基于咖啡堿和氨基酸中碳氮穩(wěn)定同位素比率的茶葉地理溯源

劉洪林，張 凱，黎 嬌，李 照，楊天來，王 強

（1.重慶第二師范學院 脂質(zhì)資源利用及兒童日化品研發(fā)重點實驗室，重慶 400067；2.重慶第二師范學院旅游與服務管理學院，重慶 400067；3.重慶市農(nóng)業(yè)技術推廣總站，重慶 401121；4.重慶市規(guī)劃和自然資源調(diào)查監(jiān)測院，重慶 400014；5.西南大學食品科學學院，重慶 400715）

地理標志（geographical indication，GI）產(chǎn)品，是指在特定地區(qū)生產(chǎn)的，其質(zhì)量、聲譽或其他特性在本質(zhì)上取決于該生產(chǎn)地的自然因素和人文因素，經(jīng)審核批準以地理名稱進行命名的產(chǎn)品。農(nóng)民或制造商已引入GI保護農(nóng)產(chǎn)品或食品，消費者認為GI產(chǎn)品具有優(yōu)質(zhì)的質(zhì)量和特色，茶葉更是如此。中國名茶通常是受GI保護的產(chǎn)品，如西湖龍井、永川秀芽等，根據(jù)產(chǎn)地而命名。永川秀芽是典型的針狀綠茶。雖然秀芽的定義有很多種，但正宗的永川秀芽必須產(chǎn)自中國重慶的永川。然而，對于消費者來說，永川秀芽與其他針狀綠茶產(chǎn)品（如與其他非GI針狀綠茶產(chǎn)品）具有相同的外形，很難區(qū)分。在市場上，人們常把永川秀芽與萬州、秀山、江津、榮昌、宜賓等相近地區(qū)產(chǎn)的采用永川秀芽工藝加工而成的針型茶葉產(chǎn)品混淆。因此，有必要建立一種可靠的鑒別真品永川秀芽的方法，以保護利益相關者和消費者的利益。

穩(wěn)定同位素技術適合用于茶葉地理溯源研究，因為不同元素的同位素組成提供了關于茶葉來源的充分信息。近年來，穩(wěn)定同位素比值分析在茶葉地理溯源中得到了廣泛的應用。天然有機質(zhì)或組織中的同位素豐度不足以作為研究生物系統(tǒng)的生理特性、生物合成機制和營養(yǎng)來源的基礎。事實上，代謝中的同位素效應導致代謝產(chǎn)物中H、O、C和N的同位素分布不均勻。因此，特異性化合物同位素比值分析（compounds specific isotope ratio analysis，CSIA）對于穩(wěn)定同位素的生物和醫(yī)學應用至關重要。CSIA不僅是鑒別茶葉來源的有效方法之一，也是了解茶樹代謝的有效方法之一?？Х葔A是存在于咖啡（）或茶（）等一些植物的種子、葉子和根部的主要生物堿。通過多元素穩(wěn)定同位素分析，咖啡堿已被用作咖啡豆地理來源的指示物。雖然通過咖啡堿分析茶的地理來源的初步研究早在20多年前就有報道，但進一步的應用和研究還沒有進行，可能是因為獲得足夠數(shù)量的純咖啡因進行穩(wěn)定同位素分析需要很長時間。氨基酸（如組氨酸和苯丙氨酸）的C和N特征可用于區(qū)分不同植物種類對有效氮源的獲取。氨基酸是植物（如茶）中占主導地位的低分子質(zhì)量的含氮生物分子，這些化合物合成過程中的同位素分餾模式記錄了植物生長環(huán)境的一系列信息，如植物在土壤中有效氮的形式。然而，對茶葉中咖啡堿和氨基酸中C和N特征分析還鮮有研究，本研究將探討特征分析和地理溯源的可行性，為茶葉研究開辟新思路。

咖啡堿和氨基酸C 和N 通常由元素分析同位素比值質(zhì)譜（elemental analysis isotope ratio mass spectrometry，EA-IRMS）測定。但是，該方法需要大量的高純度咖啡堿進行測定，并且咖啡堿的提取和純化費力且耗時。此外，在EA-IRMS測定之前的咖啡因提取/純化過程中，咖啡堿的C和N可能會受到非定量恢復的影響。因此，提出一種利用氣相色譜-燃燒-同位素比值質(zhì)譜（gas chromatography combustion isotope ratio mass spectrometry，GC-C-IRMS）測定茶葉中咖啡堿和氨基酸C和N的分析方法。

