較 (±s，%)Tab. 2 Comparison of positive rates of surface markers on hUC-MSCs at different passages (±s, %)

Generation CD73 CD90 CD105 CD11b CD19 CD34 CD45 HLA-DR P3 99.64±0.1098.31±1.9397.58±5.760.35±0.15 0.22±0.02 0.15±0.010.34±0.080.09±0.01 P5 99.36±0.0298.47±1.3799.10±0.020.47±0.15 0.44±0.19 0.38±0.090.46±0.160.26±0.08 P10 99.30±0.1798.33±1.9597.39±4.12 0.45±0.11 0.26±0.02 0.56±0.150.71±0.150.43±0.11

3 hUC-MSCs的增殖能力隨著擴(kuò)增代次的增加而降低

3個代次的hUC-MSCs生長曲線相似：第1～2天細(xì)胞處于潛伏期，增殖不明顯；第3～5天細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期；第6天之后進(jìn)入平臺期，細(xì)胞生長停滯。細(xì)胞增殖曲線均呈“S”型，兩兩比較，細(xì)胞的增殖能力隨著擴(kuò)增代次的增加而降低 (圖3)。

圖3 不同代次hUC-MSCs的增殖活性檢測。*P＜0.05，n=3。Fig. 3 Proliferation capacity of hUC-MSCs at different passages

4 傳代擴(kuò)增代次對hUC-MSCs核型無明顯影響

細(xì)胞融合度為60%～70%的P3、P5、P10代次HUC-MSCs核型分析結(jié)果顯示：3個代次的hUCMSCs均為正常雙倍體核型(46, XY/46，XX)，未發(fā)現(xiàn)染色體的缺失、重復(fù)、倒位、異位、增多等結(jié)構(gòu)畸形改變（圖4）。

圖4 不同代次HUC-MSCs的核型比較Fig. 4 Comparison of karyotypes of hUC-MSCs at different passages

5 傳代擴(kuò)增代次不影響HUC-MSCs成骨成脂誘導(dǎo)分化能力

成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)14 d及成骨誘導(dǎo)分化21 d后進(jìn)行成骨和成脂能力檢測顯示，3個代次的HUCMSCs均出現(xiàn)紅色的鈣質(zhì)結(jié)節(jié)和紅色的脂滴（圖5A、C），細(xì)胞分化類型相關(guān)的特征性基因（成骨：Runx2和OPN基因；成脂：PPARγ和Pref-1基因）表達(dá)水平均顯著高于對照組（圖5B、D）。

圖5 不同代次hUC-MSCs誘導(dǎo)分化能力比較。A，HUC-MSCs成骨誘導(dǎo)分化后茜素紅染色；比例尺，100 μm。B，hUC-MSCs成骨誘導(dǎo)分化相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平qRT-PCR檢測。C，hUC-MSCs成脂誘導(dǎo)分化后油紅O染色；比例尺，400 μm。D，HUC-MSCs成脂誘導(dǎo)分化相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測。與對照組相比較：*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001Fig.5 Comparison of pluripotent differentiation ability of hUC-MSCs in different generations. A, Alizarin Red staining after osteogenic differentiation of hUC-MSCs ; scale bar, 100 μm. B, expression of genes related to osteogenic differentiation of hUC-MSCs. C, Oil Red O staining after adipogenic differentiation of hUC-MSCs; scale bar, 400μm. D, expression of genes related to adipogenesis and differentiation of hUC-MSCs. Compared with the control group: *P＜0.05; **P＜0.01; ***P＜0.001

6 傳代擴(kuò)增代次的增加促進(jìn)HUC-MSCs老化

衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色是目前檢測細(xì)胞衰老最常用的方法。衰老細(xì)胞產(chǎn)生的SAβ-gal在pH值為6.0時可以將底物X-gal催化成深藍(lán)色產(chǎn)物，從而可以用SA-β-gal活性（即藍(lán)染細(xì)胞占比）反映細(xì)胞衰老情況[7]。本研究結(jié)果顯示，P3、P5 HUC-MSCs內(nèi)可見少量β-半乳糖苷酶染色的衰老細(xì)胞，P3與P5之間衰老細(xì)胞數(shù)無顯著性差異；與P3、P5 HUC-MSCs比較，P10 HUC-MSCs中衰老細(xì)胞數(shù)量顯著增加，即隨著擴(kuò)增代次的增加，HUCMSCs逐漸衰老，表現(xiàn)為胞體增大，胞核體積異常及多核，胞內(nèi)顆粒增多，并出現(xiàn)高酶活性的SA-β-gal（圖6）。

圖6 傳代擴(kuò)增代次對hUC-MSCs衰老影響的β-半乳糖苷酶染色檢測。A，不同代次hUC-MSCs的代表性β-半乳糖苷酶染色結(jié)果（比例尺，200 μm）；B，β-半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（*P＜0.05；ns，P＞0.05）Fig. 6 β-Galactosidase staining to detect the effect of the generation of passage amplification on the aging of hUC-MSCs. A, representative β-Galactosidase staining results of hUC-MSCs at different passages (scale bar, 200 μm); B, statistical analysis for the number of β-Galactosidase positive cells of hUC-MSCs (*P＜0.05; ns, P＞0.05)

7 傳代擴(kuò)增代次的增加影響HUC-MSCs胞內(nèi)和培養(yǎng)上清SASP因子的表達(dá)分泌

圖7 傳代擴(kuò)增代次對hUC-MSCs細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)水平的液相芯片檢測與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。*P＜0.05Fig.7 The expression level of cytokines in hUC-MSCs cells was detected by liquid chip and statistically analyzed. *P＜0.05。

圖8 傳代擴(kuò)增代次對hUC-MSCs培養(yǎng)上清細(xì)胞因子分泌水平的液相芯片檢測與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。*P＜0.05Fig.8 Detection and statistical analysis of cytokine secretion level of hUC-MSCs culture supernatant by liquid chip. *P＜0.05.

