隱丹參酮對人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的抑制、凋亡的促進(jìn)和TGF-β1/Smads信號通路活性的下調(diào)

黃玉成，許慧，陳曉昱，張艷紅

（鄭州人民醫(yī)院皮膚科，鄭州 450000）

增生性瘢痕是一種皮膚纖維化疾病，臨床常表現(xiàn)為創(chuàng)傷愈合后皮膚組織增厚凸出、色素沉積或脫失、皮膚瘙癢、組織疼痛，甚至關(guān)節(jié)活動受限，嚴(yán)重影響患者皮膚美觀和健康。目前關(guān)于增生型瘢痕尚無理想治療方案，因此，不斷探索增生性瘢痕新的有效療法仍然是美容整形領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題[1]。隱丹參酮（cryptotanshinone，CPT）是中藥丹參的重要活性成分，具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤細(xì)胞增生等廣泛的藥理學(xué)作用[2,3]。少數(shù)研究表明CPT可以下調(diào)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞（hypertrophic scar fibroblasts，HSF）的增殖能力[4]，可能是治療增生性瘢痕的潛在有效藥物。但目前關(guān)于該結(jié)論缺乏足夠證據(jù)支持，其對HSF的作用機(jī)制也不夠明確。因此，本研究旨在進(jìn)一步明確CPT對人HSF生長及纖維化的影響，并初步探討其作用機(jī)制，從而為瘢痕治療新型藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。

材料與方法

1 材料

1.1 人增生性瘢痕組織來源

選取鄭州人民醫(yī)院手術(shù)獲取的增生性瘢痕標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：18歲≤年齡≤60歲，病程3～6個月，2年內(nèi)未進(jìn)行系統(tǒng)性抗瘢痕治療，無系統(tǒng)性或全身器質(zhì)性疾病。樣本經(jīng)患者授權(quán)使用。

1.2 藥品與試劑

CPT（純度≥98%，麥克林）；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco）；兔抗抗波形蛋白單克隆抗體、兔抗轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）、兔抗p-Smad2、p-Smad3、Smad4、鼠抗Bax、Bcl-2、鼠抗α-SMA、tubulin、GAPDH、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔/小鼠IgG、Alexa Fluor?647標(biāo)記的羊抗鼠IgG均購自Abcam中國公司；DAPI（北京索萊寶）；結(jié)蹄組織生長因子（CTGF）、人-α平滑肌肌動蛋白（α-SMA），人Ⅰ、Ⅲ型膠原（Col-Ⅰ、Col-Ⅲ）ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)）；Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡試劑盒、MTT試劑盒、BeyoClick?EdU-488細(xì)胞增殖檢測試劑盒（上海碧云天）；羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）測試盒（北京索萊寶）。

2 人HSF細(xì)胞培養(yǎng)與分組

采用組織塊法[5]原代培養(yǎng)HSF細(xì)胞：將剪成約0.5 mm3大小的瘢痕組織置于10%胎牛血清+DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，7 d后換液一次，之后每3 d換液一次，待細(xì)胞融合度為80%～90%時，以1:3傳代培養(yǎng)。拍照記錄第3代細(xì)胞形態(tài)，并4%多聚甲醛固定，采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測抗波形蛋白表達(dá)情況進(jìn)行細(xì)胞鑒定：取固定好的細(xì)胞PBS清洗固定液，0.3% Triton X-100破膜，3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，抗原修復(fù)后用2%牛血清白蛋白室溫孵育20 min，兔抗波形蛋白（1:400）37 ℃孵育1 h，PBS清洗后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（1:2000）室溫孵育40 min，PBS清洗后0.05% DAB/0.01% H2O2呈色，蘇木精復(fù)染，顯微鏡觀察、拍照記錄。

取處于對數(shù)生長期HSF細(xì)胞，消化、漂洗后加培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，以2×104個/孔接種于12孔板中，并隨機(jī)分為對照組、低劑量CPT（L-CPT）組、中劑量CPT（M-CPT）組和高劑量CPT（H-CPT）組。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，L-CPT、M-CPT、H-CPT組分別加入終濃度為25、50、80 μg/mL的CPT，對照組加入等體積的培養(yǎng)液，每組設(shè)5個復(fù)孔，置于37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后待檢。