本研究探討利用咖啡堿和衍生氨基的氮和碳穩(wěn)定同位素比值分析永川秀芽地理溯源的可行性。為了獲得準確的C和N值，研究相關的潛在誤差來源。利用GCC-IRMS測定不同產(chǎn)地的秀芽中咖啡堿和6 種主要游離態(tài)氨基酸的C和N特征，分析差異性及相關性，建立化學計量學模型，篩選出重要化學標記，以期為構建快速、可靠的茶葉地理溯源提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采集來自重慶、四川等6 個不同地區(qū)的72 個秀芽茶葉樣品（表1）。為了避免茶葉嫩度和季節(jié)變化的影響，所有茶葉于2019年3月采集，一芽一葉。采集含水率（約為5%）相同的茶葉樣品，在40 ℃下冷凍保存。此外，再從這些地方隨機采集36 個樣品進行模型驗證（不用于模型練習），只有一個序列號是盲樣品處理。

表1 不同產(chǎn)地秀芽采樣信息Table 1 Information about the geographical origin of Xiuya tea

氯仿（純度99.0%）、氫氧化鈉（純度96.0%）、純商用咖啡堿試劑（純度98.0%） 日本和光純藥工業(yè)株式會社；無水硫酸鈉 日本東京關東化學株式會社；IAEA-CH-7（純度98.5%）、IAEA-600咖啡堿（純度98.5%）、-谷氨酸標準品（純度98.0%）、NBS-22燃料油、IAEA-CH-6蔗糖（純度99.0%）、IAEA-NO硝酸鉀（純度98.0%） 北京博研科創(chuàng)生物技術有限公司；USGS 40-氨基酸標準品（丙氨酸、茶氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸和絲氨酸）（純度98%）、Amberlite IR120陽離子交換樹脂（氫型）北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司；乙腈衍生輔助試劑、-叔丁基二甲基甲硅烷基--甲基三氟乙酰胺（--butyldimethylsilyl--methyltrifluoroacetamide，MTBSTFA）衍生試劑、二氯甲烷（純度99.8%）、異丙醇（純度99.5%）、丙酮（純度95.0%）、乙酸乙酯（純度99%）、三乙胺（純度99.5%）、醋酸酐（純度98%）上海吉至生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

X-620型TP型勻漿器、ALC PK 131R離心機、GC IsoLink II+ConFlo IVIRMS、ISQ 7610單四極桿GC-MS、Delta V Advantage同位素比值質(zhì)譜儀 美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

分別稱取0.1 g所有茶樣，加入5 mL超純水，沸水浴中浸提5 min，置于冷凍離心機中4 000 r/min離心10 min。將提取液用于咖啡堿中C和N、氨基酸中C和N的GC-C-IRMS測定。

1.3.2 咖啡堿的碳氮穩(wěn)定同位素比率測定

1.3.2.1 咖啡堿標準品中C和N的測定

采用EA-IRMS法測定商業(yè)咖啡堿和IAEA-600咖啡堿的C和N。根據(jù)下式計算同位素比率：

式中：為E元素較重同位素的質(zhì)量數(shù)；為樣品各自的同位素比率；為相關的國際公認參考物質(zhì)比率。

1.3.2.2 樣品前處理

精密量取茶樣提取液1 mL，置于10 mL離心管中，加氯化鈉飽和，搖勻。加2.5 mL乙腈，渦旋混勻1 min，超聲10 min，2 500 r/min離心2 min。用吸管吸取上清液于10 mL容量瓶中，分別用2.5 mL乙腈提取殘渣2 次，合并有機層，定容至刻度，加少量無水硫酸鎂和少量中性氧化鋁粉末，搖勻。靜置后取1 μL供GC-C-IRMS進樣分析。

1.3.2.3 GC-C-IRMS測定茶葉樣品中咖啡堿的碳氮穩(wěn)定同位素比率

GC條件：HP-1毛細管色譜柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持2 min；以10 ℃/min升溫至300 ℃，保持6 min；進樣口溫度200 ℃；不分流進樣；載氣為氦氣；柱流速1 mL/min。

IRMS條件：元素分析儀高溫燃燒爐溫度設置為1 030 ℃，載氣為氦氣，流量為230 mL/min，氦反沖從第0秒開始，一直持續(xù)至第700秒，并在第1 990秒重新開始，直到分析結束。在第30、80、130、170、1 930、1 970秒引入6 組參考氣體（CO）。在這些條件下，咖啡堿的保留時間約為1 200 s。

