阿司匹林調(diào)節(jié)miR-340-5p/HMGB1/TLR4 通路對(duì)大鼠心肌缺血/再灌注損傷的影響

陳興華，張繼倬，韓 露（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院心臟外科，北京 100038；.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心，北京 10000）

心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷是臨床常見疾病。有學(xué)者認(rèn)為，I/R損傷在冠狀動(dòng)脈血流、心肌缺血恢復(fù)和心肌梗死面積縮小等過程中難以避免[1]。近年來，隨著各種心臟介入治療技術(shù)的廣泛應(yīng)用，心血管疾病患者的治愈率雖有較大提高，但由此產(chǎn)生的I/R損傷也日益增多[2]。

有研究指出，微RNA（microRNA，miRNA）可作用于心肌I/R損傷，已成為相關(guān)研究的重要靶點(diǎn)，如通過提高miRNA-340-5p（miR-340-5p）表達(dá)來改善小鼠心功能和心肌病變，抑制心肌酶活性、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，減少細(xì)胞凋亡，進(jìn)而緩解I/R 損傷[3]。結(jié)合上述研究，本課題組借助生物學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，高遷移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）可 能 是miR-340-5p 的 靶點(diǎn)[4]。既往研究表明，HMGB1是一種普遍存在且含量豐富的核蛋白，在多種心血管疾病中均有關(guān)鍵作用[5]；此外，HMGB1 被鑒定為內(nèi)源性Toll 樣受體4（Toll-like receptors 4，TLR4）的配體，下調(diào)HMGB1/TLR4 信號(hào)通路可有效減輕I/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷[6]。由此本課題組推測(cè)，miR-340-5p 緩解I/R 損傷可能與下調(diào)HMGB1/TLR4信號(hào)通路有關(guān)。

阿司匹林（aspirin，Asp）是心血管疾病二級(jí)預(yù)防的主要藥物，可參與調(diào)控HMGB1、TLR4等蛋白的表達(dá)，并可通過減輕心肌I/R 損傷來發(fā)揮心臟保護(hù)作用[7-9]。然而，Asp在心肌I/R損傷中的調(diào)控機(jī)制尚不明確，其干預(yù)作用是否與miR-340-5p/HMGB1/TLR4信號(hào)通路有關(guān)仍不清楚。為此，本研究通過構(gòu)建大鼠I/R 模型來深入探究Asp 對(duì)心肌I/R 損傷的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制，以期為臨床心肌I/R損傷的治療提供新的參考依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

ALC-V8S 型動(dòng)物呼吸機(jī)購(gòu)自上海奧爾科特生物科技有限公司；MedLab-U/4C501H型生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)購(gòu)自南京美易科技有限公司；Multiskan FC型酶標(biāo)儀、BB15 型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；7500 型定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcriptase-mediated PCR，qRT-PCR）儀購(gòu)自美國(guó)ABI 公司；Quantity One 型凝膠成像系統(tǒng)、1658033 型凝膠電泳系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；CKX53型光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；ZHS1220型相機(jī)購(gòu)自日本Cannon 公司；DU800 型紫外分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司。