3 EdU染色檢測細(xì)胞增殖情況

取處理24 h后的各組細(xì)胞，分別加入37 ℃預(yù)熱的EdU工作液，置于培養(yǎng)箱中孵育2 h；之后棄培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛，室溫固定15 min；棄固定液，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）清洗3 min×3次，加入含0.3% Triton X-100的PBS，室溫孵育15 min通透，PBS清洗2次；加入Click反應(yīng)液，輕輕搖晃使均勻覆蓋細(xì)胞，室溫避光孵育30 min，PBS清洗3次；加入Hoechst（稀釋比例1:1000）溶液覆蓋細(xì)胞，室溫孵育10 min，PBS清洗3次。熒光顯微鏡觀察陽性細(xì)胞比例并拍照記錄。

4 MTT法檢測細(xì)胞生長抑制率

取各組培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，PBS小心漂洗3次，加入MTT培養(yǎng)液，4 h后終止培養(yǎng)，去培養(yǎng)液加入二甲基亞砜，搖床低速震蕩10 min，結(jié)晶物充分溶解后用酶聯(lián)免疫檢測儀測定490 nm處的吸光度（A值）。細(xì)胞生長抑制率=（1-A給藥組/A對照組）×100%。

5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況

收集各組培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞，0.25%胰酶消化，待細(xì)胞形態(tài)呈橢圓或圓形，終止消化，PBS清洗2次，重懸細(xì)胞，混合5 mol/L Annexin V，室溫避光反應(yīng)10 min，再加入50 mg/L PI染色，室溫避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。

6 蛋白水平Western blot檢測

取培養(yǎng)48 h的HSF細(xì)胞加入RIPA裂解液，采用總蛋白提取試劑盒（Solarbio）提取總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度。之后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，分別入抗α-SMA、tubulin、Bax、Bcl-2、TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、Smad4、GAPDH一抗，4 ℃孵育過夜，PBS漂洗后入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔或羊抗小鼠IgG（1:5000）室溫孵育1.5 h。ECL曝光成像，Image J軟件定量分析目的蛋白相對表達(dá)量。α-SMA蛋白表達(dá)量以tubulin為內(nèi)參，TGFβ1、p-Smad2、p-Smad3、Smad4，Bax、Bcl-2均以GAPDH為內(nèi)參。

7 免疫熒光染色檢測α-SMA表達(dá)

取各組培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，4%多聚甲醛室溫固定30 min，清洗后加入1% Triton X-100，20 min后加入3% BSA，室溫封閉20 min；清洗后加入小鼠抗α-SMA抗體（1:200），4 °C孵育過夜，加入Alexa Fluor?647標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（1:1000）和DAPI（1:2000），室溫孵育45min后，CLS-2SS激光掃描共聚焦顯微鏡（美國Thorlabs）觀察α-SMA表達(dá)情況（激發(fā)波長652nm，發(fā)射波長668 nm）并拍照，每孔細(xì)胞選取5個視野；利用顯微鏡自帶掃描分析軟件測定紅色熒光平均強(qiáng)度，同時計(jì)算各視野中α-SMA陽性細(xì)胞比例：α-SMA陽性細(xì)胞數(shù)/視野總細(xì)胞數(shù)×100%。

8 ELISA法檢測Col-Ⅰ、Col-Ⅲ水平

取各組培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞，胰酶消化、DMEM培養(yǎng)液重懸（1×104個/mL），加入200 μL RIPA 緩沖液，室溫孵育2 min，3000 r/min離心15 min，取上清。取部分上清液采用ELISA法檢測Col-I、Col-Ⅲ水平，操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

9 HYP測試盒檢測羥脯氨酸含量

取培養(yǎng)48 h的HSF細(xì)胞1 mL（約5×106個）在高壓消毒器中（5磅）保持30 min，自然降壓后加入試劑一混勻，室溫靜置20 min后加入試劑二混勻，60 ℃下反應(yīng)20 min；待冷卻至室溫后離心，取上清，酶標(biāo)儀測定560 nm處的吸光度（A值），計(jì)算HYP含量。HYP含量（mg/104cell）=0.077×（A560-0.0251）/細(xì)胞數(shù)量（萬個）。