1.3.3 氨基酸的碳氮穩(wěn)定同位素比率測定

1.3.3.1 非衍生氨基酸標準品中C和N的測定

利用EA-IRMS測定非衍生的單一氨基酸的C和N。對-谷氨酸標準品、NBS-22燃料油和IAEACH-6蔗糖進行了C計算，同時也對-谷氨酸和IAEANO硝酸鉀進行了N計算。

1.3.3.2 氨基酸衍生條件

吸取一定體積的氨基酸標準品（10～100 μL，含10～100 nmol氨基酸）放入2 mL自動進樣瓶中，加入40 nmol的正纈氨酸作為內(nèi)標，置于氮吹儀中，室溫下吹干。分別加入40～100 μL乙腈衍生輔助試劑、40～100 μL MTBSTFA衍生試劑（MTBSTFA與乙腈的體積比為1∶1），加入的體積依據(jù)不同的氨基酸體積而定，110 ℃衍生30 min，反應完成后冷卻至室溫，待用。

1.3.3.3 GC-C-IRMS測定茶葉樣品中氨基酸的碳氮穩(wěn)定同位素比率

用GC-C-IRMS測定茶葉中7 個氨基酸（丙氨酸、茶氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸和絲氨酸）的同位素值。使用Trace GC Ultra與IRMS通過開放分流界面進行單體氨基酸同位素分析，并使用單四極GC-MS鑒定化合物。

N分析時GC條件：HP-INNOWAX毛細管色譜柱（60 m×0.32 mm，0.25 μm）；不分流進樣；進樣量0.8～1.0 μL；載氣為氦氣；柱流速1.4 mL/min；進樣口溫度250 ℃。升溫程序：起始溫度為40 ℃，保持2 min；以40 ℃/min升溫至14 ℃；2.5 ℃/min升溫至180 ℃；6 ℃/min升溫至220 ℃；最后以40 ℃/min速度升溫至250 ℃，保持15 min。

C 分析時GC 條件：ZB-FFAP 毛細管色譜柱（30m×0.25 mm，0.25 μm）；分流進樣；進樣量1.0 μL；柱流速1.0 mL/min；進樣口溫度250 ℃；GC柱溫程序：起始溫度40 ℃，保持1 min；以15 ℃/min升溫至120 ℃；3 ℃/min升溫至190 ℃；5 ℃/min升溫至250 ℃，保持7 min。

IRMS條件：元素分析儀高溫燃燒爐溫度設置為1 030 ℃，載氣為氦氣，流量為230 mL/min。用Nafion膜組成的疏水閥除去水蒸氣。對N進行分析時，在燃燒氧化反應器后加入液氮捕集器以從氧化和還原分析物中去除CO。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS v23.0軟件進行單因素方差分析、線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）和BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡（back propagation artificial neural network，BP-ANN）。使用SIMCA v13.0軟件進行層次聚類分析（hierarchical clustering analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）。在進行PCA、HCA、LDA、PLS-DA和BPANN應用之前，所有變量都進行了自動縮放。

2 結果與分析

2.1 方法學驗證

2.1.1 GC-C-IRMS測定咖啡堿C和N值方法學驗證

將EA-IRMS測得的商用咖啡堿C和N值與GC-C-IRMS方法測得的C和N值進行比較，進行GC-C-IRMS的適用性考察。結果表明GC-C-IRMS與IRMS測定的咖啡堿C和N精度分別為0.15%、0.18%和0.13%、0.12%。其結果在相同精度范圍內(nèi)，且兩種方法的相對標準偏差相似，均小于0.2%。因此，除了實驗部分所描述的標準化之外，GC-C-IRMS無需任何校正因子即可使用。利用1.3.2節(jié)方法重復分析商用咖啡堿3 次，進行GC-C-IRMS的準確性考察，GC-C-IRMS測定的咖啡堿N的平均標準偏差為±0.15‰，C為±0.5‰。利用1.3.2節(jié)方法對永川秀芽樣品重復提取10 次并測定其咖啡堿C和N值，考察GC-C-IRMS測定過程的不確定度。結果表明咖啡堿N的標準偏差為±0.1‰；C為±1.0‰。

