脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基通過(guò)降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水平改善皮膚衰老表型

汪婧雯，杜方舟,3，汪季琳淋，武月，余爽，張京鐘

（中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所1醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)室，2醫(yī)學(xué)電子室，蘇州 215163；3中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)，合肥 230026；4蘇州京賽諾生物科技有限公司，蘇州 215163）

皮膚衰老是目前皮膚科學(xué)領(lǐng)域較熱門的研究方向[1]。紫外線輻射是皮膚衰老的主要因素，對(duì)皮膚的傷害最為嚴(yán)重[2,3]。當(dāng)過(guò)量的紫外線照射皮膚，會(huì)使皮膚組織細(xì)胞因氧化應(yīng)激水平升高而產(chǎn)生過(guò)量的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），過(guò)量的ROS會(huì)破壞細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)，損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)，引起細(xì)胞凋亡[4,5]。

干細(xì)胞是一種具有自我更新和分化潛能的功能細(xì)胞，為多種難治性重大疾病提供新的解決策略[6]。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs）來(lái)源于脂肪組織，是目前被廣泛研究的一類成體干細(xì)胞，來(lái)源豐富且易提取，是理想的種子細(xì)胞[7-9]。干細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中向培養(yǎng)基中分泌大量的生物活性物質(zhì)，這些旁分泌物會(huì)改善細(xì)胞的生理狀態(tài)，具有免疫調(diào)節(jié)能力、抗炎能力等生物活性[10,11]。干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基（conditioned medium，CM）不僅富含干細(xì)胞的旁分泌物，而且具備比干細(xì)胞存儲(chǔ)容易和應(yīng)用更安全的優(yōu)勢(shì)。

研究表明CM能夠抑制細(xì)胞衰老或降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水平[12]，但對(duì)于CM治療皮膚光老化與抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的直接聯(lián)系研究較少。本文針對(duì)皮膚光老化與細(xì)胞氧化應(yīng)激之間的關(guān)系展開(kāi)研究，證明CM改善皮膚衰老是通過(guò)下調(diào)細(xì)胞氧化應(yīng)激水平實(shí)現(xiàn)的，為臨床上治療皮膚衰老提供新的研究依據(jù)。

材料與方法

1 主要試劑

Ultra CULTURE無(wú)血清培養(yǎng)基（瑞士Lonza公司）；CCK-8試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）（日本Dojindo公司）；超氧化物陰離子熒光探針（上海碧云天公司）；細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase，SA-β-gal）染色試劑盒（上海碧云天公司）；總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所）；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所）；Masson染色試劑盒（美國(guó)Solarbio公司）；Weigert彈力纖維染色液（雷根生物公司）；RNA提取試劑盒（美國(guó)Omega公司）。

2 主要儀器

V arioskan LUX VL0L00D0酶 標(biāo) 儀（Thermo Fisher Scientific）；QuantStudio 1實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Thermo Fisher Scientific）；Nexcope NIB900倒置熒光顯微鏡（寧波永新光學(xué)股份有限公司）；日立U-3900H紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日立科學(xué)儀器）。

3 皮膚衰老動(dòng)物模型及治療

選擇6周齡雌性BALB/c Nude裸鼠用于構(gòu)建皮膚衰老動(dòng)物模型，購(gòu)入后于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中飼養(yǎng)一周。采用UVB-313燈管安裝于自制的紫外線輻射箱中，作為輻射光源。待光源穩(wěn)定后，將裸鼠固定于輻射箱中進(jìn)行照射，根據(jù)說(shuō)明，最小紅斑量（minimal erythema dose，MED）為75 mJ/cm2，第一周按1 MED進(jìn)行照射，以后每周遞增1個(gè)MED，直至第四周4 MED為止（圖1）。在裸鼠背部劃分四個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域中心設(shè)置一個(gè)注射點(diǎn)并進(jìn)行標(biāo)記，分別在標(biāo)記的點(diǎn)位上給予皮下注射生理鹽水和CM 50 μL，隔日一次，連續(xù)4周。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照《美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理與使用指南》進(jìn)行，并經(jīng)過(guò)中國(guó)科學(xué)院生物研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：2018-A21）。