10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各實(shí)驗(yàn)均設(shè)置6個復(fù)孔，數(shù)據(jù)以均值和標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間數(shù)據(jù)比較采用SPSS19.0進(jìn)行單因素方差檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Dunnett’s t檢驗(yàn)，均以P＜0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

結(jié)果

1 傳代3次獲得高純度HSF細(xì)胞

將分離培養(yǎng)的HSF傳代3次后進(jìn)行相差顯微鏡觀察顯示，第3代HSF細(xì)胞形態(tài)呈長梭狀匯合成片（圖1A）；免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示所有細(xì)胞均呈抗波形蛋白陽性（圖1B），表明分離培養(yǎng)的第3代細(xì)胞為高純度HSF細(xì)胞。

圖1 HSF細(xì)胞鑒定分析。A，第3代HSF細(xì)胞形態(tài)的相差顯微鏡觀察（比例尺，100 μm）；B，第3代HSF細(xì)胞純度的抗波性蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)檢測（比例尺，50 μm）Fig. 1 Identification of HSF cells. A, phase contrast microscopic observation of morphology of third-generation HSF cells (scale bar, 100 μm); B, detection for the purity of the third generation HSF cells by Vimentin protein immunocytochemistry (scale bar, 50 μm)

2 CPT抑制HSF細(xì)胞增殖且促進(jìn)HSF細(xì)胞凋亡

EdU染色顯示，隨著CPT劑量的增加，增殖細(xì)胞比例逐漸降低（圖2，圖3A）；MTT法檢測細(xì)胞活力顯示，CPT能劑量依賴性增加HSF細(xì)胞生長抑制率（圖3B）；流式細(xì)胞術(shù)檢測表明，CPT能劑量依賴性增加HSF細(xì)胞凋亡率（圖4A、B）；Western blot檢測顯示，CPT能劑量依賴性上調(diào)凋亡蛋白Bax水平，下調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2水平（圖4C、D）。

圖2 CPT對HSF細(xì)胞增殖影響的EdU染色檢測。比例尺，50 μmFig. 2 EdU staining examination for the effect of CPT on the proliferation of HSF cells. Scale bar, 50 μm

圖4 CPT對HSF細(xì)胞凋亡的影響。A，CPT對HSF細(xì)胞凋亡率影響的代表性流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果；B，CPT對HSF細(xì)胞凋亡率影響的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；C，CPT對HSF細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2表達(dá)影響的代表性Western blot檢測結(jié)果； D，CPT對HSF細(xì)胞Bax/Bcl-2表達(dá)影響的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*與對照組相比：P＜0.05; #與L-CPT組相比：P＜0.05;與M-CPT組相比：&P＜0.05Fig. 4 Effect of CPT on apoptosis of HSF cells. A, representative flow cytometry results of the effect of CPT on the apoptosis rate of HSF cells; B, statistical analysis for the effect of CPT on apoptosis rate of HSF cells; C, representative Western blot results of the effect of CPT on the expression of apoptosis-related proteins, Bax/Bcl-2, in HSF cells; D, statistical analysis for the effect of CPT on the expression of Bax/Bcl-2 in HSF cells; *P＜0.05, compared with the control group; # P＜0.05, compared with L-CPT group; &P＜0.05, compared with M-CPT group

3 CPT下調(diào)HSF細(xì)胞α-SMA水平

免疫熒光染色顯示，CPT能劑量依賴性降低HSF細(xì)胞的α-SMA陽性比例和α-SMA免疫反應(yīng)性（紅色熒光強(qiáng)度）（圖5A、B）；Western blot檢測顯示，CPT能劑量依賴性降低HSF細(xì)胞內(nèi)α-SMA水平（圖5C、D）。