2.1.2 GC-C-IRMS測定氨基酸C和N值方法學驗證

將GC-C-IRMS測得的標準氨基酸混合物的C和N值與EA-IRMS測得的純非衍生單氨基酸的同位素值進行比較，考察方法的適用性，實驗均進行3 次重復。經(jīng)校正后，EA-IRMS和GC-C-IRMS的氨基酸C和N測定值之差分別不高于±0.5‰和±1.6‰。利用1.3.3節(jié)方法對氨基酸對照品重復衍生10 次，每次重復衍生均進行3 次重復，以考察方法的準確性。GC-C-IRMS測定氨基酸N的平均標準偏差為±0.1‰，C為±0.5‰。利用1.3.3節(jié)方法對永川秀芽樣品進行提取和衍生10 次，測定C和N值以考察方法的不確定度。結果表明氨基酸N的標準偏差為±0.2‰，C為±0.7‰。

2.2 不同地理來源茶葉中咖啡堿和主要游離態(tài)氨基酸中δ13C和δ15N的變化

從表2可以看出，不同化合物之間（咖啡堿、6 種主要游離態(tài)氨基酸）的C和N值會由于植物體內(nèi)碳氮代謝過程中的同位素分餾而發(fā)生顯著變化。所有茶樣中咖啡堿的C平均值低于所有主要游離態(tài)氨基酸的C平均值。永川茶樣和秀山茶樣主要游離態(tài)氨基酸中絲氨酸C平均值＞天冬氨酸＞谷氨酸＞丙氨酸＞茶氨酸＞蘇氨酸，其余茶樣部分氨基酸C平均值與永川和秀山茶樣呈現(xiàn)的規(guī)律有所不同。同時研究發(fā)現(xiàn)，除榮昌茶樣外，其余茶樣谷氨酸N平均值＞天冬氨酸＞茶氨酸＞咖啡堿＞丙氨酸＞蘇氨酸＞絲氨酸，榮昌茶樣谷氨酸N平均值＞天冬氨酸＞茶氨酸＞咖啡堿＞丙氨酸＞絲氨酸＞蘇氨酸。這種差異性可能與地域差異、耕作習俗等相關性較高。

表2 不同產(chǎn)地茶中的咖啡堿和氨基酸的δ13C和δ15N值Table 2 δ13C and δ15N values of caffeine and amino acids in tea samples from different production regions

單因素方差分析結果顯示（表2），按照不同產(chǎn)地對茶樣品進行分組，秀山茶樣中谷氨酸、天冬氨酸和絲氨酸的C顯著高于其他地區(qū)的茶樣；秀山茶樣中咖啡堿、丙氨酸、茶氨酸和蘇氨酸的C顯著高于萬州、江津、榮昌和宜賓4 個地區(qū)的茶樣但與永川地區(qū)的茶樣差異不顯著，這可能與兩地環(huán)境相似有關。而永川茶樣咖啡堿和6 個主要游離態(tài)氨基酸的C也顯著高于萬州、江津、榮昌和宜賓4 個地區(qū)的茶樣。萬州茶樣咖啡堿和6 個主要游離態(tài)氨基酸的C值顯著高于江津、榮昌和宜賓3 個地區(qū)的茶樣。江津和榮昌茶樣中谷氨酸、天冬氨酸和絲氨酸的C值差異不顯著，江津茶樣中其他化合物的C值顯著高于榮昌茶樣。宜賓茶樣咖啡堿和6 個主要游離態(tài)氨基酸的C值顯著低于其他5 個地區(qū)的茶樣。此外，秀山茶樣中咖啡堿和6 種主要游離態(tài)氨基酸的N值顯著高于永川和宜賓茶樣；秀山茶樣中咖啡堿、茶氨酸、谷氨酸、蘇氨酸和絲氨酸的N值顯著高于江津茶樣；秀山茶樣中蘇氨酸和絲氨酸的N值顯著高于榮昌茶樣。萬州、江津和榮昌茶樣中咖啡堿和6 種主要游離態(tài)氨基酸的N值高于永川茶樣，顯著高于宜賓茶樣；但萬州、江津和榮昌茶樣中的咖啡堿和6 種主要游離態(tài)氨基酸的N值差異不顯著。永川茶樣咖啡堿和6 種主要游離態(tài)氨基酸的N值顯著高于宜賓茶樣。造成這一系列的差異性與每個地區(qū)環(huán)境、耕作習俗等綜合因素有關，機理有待進一步研究。