4 組織化學(xué)及免疫熒光染色

施加干預(yù)4周后處死裸鼠，在對(duì)應(yīng)的背部皮膚位置切取約1×1 cm2組織，浸泡在4%多聚甲醛溶液中固定，4 ℃過(guò)夜。按常規(guī)方法制備6 μm石蠟切片。對(duì)組織切片進(jìn)行Masson染色和Weigert彈力纖維染色，在倒置顯微鏡下觀察并拍照，用Image J軟件對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行量化。用抗Ki-67抗體（1:100）和抗α-SMA抗體（1:300）孵育組織切片，然后進(jìn)行免疫熒光染色，用DAPI（4’,6-Diamidino-2-phenylindole）染料復(fù)染細(xì)胞核。置于熒光顯微鏡下觀察。

5 細(xì)胞制備及氧化應(yīng)激細(xì)胞模型建立

所有研究遵守《人類胚胎干細(xì)胞研究倫理指導(dǎo)原則》（中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部和衛(wèi)生部，2003年）。經(jīng)機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)批準(zhǔn)，從蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院獲得脂肪或皮膚樣本。

ADSCs的原代培養(yǎng)：取新鮮脂肪組織浸泡于含1%青霉素-鏈霉素的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）中，剔除血管、結(jié)締組織等，加入膠原酶振蕩消化30 min，終止消化后離心，棄上層液體，用PBS重懸沉淀，篩網(wǎng)過(guò)濾較大組織塊，再次離心5 min，用含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后接種至培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。本研究中采用ADSCs培養(yǎng)至3～6代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（圖1）。

人真皮成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)：取包皮環(huán)切術(shù)切除的新鮮組織，用含1%青霉素和鏈霉素的PBS漂洗兩次后，浸泡30 min，剔除皮下脂肪、結(jié)締組織等。將組織剪成0.5～1 cm2的皮片，用2 mg/mL的dispase Ⅱ 酶溶液，4 ℃消化過(guò)夜。分離表皮和真皮，將真皮剪碎置于培養(yǎng)瓶中，在培養(yǎng)箱靜置2 h后，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)（圖1）。

氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞模型的建立：采用人真皮成纖維細(xì)胞。取傳代培養(yǎng)至第3～6代的成纖維細(xì)胞接種于孔板內(nèi)，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，更換含有H2O2（終濃度為200 μmol/L）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)2～4 h，之后更換正常DMEM培養(yǎng)基或CM繼續(xù)培養(yǎng)48 h（圖1）。

圖1 CM影響皮膚衰老表型和細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的實(shí)驗(yàn)總體流程圖。ADSCs擴(kuò)增培養(yǎng)后收集CM，經(jīng)皮下注射到皮膚衰老裸鼠模型或體外應(yīng)用于H2O2處理的成纖維細(xì)胞，從細(xì)胞層面和在體實(shí)驗(yàn)兩方面評(píng)估CM對(duì)皮膚衰老及氧化應(yīng)激的影響Fig. 1 The experimental diagram of studying the CM effects on skin aging and oxidative stress in fibroblasts. CM was collected from ADSCs culture, followed by subcutaneous injection into the aging nude mouse model or application on the H2O2-treated fibroblasts. The effects of CM on senescent phenotype and the underlying mechanism were evaluated at both histological and cellular levels

6 CM制備

將ADSCs以8×104個(gè)/mL的密度接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，正常培養(yǎng)至細(xì)胞生長(zhǎng)融合度為70%～80%時(shí)，吸棄原有含血清培養(yǎng)基，更換Ultra CULTURE無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞上清液。在4 ℃，200 g條件下離心15 min，棄沉淀。上清液用0.22 μm的濾膜過(guò)濾，所得濾液即為本研究中的CM。

7 CCK-8法細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

分別用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基和CM處理氧化應(yīng)激細(xì)胞模型48 h后，加入CCK-8于培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處的吸光度值，以630 nm為參比波長(zhǎng)。

8 SA-β-gal染色

將細(xì)胞室溫固定15 min，加入染色工作液37 ℃避光孵育過(guò)夜，次日用倒置顯微鏡隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照計(jì)數(shù)。計(jì)算公式為：SA-β-gal陽(yáng)性率%=（藍(lán)染細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%。