1.2 主要藥品與試劑

Asp對(duì)照品（批號(hào)A1189，純度≥98.0%）購(gòu)自北京康瑞納生物科技有限公司；miR-340-5p 抑制物（in-miR-340-5p）、過表達(dá)HMGB1、過表達(dá)miR-340-5p 及其陰性對(duì)照（miR-NC）均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；腺病毒表達(dá)載體pacAd5 CMV-GFP購(gòu)自北京華越洋生物科技有限公司；熒光素酶pmirGLO 載體（批號(hào)GN1439）購(gòu)自上海蓋寧生物科技公司；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑（批號(hào)11668019）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（批號(hào)RL008）、肌酸激酶同工酶MB（creatine kinase isoenzyme-MB，CK-MB）ELISA試劑盒（批號(hào)RC044）均購(gòu)自上海歌凡生物科技有限公司；心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cardiac troponin Ⅰ，cTnⅠ）ELISA試劑盒（批號(hào)orb158935）購(gòu)自英國(guó)Biobyt 公司；髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）試劑盒（比色法，批號(hào)AO44-1-1）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（WST-1 法，批號(hào)A001-3-1）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒（比色法，批號(hào)A005-1-1）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（TBA法，批號(hào)A003-1-1）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（批號(hào)AG1120）、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)AT2190）均購(gòu)自上海吉至生化科技有限公司；TTC 染液（批號(hào)YT8072）、Triton X-100試劑（批號(hào)SY5134）均購(gòu)自北京伊塔生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)YST0010）購(gòu)自桂林金優(yōu)勝特貿(mào)易有限公司；SYBR Premix Ex Taq 試劑盒（批號(hào)DRR041A）購(gòu)自日本TAKARA 公司；高效RIPA 組織/細(xì)胞快速裂解液（批號(hào)R0010）、Trizol 試劑盒（批號(hào)15596-018）、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（批號(hào)D0010）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；兔HMGB1 多克隆抗體（批號(hào)ab18256）、兔TLR4 多克隆抗體（批號(hào)ab218987）、兔β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）多克隆抗體（批號(hào)ab5694）、兔辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG 二抗（批號(hào)ab205718）均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號(hào)P0018S）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司；其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠100 只，體質(zhì)量為200～250 g，由中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（滬）2020-0005。大鼠心肌細(xì)胞H9C2購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，批號(hào)為ZB031。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

所有大鼠均被飼養(yǎng)于（25±1）℃、12 h/12 h 光照/黑暗交替的恒溫空調(diào)房?jī)?nèi)，自由進(jìn)食，飲水。1 周后，將大鼠分為假手術(shù)（Sham）組、I/R 組、Asp 預(yù)處理（I/R+Asp）組、I/R+Asp+in-miR-340-5p 組 和I/R+Asp+HMGB1 組，每組20 只。Sham 組大鼠開胸后不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，其余各組大鼠按下法建立模型：經(jīng)2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后以仰臥位固定，插入氣管導(dǎo)管并連接呼吸機(jī)；分離大鼠右頸動(dòng)脈，插入動(dòng)脈插管并連接到生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)；切開大鼠胸部，沿胸骨左側(cè)切開，分離心包，暴露心臟，用5/0絲線于左冠狀動(dòng)脈前降支底部結(jié)扎，結(jié)扎時(shí)放入特制線栓，以左室前壁發(fā)紺和ST 段抬高為缺血成功的標(biāo)志；缺血30 min后拔去線栓再灌注2 h，若上述變化消失，說明再灌注成功[10]。Sham組、I/R組和I/R+Asp 組大鼠在缺血前48 h 分別灌胃生理鹽水；I/R+Asp+in-miR-340-5p 組和I/R+Asp+HMGB1 組大鼠在缺血前48 h 分別轉(zhuǎn)染in-miR-340-5p 或過表達(dá)HMGB1（即分別尾靜脈注射含有in-miR-340-5p 或過表達(dá)HMGB1 的腺病毒，以miR-340-5p 或HMGB1 的表達(dá)情況判定是否轉(zhuǎn)染成功）。各藥物組大鼠在造模前7 d 灌胃Asp 200 mg/（kg·d）[以生理鹽水為溶劑，分2 次，連續(xù)7 d]，Sham組、I/R 組平行灌胃等體積生理鹽水[8-9]。上述過程均經(jīng)過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，嚴(yán)格參照相關(guān)規(guī)范要求操作[11]。

2.2 血液和心肌組織標(biāo)本采集

再灌注2 h 后，以2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，從心臟采集血液樣本并分離血清。隨后，斷頸處死大鼠，剖取心臟，用濾紙吸干，稱定質(zhì)量，沿左心室長(zhǎng)軸采集心肌組織，每組隨機(jī)選取5只大鼠的心肌組織用10%中性甲醛溶液固定，用于病理觀察和細(xì)胞凋亡檢測(cè)；其余15只大鼠的心肌組織于-80 ℃凍存，用于炎癥及氧化應(yīng)激指標(biāo)（5 只）、心肌梗死面積（5 只）和miR-340-5p、HMGB1、TLR4表達(dá)（5只）的檢測(cè)。