圖5 CPT對HSF細(xì)胞α-SMA水平的影響。A，CPT對HSF細(xì)胞α-SMA水平影響的代表性免疫熒光檢測結(jié)果（比例尺，25 μm）；B， CPT對HSF細(xì)胞α-SMA水平（免疫熒光檢測）影響的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；C，CPT對HSF細(xì)胞α-SMA水平影響的代表性Western blot檢測結(jié)果；D， CPT對HSF細(xì)胞α-SMA水平（Western blot檢測）影響的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；與對照組相比：**P＜0.01, ***P＜0.001; 與L-CPT組相比：#P＜0.05, ##P＜0.01, ### P＜0.01；與M-CPT組相比：&&P＜0.01，&&& P＜0.001Fig. 5 Effect of CPT on α-SMA level in HSF cells. A, representative immunofluorescence examination results of the effect of CPT on α-SMA level in HSF cells (scale bar, 25 μm); B, statistical analysis for the effect of CPT on α-SMA level (detected by immunofluorescence) in HSF cells; C, representative Western blot results of the effect of CPT on α-SMA levels in HSF cells; D, statistical analysis for the effect of CPT on α-SMA level (detected by Western blot) in HSF cells; ** P＜0.01, *** P＜0.001, compared with the control group; #P＜0.05, ##P＜0.01, ###P＜0.01, compared with L-CPT group; &&P ＜0.01, &&&P ＜0.001, compared with M-CPT group

4 CPT下調(diào)HSF細(xì)胞膠原蛋白Col-Ⅰ和Col-Ⅲ水平

ELISA分析與HYP試劑盒法檢測顯示，CPT處理劑量依賴性使HSF細(xì)胞內(nèi)膠原蛋白Col-Ⅰ和Col-Ⅲ水平和HYP含量均顯著下降（表1）。

表1 CPT對HSF細(xì)胞膠原蛋白水平的影響Tab. 1 Effect of CPT on the levels of the collagen proteins in HSF cells

5 CPT下調(diào)HSF細(xì)胞TGF-β1/Smads信號通路相關(guān)蛋白水平

Western blot檢測顯示，CPT處理劑量依賴性下調(diào)HSF細(xì)胞內(nèi)TGF-β1/Smads信號通路相關(guān)蛋白TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3和Smad4水平（圖6）。

圖6 不同濃度CPT對HSF細(xì)胞TGF-β1/Smads信號通路蛋白水平影響的Western blot檢測與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。與對照組相比：*P＜0.05；與L-CPT組相比：#P＜0.05；與M-CPT組相比：&P＜0.05Fig. 6 Western blotting and statistical analysis for the effect of different concentrations of CPT on the levels of TGF-β1/Smads signaling pathway related proteins in HSF cells. *P＜0.05, compared with control group; #P＜0.05, compared with L-CPT group; &P＜0.05, compared with M-CPT group