雖然這些變量均具有統(tǒng)計學意義，但在同一地區(qū)茶樣中，各化合物的C和N最小值與最大值存在較大差異（表2），單一變量也無法準確改善茶葉產(chǎn)品地理溯源。為了更加準確進行地理溯源，利用化學計量學結合這些具有統(tǒng)計學意義的多變量對不同產(chǎn)地茶葉樣品進行聚類趨勢評價。

2.3 不同地理來源茶葉的無監(jiān)督識別分析

2.3.1 不同地理來源茶葉的HCA

如圖1所示，HCA主要描述了2 個變量聚類。聚類到同一聚類樹的穩(wěn)定同位素比值證明其相關性較高，性質(zhì)相似。所有化合物的C值聚類到了同一聚類，證明茶葉中咖啡堿和6 種主要游離態(tài)氨基酸的C值之間存在較強相關性。同時可以看出，所有化合物的N值聚類到了同一聚類，證明茶葉中咖啡堿和6 種主要游離態(tài)氨基酸的N值之間也存在較強相關性，這些結果證實了2.2節(jié)中的結果，不同化合物間C值和N值均具有相似性。

圖1 不同地區(qū)茶樣中基于咖啡堿和6 種主要游離態(tài)氨基酸δ13C和δ15N的HCAFig.1 HCA heatmap of δ13C and δ15N of caffeine and six major free amino acids in tea samples from different regions

此外，HCA還顯示了多個樣本聚類，表明不同地理來源的茶葉分組效果較差。僅有宜賓茶樣和秀山茶樣能分別單獨聚類到同一個集群。永川茶樣和萬州茶樣混淆，榮昌茶樣、江津茶樣和萬州茶樣混淆，無法區(qū)分開來。這可能是由于永川與萬州，榮昌、江津與萬州茶樣生長時某些土壤性質(zhì)或環(huán)境條件的相似性所致。因此，采用HCA結合咖啡堿和6 種主要游離態(tài)氨基酸的14 個C和N值對不同地理來源的茶葉無法有效分組。

2.3.2 不同地理來源茶葉的PCA

由圖2可知，PC1和PC2分別代表6 個地區(qū)的茶樣可變性的方差貢獻率，為82.9%和16.9%，前2 個PC的累計方差貢獻率較高（99.81%），表明此模型PCA分類性能較強。從圖2A可以看出，永川、秀山、萬州、榮昌、江津和宜賓6 個地區(qū)的茶葉樣品根據(jù)產(chǎn)地不同有明顯差異，僅永川茶樣和秀山茶樣有一小部分重疊。從圖2B可以觀察到，PC1和PC2中大部分變量的方差貢獻相差不大，均有較大貢獻，無突出貢獻變量。此外，PC1能將江津茶樣、榮昌茶樣和宜賓茶樣區(qū)分開來，PC2能將萬州茶樣區(qū)分開來?？傮w而言，不同產(chǎn)地茶樣品可根據(jù)咖啡堿和6 個主要游離態(tài)氨基酸的C和N值指紋圖譜的PCA初步分組。

圖2 不同地區(qū)茶樣中基于咖啡堿和6 種主要游離態(tài)氨基酸δ13C和δ15N的PCA得分圖（A）和載荷圖（B）Fig.2 PCA score plot (A) and loading plot (B) of δ13C and δ15N of caffeine and six major free amino acids in tea samples from different regions

通過兩種無監(jiān)督模式識別方法的應用，觀察到6 個地區(qū)的茶葉樣品在原始數(shù)據(jù)矩陣中的自然分組，表明樣本有分組趨勢，且PCA分組效果更好。雖然HCA和PCA可以提供樣本聚類的可視化圖像，但它不能提供關于聚類質(zhì)量和聚類置信度的信息。因此，使用其他監(jiān)督識別的化學計量方法，進一步對不同產(chǎn)地茶樣進行地理溯源分析。

2.4 不同地理來源茶葉的有監(jiān)督識別分析

2.4.1 不同地理來源茶葉的PLS-DA

經(jīng)PLS-DA模型得到變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值，如圖3C所示。選擇VIP＞1的重要變量（C、C、C、C、C、C和N）作為在PLS-DA模型中改進茶葉地理溯源最重要的化學標記。

圖3 不同地區(qū)茶樣中基于咖啡堿和6 種主要游離態(tài)氨基酸δ13C和δ15N的PLS-DA得分圖（A）、載荷圖（B）和VIP值（C）Fig.3 PLS-DA score plot (A),loading plot (B) and VIP value (C) of δ13C and δ15N of caffeine and six major free amino acids in tea samples from different regions