2.3 血清心肌損傷指標(biāo)檢測(cè)

取“2.2”項(xiàng)下各組大鼠血清樣本適量，采用ELISA法以酶標(biāo)儀檢測(cè)其血清LDH、CK-MB、cTnⅠ水平，嚴(yán)格按照各試劑盒說明書操作。

2.4 心肌組織中炎癥和氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)

取“2.2”項(xiàng)下凍存的各組大鼠心肌組織適量，經(jīng)勻漿、離心后，取上清液，按試劑盒方法以酶標(biāo)儀檢測(cè)心肌組織中MPO、SOD、GSH-Px、MDA 水平，嚴(yán)格按照各試劑盒說明書操作。

2.5 心肌組織病理觀察

取“2.2”項(xiàng)下固定的各組大鼠心肌組織適量，用石蠟包埋后切片（厚度5μm），經(jīng)脫蠟、水化后，行HE染色并置于光學(xué)顯微鏡下觀察其病理改變。

2.6 心肌梗死面積檢測(cè)

取“2.2”項(xiàng)下凍存的各組大鼠心肌組織適量，切成5個(gè)切片（厚度3 mm），放入培養(yǎng)皿中，在37 ℃培養(yǎng)箱中溫育10～15 min 后用1%TTC 試劑染色（缺血性心肌組織可被染成紅色，而梗死區(qū)域仍為灰白色）。用相機(jī)拍照并采用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算心肌梗死面積：心肌梗死面積＝5 個(gè)切片梗死面積之和/整個(gè)心臟面積×100%。

2.7 心肌細(xì)胞凋亡情況檢測(cè)

采用TUNEL 法進(jìn)行檢測(cè)。取“2.5”項(xiàng)下切片，依次置于二甲苯中脫蠟、乙醇中水合，通過0.1%Triton X-100試劑滲透后，再使用3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。將切片置于TUNEL 反應(yīng)混合物50μL 中，于37 ℃下孵育1 h，以DAB法顯色后，使用Image J 1.8.0軟件計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)：細(xì)胞凋亡指數(shù)＝凋亡陽(yáng)性細(xì)胞（呈棕色）/細(xì)胞總數(shù)（呈藍(lán)色）×100%。

2.8 心肌組織中miR-340-5p表達(dá)情況檢測(cè)

采用qRT-PCR 法進(jìn)行檢測(cè)。取“2.2”項(xiàng)下凍存的各組大鼠心肌組織適量，勻漿，用Trizol 試劑盒提取總RNA。檢測(cè)總RNA純度、濃度和完整度后，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒以U6作為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（共20μL）包括：上、下游引物各0.4μL，2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL，cDNA 模板1 μL，用ddH2O 補(bǔ)足20μL。反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性20 s，57 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，共37 個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCt法計(jì)算待測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量（以Sham 組為參照）。miR-340-5p上游引物為5′-GCGGTTATAAAGCAATGAGA-3′，下游引物為5′-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3′；內(nèi)參上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTTCACGAATTTGCGT-3′。

2.9 心肌組織中HMGB1、TLR4蛋白表達(dá)情況檢測(cè)

采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。取“2.2”項(xiàng)下凍存的各組大鼠心肌組織適量，經(jīng)裂解液500μL 裂解后，于冰浴中勻漿，離心取上清液。將所獲蛋白與上樣緩沖液混合，于95 ℃下煮沸15 min變性。取變性蛋白，行電泳分離并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，以5%脫脂牛奶封閉，加入HMGB1、TLR4、β-actin 一抗（稀釋比例均為1∶1 000），4 ℃下孵育過夜；洗膜，加入相應(yīng)二抗（稀釋比例為1∶5 000），37 ℃下孵育1 h，經(jīng)ECL 顯影后，使用凝膠成像系統(tǒng)成像并計(jì)算待測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)量：待測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)量＝待測(cè)蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