9 細(xì)胞氧化應(yīng)激水平測(cè)定

用終濃度為1 μmol/L的二氫乙錠（dihydroethidium，DHE）溶液避光處理細(xì)胞45 min，將細(xì)胞室溫固定10 min，用DAPI染料復(fù)染細(xì)胞核，在倒置熒光顯微鏡的555 nm激發(fā)波長(zhǎng)下觀察紅色熒光細(xì)胞強(qiáng)度，拍照并隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞熒光陽(yáng)性率，以此表示細(xì)胞內(nèi)ROS含量。

用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，冰浴環(huán)境下超聲破碎至細(xì)胞完全裂解，4 ℃，2000 r/min離心10 min，留取上清液，嚴(yán)格按照試劑盒上說(shuō)明書(shū)操作，使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定吸光度并計(jì)算SOD和GSHPX活性。

10 實(shí)時(shí)定量熒光PCR

用Trizol提取細(xì)胞的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。在Real-time PCR儀上完成去乙?；?（Sirtuin1，SIRT1）、I型膠原（collagen type I，COL-1）、Ⅲ型膠原（collagen type Ⅲ，COL-3）的基因定量及分析。相關(guān)基因的引物序列見(jiàn)表1，內(nèi)參為GAPDH基因，采用2-ΔΔCt方法。

表1 實(shí)時(shí)定量 PCR 中的引物序列Tab. 1 Primer sequences in real-time PCR

11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)大于等于3次，所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析（ANOVA）對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，以P＜0.05視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 注射CM改善裸鼠皮膚光老化的表型

ADSCs擴(kuò)增培養(yǎng)后收集的CM皮下注射到裸鼠光老化皮膚模型（圖1），4周后Masson三色染色顯示，裸鼠光老化皮膚模型中，注射Saline組膠原纖維層較薄，膠原纖維（藍(lán)色部分）稀疏、松散。注射CM組的皮膚組織膠原纖維層相對(duì)較厚，膠原纖維排列均勻，纖維密度高于Saline組（圖2A）。用Image J對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行量化，CM組膠原纖維面積占總面積的85.06 ± 3.47%，顯著高于Saline組71.85 ± 3.92%（圖2B）。

圖2 注射CM對(duì)UV照射裸鼠模型皮膚組織中膠原纖維和彈力纖維的修復(fù)作用。A，裸鼠皮膚組織Masson三色染色結(jié)果（比例尺，200 μm和20 μm）；B，Masson染色結(jié)果ImageJ量化（n=3，**P＜0.01）；C，裸鼠皮膚組織彈力纖維染色結(jié)果（比例尺，40 μm和20 μm）Fig. 2 The rescuing effects of CM on collagen and elastic fiber in skin tissue of nude mouse model exposed to UV radiation. A, Masson staining results of nude mouse skin tissue (scale bar, 200 μm and 20 μm); B, Image J quantification of Masson staining results (n=3, **P＜0.01); C, elastic fiber staining of nude mouse skin tissue (scale bar, 40 μm and 20 μm)

彈力纖維染色結(jié)果顯示，Saline組彈力纖維（藍(lán)色部分）增粗且稀疏，呈現(xiàn)松散、斷裂的狀態(tài)，幾乎沒(méi)有延續(xù)，斷裂的彈力纖維成點(diǎn)片狀。CM組的皮膚組織彈力纖維則纖細(xì)、連續(xù)，且較Saline組數(shù)量增多（圖2C）。

2 CM促進(jìn)衰老皮膚中的細(xì)胞增殖和血管新生

對(duì)細(xì)胞增殖相關(guān)抗原ki67和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白α-SMA進(jìn)行標(biāo)記，免疫熒光染色結(jié)果顯示（圖3A、B），CM組皮膚組織中Ki-67和α-SMA的熒光強(qiáng)度和陽(yáng)性率均明顯高于Saline組。表明CM有助于提高皮膚組織內(nèi)的細(xì)胞增殖活力和血管生成。

圖3 CM對(duì)裸鼠皮膚組織血管生成和細(xì)胞增殖的影響。免疫熒光染色用于檢測(cè)皮膚組織中α-SMA（A）和Ki-67（B）的表達(dá)；比例尺，20 μmFig. 3 The Effects of CM on angiogenesis and cell proliferation in nude mice skin tissue. Immunofluorescence was used to detect the expression of α-SMA(A) and Ki-67 (B); scale bar, 20 μm