討論

有研究表明，體外連續(xù)傳代擴(kuò)增會增加HUCMSCs衰老現(xiàn)象的出現(xiàn)，表現(xiàn)為細(xì)胞增殖能力減弱、表面免疫標(biāo)記表達(dá)率下降和多向分化潛能的喪失等[8,9]。本研究結(jié)果顯示，HUC-MSCs體外傳代培養(yǎng)至10代均能滿足國際細(xì)胞療法和間充質(zhì)與組織干細(xì)胞委員會制定的最低間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)[10]，同時，染色體核型仍保持其穩(wěn)定性。

衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶（SA-β-ga）)是細(xì)胞的衰老標(biāo)志物之一，本研究中不同代次HUC-MSCs的形態(tài)特征及生長曲線相似，傳至第10代以后，細(xì)胞增殖變慢，細(xì)胞體積增大、長角分化，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡，并出現(xiàn)高酶活性的SA-β-gal，隨著擴(kuò)增代次的增加，逐漸進(jìn)入衰老期。這可能與細(xì)胞在衰老過程中溶酶體活性增加和細(xì)胞溶質(zhì)pH值6.0時,會表達(dá)高酶活性的SA-β-gal有關(guān)。SA-β-gal在體外和體內(nèi)隨著成纖維細(xì)胞的老化而增加[11]。

SASP是衰老細(xì)胞常見的特征，在體內(nèi)產(chǎn)生有益或有害的影響取決于所處環(huán)境的不同。SASP與衰老所帶來的毒副作用有關(guān)，并且通過自分泌和旁分泌增強(qiáng)表型，向鄰近細(xì)胞傳遞衰老信號，通過組織微環(huán)境和ROS介導(dǎo)的途徑，促進(jìn)細(xì)胞衰老進(jìn)程。調(diào)控SASP相關(guān)信號通路機(jī)制復(fù)雜，主要包括持續(xù)的DNA 損傷反應(yīng)[12]、p38MAPK信號通路的激活[13]、NF-κB及C/EBPβ通路的激活[14]、JAK/STAT 通路的激活[15]等。IL- 6、IL-8、IL-1β、TNF-α均屬于SASP中的促炎細(xì)胞因子，其中IL-6、IL-1β表達(dá)較為常見[16]。IL-6是一種多功能的細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答、炎癥等過程。既往研究表明，IL-6 是維持MSC干性的重要細(xì)胞因子之一，外源性的IL-6分泌對于同一批次培養(yǎng)下的HUC-MSCs是一種正向的刺激反饋，可以維持HUC-MSCs的增殖活性[17]。而IL-1β是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要促炎因子，它參與調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答、炎癥等過程。IL-1β不僅是 MSC免疫功能活化的重要刺激因子，也是其造血支持能力活化的刺激因子。既往文獻(xiàn)表明，MSCs免疫活性作用需要炎癥因子IL-1β、IFN-γ或TNF-α的活化[18]。IL-1β既能促進(jìn)IL-6的分泌，也對MSC的G-CSF、GM-CSF mRNA和蛋白表達(dá)均有明顯的促進(jìn)作用[19]。GM-CSF為自分泌型細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)細(xì)胞生長、血管再生、抗纖維化、抗凋亡，促進(jìn)自身分化為成纖維細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞等，對MSCs的增殖起到正反饋?zhàn)饔肹20]。以上文獻(xiàn)表明，外源性的IL-6、IL-1β和GM-CSF均對MSCs 的增殖起到正反饋?zhàn)饔谩Ｍ瑫r，有研究表明，內(nèi)源性的IL-6、IL-1β和GM-CSF表達(dá)量會隨著細(xì)胞衰老逐漸升高[21-23]。本研究在對P3、P5、P10代次的HUC-MSCs胞內(nèi)及培養(yǎng)上清細(xì)胞因子水平的檢測中發(fā)現(xiàn)，在胞內(nèi)及培養(yǎng)上清中均能檢測到IL-6、G-CSF、IL-1β、TNF-α和GM-CSF。胞內(nèi)IL-6和IL-1β隨著擴(kuò)增代次增加升高；培養(yǎng)上清GM-CSF隨著擴(kuò)增代次增加下降。我們的研究與以上的研究結(jié)果基本一致。因此，在MSCs體外連續(xù)傳代擴(kuò)增的過程中，IL-6、IL-1β和GM-CSF的分泌表達(dá)水平可以作為細(xì)胞衰老的參考指標(biāo)，如果外源性的IL-6、IL-1β和GM-CSF分泌量下降，內(nèi)源性的IL-6、IL-1β和GM-CSF表達(dá)量升高，那么提示HUC-MSCs逐漸進(jìn)入衰老期 。雖然激活衰老信號通路的分子機(jī)制各不相同，但干細(xì)胞的衰老是由自分泌和旁分泌效應(yīng)共同作用的結(jié)果。

綜上所述，HUC-MSCs 是具備高增殖活性和多向分化特性的間充質(zhì)干細(xì)胞群，體外長期傳代擴(kuò)增后，可穩(wěn)定表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞特異性表面標(biāo)記并保持分化活性和基因穩(wěn)定性，雖然不會丟失干性，但會呈現(xiàn)一定的復(fù)制性衰老趨勢，SASP因子分泌增強(qiáng)， 過多的SASP積累會破壞HUC-MSCs正常細(xì)胞形態(tài)和功能。所以，臨床應(yīng)用的時候，建議選擇年輕態(tài)的HUC-MSCs較為合適。