2.10 miR-340-5p與HMGB1靶向關(guān)系的驗(yàn)證

體外常規(guī)培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞用于驗(yàn)證miR-340-5p與HMGB1 之間的靶向關(guān)系。采用Targetscan 軟件預(yù)測(cè)miR-340-5p 與HMGB1 的結(jié)合位點(diǎn)，隨后將含有預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)的HMGB1 野生型（HMGB1 WT）或突變型（HMGB1 MUT）的3′-非 翻 譯 區(qū)（3′-untranslated regions，3′-UTR）片段克隆在熒光素酶pmirGLO 載體上，經(jīng)DNA 測(cè)序驗(yàn)證后，按照Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書操作，將HMGB1 WT 或HMGB1 MUT 與miR-340-5p（miR-340-5p 組）或miR-NC（miR-NC 組）共同轉(zhuǎn)染至H9C2心肌細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后取出，使用酶標(biāo)儀對(duì)熒光素酶活性進(jìn)行測(cè)定，并采用Western blot 法檢測(cè)單獨(dú)轉(zhuǎn)染過表達(dá)miR-340-5p或miR-NC后H9C2心肌細(xì)胞中HMGB1蛋白的相對(duì)表達(dá)量（具體操作同“2.9”項(xiàng)），實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；成對(duì)比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 Asp 對(duì)I/R 模型大鼠心肌損傷、炎癥和氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

與Sham 組比較，I/R 組大鼠血清中LDH、CK-MB、cTnⅠ水平和心肌組織中MPO、MDA 水平均顯著升高，心肌組織中SOD、GSH-Px 水平均顯著降低（P＜0.05）；與I/R組比較，I/R+Asp組大鼠上述指標(biāo)均顯著改善（P＜0.05）。與I/R+Asp 組比較，I/R+Asp+in-miR-340-5p 組、I/R+Asp+HMGB1組大鼠血清中LDH、CK-MB、cTnⅠ水平和心肌組織中MPO、MDA水平均顯著升高，而心肌組織中SOD、GSH-Px水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表1、表2。

表1 各組大鼠血清心肌損傷指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝20）

表1 各組大鼠血清心肌損傷指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝20）

a：與Sham組比較，P＜0.05；b：與I/R組比較，P＜0.05；c：與I/R+Asp組比較，P＜0.05

組別Sham組I/R組I/R+Asp組I/R+Asp+in-miR-340-5p組I/R+Asp+HMGB1組LDH/（U/L）215.36±18.56 854.16±76.32a 368.29±24.33b 489.36±30.08c 518.69±32.55c CK-MB/（U/L）114.35±10.54 325.69±23.25a 186.65±12.36b 247.33±15.20c 268.39±18.30c cTnⅠ/（ng/mL）1.25±0.18 5.29±0.59a 2.45±0.22b 3.12±0.32c 3.45±0.35c

表2 各組大鼠心肌組織中炎癥和氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝5）

表2 各組大鼠心肌組織中炎癥和氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝5）

a：與Sham組比較，P＜0.05；b：與I/R組比較，P＜0.05；c：與I/R+Asp組比較，P＜0.05

組別Sham組I/R組I/R+Asp組I/R+Asp+in-miR-340-5p組I/R+Asp+HMGB1組MPO/（U/g）5.26±0.45 19.35±1.58a 9.26±0.87b 12.23±1.05c 14.36±1.10c SOD/（U/mg）162.36±12.65 68.69±7.54a 130.12±10.02b 89.26±7.65c 95.23±8.52c GSH-Px/（U/mg）29.65±2.08 10.02±1.10a 23.63±1.25b 16.26±1.20c 18.32±1.30c MDA/（mmol/mg）4.69±0.37 12.54±1.26a 7.25±0.59b 9.13±0.15c 10.26±1.05c

3.2 Asp 對(duì)I/R 模型大鼠心肌病理改變和梗死面積的影響

HE染色結(jié)果顯示，Sham組大鼠心肌細(xì)胞未見任何病理改變；I/R 組大鼠心肌纖維斷裂，細(xì)胞腫脹，細(xì)胞核不規(guī)則且固縮，并可見大量壞死細(xì)胞和炎癥細(xì)胞。用Asp 預(yù)處理后，I/R+Asp 組大鼠的上述病理改變有所好轉(zhuǎn)；而在轉(zhuǎn)染in-miR-340-5p或過表達(dá)HMGB1后，Asp對(duì)I/R 損傷心肌細(xì)胞的上述保護(hù)作用被削弱。結(jié)果見圖1。