3 CM改善成纖維細(xì)胞衰老表型

成纖維細(xì)胞是皮膚膠原分泌的主要細(xì)胞類型，與皮膚衰老表型密切相關(guān)。ADSC來(lái)源的CM應(yīng)用于H2O2處理的成纖維細(xì)胞，進(jìn)一步觀察CM對(duì)成纖維細(xì)胞衰老表型、膠原分泌及氧化應(yīng)激相關(guān)基因的影響（圖1）。CCK-8法分析顯示，CM組細(xì)胞增殖數(shù)量顯著高于Ctrl組，表明CM具有明顯的促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖的作用（圖4A）。將H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激細(xì)胞模型記為H2O2模型組，H2O2誘導(dǎo)后CM培養(yǎng)的細(xì)胞記為H2O2+CM組，未經(jīng)H2O2誘導(dǎo)正常培養(yǎng)的細(xì)胞記為Ctrl組。與Ctrl組相比，H2O2模型組SA-β-gal陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加（44.90 ± 3.84%）；與H2O2模型組相比，H2O2+CM組的陽(yáng)性細(xì)胞率則顯著下降（21.57 ± 1.60%）（圖4C、D）。由此可見(jiàn)表明H2O2誘導(dǎo)后的成纖維細(xì)胞衰老模型建立成功，且CM可改善H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老表型。

在分子水平上，SIRT1與膠原I及III的比例也與細(xì)胞衰老狀態(tài)密切相關(guān)。與H2O2模型組相比，H2O2+CM組細(xì)胞中SIRT1和COL-1的mRNA相對(duì)水平顯著上調(diào)（圖4B、E），而COL-3的mRNA相對(duì)水平則顯著下調(diào)（圖4E）。

圖4 CM和H2O2對(duì)成纖維細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞增殖和衰老的影響。A，CCK-8法評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖活性；B，SIRT1 mRNA在成纖維細(xì)胞中表達(dá)的qRT-PCR檢測(cè)及定量分析；C和D，成纖維細(xì)胞中SA-β-gal染色的代表性圖像（C）（比例尺，100 μm）及定量分析（D）；E，COL-1和COL-3 mRNA在成纖維細(xì)胞中表達(dá)的qRT-PCR檢測(cè)與定量分析。n=3；**P＜0.01Fig. 4 The effects of CM and H2O2 on cell proliferation and aging in the fibroblast culture. A, the cell proliferation activity was evaluated by CCK-8 assay; B, qRT-PCR detection and quantitative analysis of expression of SIRT1 mRNA in the fibroblasts; C and D, representative images (C)(scale bar, 100 μm) of SA-β-gal staining in fibroblasts and the quantitative analysis (D); E, qRT-PCR detection and quantitative analysis of the mRNA expression of COL-1 and COL-3 in the fibroblasts. n=3; **P＜0.01

4 CM減輕H2O2導(dǎo)致的細(xì)胞氧化應(yīng)激水平

與Ctrl組相比，H2O2模型組ROS水平升高至62.70 ± 2.5%（圖5A、B），表明H2O2的強(qiáng)氧化性能有效誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生ROS，ROS水平的升高與細(xì)胞衰老密切相關(guān)。經(jīng)過(guò)CM培養(yǎng)后細(xì)胞內(nèi)ROS水平下降至21.40 ± 3.24%，顯著低于H2O2模型組（圖5A、B）。

對(duì)細(xì)胞內(nèi)SOD和GSH-PX活性測(cè)定顯示，與Ctrl組相比，H2O2模型組的SOD、GSH-PX水平明顯降低（圖5C、D），表明在H2O2的強(qiáng)氧化性誘導(dǎo)下，細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶活性明顯下降，這與ROS水平結(jié)果相符合。與H2O2模型組相比，H2O2+CM組SOD水平明顯升高（圖5C、D）。由此表明CM能夠降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，提高細(xì)胞抗氧化能力。

圖5 CM對(duì)成纖維細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響。A，成纖維細(xì)胞中ROS含量的DHE熒光探針檢測(cè)（比例尺，20 μm）；B，成纖維細(xì)胞中ROS水平的定量分析；C，成纖維細(xì)胞中SOD含量的定量分析；D，成纖維細(xì)胞中GSH-PX含量的定量分析。n=3；**P＜0.01Fig. 5 Effect of CM on oxidative stress in the fibroblasts. A, detection by DHE fluorescence probe of the content of ROS in the fibroblasts (scale bar, 20 μm); B, quantitative analysis of ROS level in the fibroblasts; C, quantitative analysis of SOD content in the fibroblasts; D, quantitative analysis of GSHPX content in the fibroblasts. n=3; **P＜0.01