討論

增生性瘢痕的病理特征包括纖維細(xì)胞的大量增殖和胞外基質(zhì)過度沉積，其發(fā)病不僅影響患者美觀，而且可能造成局部肢體功能受限，影響患者健康。目前關(guān)于增生性瘢痕的臨床治療主要以藥物、手術(shù)及激光等手段為主，但防治效果并不理想[6]。因此，探索安全、有效的抗瘢痕增生方法，提高治療效果是目前皮膚美容領(lǐng)域亟待解決的問題。近年來，隨著中醫(yī)藥的不斷發(fā)展，中藥在皮膚疾病及美容中的應(yīng)用越來越受到重視，有研究發(fā)現(xiàn)中藥丹參活性成分丹參酮ⅡA、丹參素等對增生性瘢痕具有一定抑制作用[7]。CPT也是中藥丹參的重要活性成分之一，已被證實(shí)可通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bax/Bcl-2等的表達(dá)及相關(guān)信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻斷細(xì)胞周期，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移等發(fā)揮抗腫瘤作用[8,9]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)除了抗腫瘤作用外，CPT還具有抗炎、抗纖維化等能力，如可通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶2緩解丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞纖維化[10]；也可通過降低炎性因子水平減輕結(jié)腸炎炎癥，抑制JAK/STAT信號通路阻滯結(jié)腸組織細(xì)胞的過度生長、遷移等過程，改善細(xì)胞纖維化狀態(tài)[11]。也有研究報(bào)道CPT可逆轉(zhuǎn)肺上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，降低肺纖維化模型大鼠肺成纖維細(xì)胞中TGF-β、α-SMA、Col-Ⅰ的表達(dá)及HYP含量，抑制TGF-β誘導(dǎo)的Smad2/3和STAT3磷酸化，有效改善肺纖維化程度[12,13]。增生性瘢痕也是由于成纖維細(xì)胞向肌纖維細(xì)胞的過度轉(zhuǎn)化及增生所致，α-SMA、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ及HYP均在此過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[14]。其中，α-SMA是肌纖維細(xì)胞收縮功能的標(biāo)志性蛋白，具有傳導(dǎo)收縮信號的作用，在傷口病理性愈合過程中，肌成纖維細(xì)胞大量生成，產(chǎn)生過多的α-SMA，進(jìn)而刺激組織過度分泌Col-Ⅰ和Col-Ⅲ等胞外基質(zhì)，促進(jìn)瘢痕增生[15]。因此，抑制瘢痕組織成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化是改善瘢痕增生的關(guān)鍵。目前的研究報(bào)道CPT在心肌、肺等多種組織中具有抗纖維化的作用，但在增生性瘢痕中的研究較少。楊莉等[16]研究發(fā)現(xiàn)CPT對兔耳增生性瘢痕有一定抑制作用，可明顯降低瘢痕指數(shù)、成纖維細(xì)胞和膠原纖維密度，減少瘢痕組織中α-SMA、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ表達(dá)水平，降低膠原含量；也有細(xì)胞研究顯示[4]，CPT可有效下調(diào)小鼠HSF細(xì)胞中α-SMA、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ表達(dá)，抑制細(xì)胞遷移和收縮，減少膠原含量，抑制纖維化，但CPT對人HSF作用目前尚未見報(bào)道。本研究檢測到，CPT可有效抑制人HSF細(xì)胞的增殖、促進(jìn)凋亡，減少細(xì)胞α-SMA、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ表達(dá)水平和HYP含量，且作用效果隨CPT濃度的增加逐漸明顯，提示CPT對人HSF細(xì)胞的生長和分化具有一定的抑制作用，并可能可以用于增生性瘢痕的治療。但該作用的最佳療效劑量還需后續(xù)進(jìn)一步深入研究。

TGF-β1是公認(rèn)的促進(jìn)纖維化發(fā)生的主要作用因子，當(dāng)組織受到損傷時，增多的TGF-β1可促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致膠原合成與降解失衡，引發(fā)胞外基質(zhì)沉積[17]；Smads是TGF-β1受體的胞內(nèi)激酶底物，介導(dǎo)TGF-β1與受體結(jié)合的信號傳導(dǎo)[18]。研究已證TGF-β1/Smads信號通路是增生性瘢痕形成的關(guān)鍵途徑之一，與增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖、凋亡及轉(zhuǎn)分化等病理學(xué)過程密切相關(guān)[19,20]。近年來有研究[21]發(fā)現(xiàn)CPT可通過TGFβ1/Smads信號通路抑制腎小管上皮細(xì)胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，改善腎纖維化狀態(tài)；近期也有研究發(fā)現(xiàn)CPT可明顯降低兔耳瘢痕組織中TGF-β1、Smad4、p-Smad2/3蛋白水平。但CPT是否對人HSF細(xì)胞TGF-β1/Smads信號通路具有一定的抑制作用尚待求證。本研究檢測了不同濃度CPT作用下的人HSF細(xì)胞中TGFβ1/Smads信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示CPT作用下的HSF細(xì)胞TGF-β1、Smad4、p-Smad2、p-Smad3蛋白相對表達(dá)量明顯低于對照組，且濃度越大，該通路蛋白表達(dá)水平越低，與上述楊莉等[16]在兔耳疤痕組織中的研究結(jié)果一致。因此，CPT可能是通過抑制TGF-β1/Smads信號通路的激活改善HSF細(xì)胞的纖維化過程。