經(jīng)TTC染色證實(shí)，與Sham組[（0.56±0.04）%]比較，I/R 組大鼠心肌梗死面積[（25.69±2.58）%]顯著增大（P＜0.05）；與I/R組比較，I/R+Asp組大鼠心肌梗死面積[（9.23±0.86）%]顯著縮?。≒＜0.05）；與I/R+Asp 組比較，I/R+Asp+in-miR-340-5p組、I/R+Asp+HMGB1組大鼠心肌梗死面積[（15.69±1.23）%、（17.03±1.36）%]均顯著增大（P＜0.05）。結(jié)果見圖2。

圖1 各組大鼠心肌病理改變的顯微圖（HE染色）

圖2 各組大鼠心肌梗死面積的變化情況（TTC染色）

3.3 Asp對(duì)I/R模型大鼠心肌組織中細(xì)胞凋亡的影響

與Sham 組（3.25±0.32）比較，I/R 組大鼠心肌組織中細(xì)胞的凋亡指數(shù)（28.36±2.15）顯著增高（P＜0.05）；與I/R組比較，I/R+Asp組大鼠心肌組織中細(xì)胞的凋亡指數(shù)（9.26±0.57）顯著降低（P＜0.05）；與I/R+Asp組比較，I/R+Asp+in-miR-340-5p 組、I/R+Asp+HMGB1 組大鼠心肌組織中細(xì)胞的凋亡指數(shù)（15.56±1.02、17.21±1.14）均顯著增高（P＜0.05）。結(jié)果見圖3。

3.4 Asp 對(duì)I/R 模型大鼠心肌組織中miR-340-5p/HMGB1/TLR4信號(hào)通路的影響

與Sham組比較，I/R組大鼠心肌組織中miR-340-5p的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，HMGB1、TLR4 蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05）；與I/R組比較，I/R+Asp組大鼠心肌組織中miR-340-5p 的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，HMGB1、TLR4 蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05）；與I/R+Asp 組比較，I/R+Asp+in-miR-340-5p 組、I/R+Asp+HMGB1組大鼠心肌組織中miR-340-5p的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，HMGB1、TLR4 蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖4。

圖3 各組大鼠心肌組織中細(xì)胞凋亡情況的顯微圖（TUNEL法）

圖4 各組大鼠心肌組織中miR-340-5p 和HMGB1、TLR4蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝5）

3.5 miR-340-5p與HMGB1的靶向關(guān)系

miR-340-5p 與HMGB1 的3′-UTR 區(qū)（位 點(diǎn)1364-1371）存在互補(bǔ)配對(duì)區(qū)，故推測(cè)HMGB1可能是miR-340-5p 的靶點(diǎn)。熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果（圖5A）顯示，在轉(zhuǎn)染miR-340-5p 后，HMGB1 WT 的相對(duì)熒光素酶活性受到顯著抑制（P＜0.05）。此外，HMGB1蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果（圖5B）顯示，轉(zhuǎn)染miR-340-5p可顯著降低HMGB1蛋白的相對(duì)表達(dá)量（P＜0.05）。

圖5 miR-340-5p和HMGB1的靶向關(guān)系（±s，n＝5）

4 討論

臨床研究表明，心肌梗死是患者心血管疾病發(fā)生和死亡的主要原因，而恢復(fù)心臟的血液供應(yīng)被認(rèn)為是心肌梗死最有效的治療手段[12]。然而，再灌注本身會(huì)使心肌損傷進(jìn)一步惡化，這種現(xiàn)象被稱為心肌I/R 損傷[13]。目前，心肌I/R損傷缺乏相應(yīng)的治療靶點(diǎn)，故尋找有效靶點(diǎn)十分必要。