討論

構(gòu)建衰老模型的方法主要有H2O2誘導(dǎo)、UV射線誘導(dǎo)、D-半乳糖誘導(dǎo)[13]等，一般外源性老化多采用UV輻射誘導(dǎo)或H2O2誘導(dǎo)衰老模型[14]。本研究采用UV輻照的方法建立皮膚衰老裸鼠模型，模擬人皮膚衰老最主要的誘因；細(xì)胞水平上則采用H2O2干預(yù)的方法，成功建立氧化應(yīng)激細(xì)胞模型。

在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CM促進(jìn)了真皮層中的膠原纖維合成，使膠原密度顯著升高，明顯改善了由于UV輻照導(dǎo)致的彈力纖維增粗、稀疏、松散、斷裂的情況，顯著抑制皮膚衰老的表現(xiàn)。皮膚的衰老伴隨著細(xì)胞增殖能力下降和血供減少，本研究利用KI-67和α-SMA標(biāo)記細(xì)胞，來(lái)反應(yīng)細(xì)胞增生的能力和血管新生情況。結(jié)果顯示CM組皮膚組織的Ki-67和α-SMA的熒光強(qiáng)度以及陽(yáng)性率均顯著升高，表明CM能夠促進(jìn)皮膚組織細(xì)胞增殖，并在一定程度上促進(jìn)血管的新生。

依據(jù)在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本文分別從細(xì)胞增殖、SAβ-gal及氧化應(yīng)激水平3個(gè)方面探索CM在細(xì)胞水平上改善皮膚衰老的機(jī)制。SA-β-gal是檢驗(yàn)細(xì)胞衰老的經(jīng)典標(biāo)志酶之一。本研究證明，CM能夠顯著提高成纖維細(xì)胞的增殖活力，有效降低細(xì)胞衰老的比率。Xiong等人[15]發(fā)現(xiàn)清除人皮膚成纖維細(xì)胞中的ROS能有效促進(jìn)皮膚傷口愈合和延緩衰老。DHE是常用的超氧化物陰離子熒光探針，利用DHE熒光探針對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，可直接反映細(xì)胞內(nèi)ROS水平，本研究檢測(cè)了細(xì)胞中的ROS含量以及存在的重要內(nèi)源性抗氧化酶SOD和GSH-PX的活性。研究結(jié)果證明CM能夠減少細(xì)胞內(nèi)ROS，提高SOD活性，從而降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。

皮膚衰老主要是由于真皮層中細(xì)胞外基質(zhì)的改變，當(dāng)皮膚老化時(shí)，真皮層中膠原蛋白和彈性蛋白合成減少、分解增加，COL-1和COL-3比值在衰老過(guò)程中逐漸倒置，膠原逐漸變粗、出現(xiàn)異常交鏈，同時(shí)彈力纖維出現(xiàn)排列紊亂及碎片化現(xiàn)象[16]。成纖維細(xì)胞主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)、膠原蛋白產(chǎn)生和傷口愈合，成纖維細(xì)胞在衰老過(guò)程中COL-1表達(dá)減少，與衰老、凋亡相關(guān)的基因表達(dá)增加，SIRT1基因則通過(guò)使底物蛋白的去乙?；{(diào)控細(xì)胞凋亡和衰老。因此本研究以成纖維細(xì)胞為對(duì)象，從在分子水平上探究SIRT1、COL-1、COL-3與細(xì)胞衰老之間的關(guān)系。本研究表明，CM能夠上調(diào)SIRT1和COL-1 mRNA的表達(dá)，降低COL-3 mRNA的相對(duì)水平，從而促進(jìn)膠原合成，減輕氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷，改善細(xì)胞衰老。

綜上，可以認(rèn)為來(lái)源于ADSCs的CM通過(guò)降低皮膚細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，提高細(xì)胞增殖能力，上調(diào)了SIRT1和COL-1基因表達(dá)水平，從而促進(jìn)成纖維細(xì)胞對(duì)膠原的合成，改善皮膚衰老表型。