研究表明，心肌細(xì)胞內(nèi)氧自由基大量產(chǎn)生、細(xì)胞黏附分子改變、鈣離子超載、心肌能量代謝障礙、細(xì)胞凋亡等都與心肌I/R 損傷相關(guān)，這些機(jī)制的相互關(guān)聯(lián)構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，相互制約、平衡[14-15]。Asp屬于非甾體抗炎藥，其導(dǎo)致閉塞性心血管事件發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)低于傳統(tǒng)的非甾體抗炎藥，且可通過減輕炎癥反應(yīng)和線粒體氧化損傷、減少心肌細(xì)胞凋亡來改善心肌I/R 損傷[8-9]。為了探索Asp 在心肌I/R 損傷保護(hù)中的具體機(jī)制，本研究檢測(cè)了各組大鼠血清中心肌損傷指標(biāo)以及心肌組織中炎癥和氧化應(yīng)激指標(biāo)水平。結(jié)果表明，Asp 能通過抑制LDH、CK-MB、cTnⅠ的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而發(fā)揮對(duì)I/R損傷的保護(hù)作用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，Asp 可明顯改善I/R 引起的心肌組織病理?yè)p傷，并可縮小心肌梗死面積，抑制心肌組織中的細(xì)胞凋亡，與已有研究基本相似[8]。

miR-340-5p 定位于人5 號(hào)染色體長(zhǎng)臂5q35.3，可通過靶向c-Met、FHL2、ROCK1、SKP2等多種癌基因來參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[16]；可通過上調(diào)髓細(xì)胞性白血病1的表達(dá)來減少氧化損傷和細(xì)胞凋亡，從而改善糖尿病性心肌功能障礙[17]；除此之外，miR-340-5p 表達(dá)的上調(diào)還可有效緩解小鼠的心肌I/R 損傷[5]。本研究結(jié)果顯示，Asp預(yù)處理可顯著上調(diào)模型大鼠心肌組織中miR-340-5p的表達(dá)，而抑制miR-340-5p的表達(dá)則可逆轉(zhuǎn)Asp對(duì)大鼠心肌I/R損傷的保護(hù)作用。由此筆者推測(cè)，Asp可能通過上調(diào)miR-340-5p 的表達(dá)來發(fā)揮心肌保護(hù)作用。有研究指出，成熟的miRNA與其靶mRNA的3′-UTR序列配對(duì)結(jié)合后，可被整合到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體中，從而導(dǎo)致靶mRNA 降解[18]。本課題前期研究證實(shí)，HMGB1 編碼基因是miR-340-5p的靶基因，且過表達(dá)的miR-340-5p可顯著降低HMGB1 蛋白的表達(dá)[4]。結(jié)合本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-340-5p介導(dǎo)的HMGB1通路在Asp保護(hù)心肌I/R損傷中發(fā)揮了作用。據(jù)報(bào)道，HMGB1 已被鑒定為內(nèi)源性TLR4 配體，可通過與髓樣分化蛋白2 結(jié)合來激活TLR4[19]。有研究指出，抑制HMGB1/TLR4 信號(hào)通路可抑制心肌細(xì)胞凋亡、自噬和炎癥反應(yīng)等，可見該通路可能與改善缺血性心肌損傷有關(guān)[6]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)Asp預(yù)處理后，HMGB1、TLR4蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，而HMGB1過表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)Asp對(duì)心肌I/R損傷的改善作用，提示HMGB1/TLR4 信號(hào)通路可能參與了Asp 的I/R 損傷保護(hù)機(jī)制。miR-340-5p 與HMGB1 的 靶向關(guān)系分析結(jié)果顯示，miR-340-5p 可靶向負(fù)調(diào)控HMGB1的表達(dá)。

綜上所述，Asp 可通過調(diào)節(jié)miR-340-5p/HMGB1/TLR4 通路來減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，減少心肌組織中的細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)心肌I/R 損傷的保護(hù)作用。然而，Asp 的主要作用靶點(diǎn)為環(huán)氧合酶1/2 和前列腺素E2，上述靶點(diǎn)是否與miR-340-5p/HMGB1/TLR4 信號(hào)通路關(guān)聯(lián)尚有待探究；此外，本研究并未單獨(dú)設(shè)置不受藥物干預(yù)的miR-340-5p、HMGB1 過表達(dá)組，加之心肌I/R損傷調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，故Asp的具體機(jī)制和其他途徑仍有待進(jìn)一步論證。