2.4.2 不同地理來源茶葉的BP-ANN分析

設置BP-ANN模型的輸入層、隱藏層和輸出層分別有14、5 個和6 個神經(jīng)元，隱含層層數(shù)為1。從茶樣中隨機抽取70%的樣本作為訓練集，剩余30%的樣本作為外部驗證測試的測試集，用于評價模型的識別能力和預測能力，結果如表3所示。在模型訓練過程中，所有茶葉樣品可以成功地分為6 組，代表相應不同產(chǎn)地的茶樣；BPANN模型識別能力的準確率為100.0%。用BP-ANN模型對測試集預測發(fā)現(xiàn)，有30%的樣本被正確預測為6 組，總體預測準確率為100.0%，說明本BP-ANN模型具有極好的適用性。與PLS-DA模型相比，BP-ANN模型的性能和效果在改進茶葉地理溯源上更好，這與BP-ANN算法有關。如圖4所示，經(jīng)BP-ANN分析得到變量重要性，可作為改進茶葉產(chǎn)地溯源的7 個最重要的化學標記，為C、C、C、C、C、N和C。

圖4 不同地區(qū)茶樣中基于咖啡堿和6 種主要游離態(tài)氨基酸δ13C和δ15N的BP-ANN變量重要性Fig.4 BP-ANN variable importance of δ13C and δ15N of caffeine and six major free amino acids in tea samples from different regions

表3 BP-ANN模型的模型訓練和預測結果Table 3 Results of model training and prediction of BP-ANN model

2.4.3 不同地理來源茶葉的LDA

將茶葉樣本數(shù)據(jù)分為訓練集和交叉驗證集（均為隨機抽取70%茶樣數(shù)據(jù)）和測試集（剩余的30%茶樣數(shù)據(jù)）用于外部驗證輸入LDA模型。結果表明，形成了兩個具有統(tǒng)計學意義的Fisher判別函數(shù)：第1個Fisher判別函數(shù)中Wilks’ Lambda系數(shù)＝0.003，卡方（）＝262.82，自由度＝10，＜0.001；第2個Fisher判別函數(shù)Wilks’ Lambda系數(shù)＝0.167，＝80.60，自由度＝4，＜0.001。Wilks’Lambda值的顯著性表明判別函數(shù)是種群分化的基礎。第1個Fisher判別函數(shù)占總方差的91.9%，第2個Fisher判別函數(shù)占總方差的8.1%。兩者共占總方差的100.0%，結果覆蓋面極好。

經(jīng)Wilks’ Lambda步進式方法選擇變量后，簡化后的模型中納入了化學標記N和C。由圖5可知，茶葉的地理溯源得到了較好的改進分類。第1個Fisher判別函數(shù)對永川茶樣、秀山茶樣、萬州茶樣和榮昌茶樣具有明顯的證實作用；第2個Fisher判別函數(shù)對宜賓茶樣具有明顯的證實作用。如表4所示，識別能力以模型訓練中茶樣按產(chǎn)區(qū)正確分類的百分比表示，總體準確率為98.0%，結果很好；模型對永川茶樣識別效果相對較差，有樣品被錯誤識別到秀山樣品中，正確率為92.3%。這可能是永川和秀山地區(qū)相似的耕作、采摘習俗、環(huán)境等綜合因素造成。采用典型的交叉驗證和外部驗證方法以茶樣按產(chǎn)區(qū)正確分類的批次百分比表示預測能力，交叉驗證方法的預測總準確率為96.0%；其中永川茶樣準確率僅為84.6%，這與訓練集的結果相似，與秀山茶樣混淆。外部驗證方法的預測總準確率為95.5%，該方法預測結果較好；其中江津茶樣的準確率低（66.7%），可能與樣本數(shù)量不足有關。后期研究需擴大樣本量以提高證實的準確性。

圖5 基于咖啡堿和6 種主要游離態(tài)氨基酸δ13C和δ15N值的茶葉地理溯源的LDA模型得分圖Fig.5 Score plot of LDA model for geographical traceability of tea samples on the basis of δ13C and δ15N of caffeine and six major amino acids

表4 LDA模型的模型訓練、交叉驗證和預測結果Table 4 Results of model training,cross-validation,and prediction of LDA model

對比3 個預測模型性能，BP-ANN模型的識別和預測能力優(yōu)于PLS-DA模型和LDA模型。因此，使用咖啡堿和6 種主要游離態(tài)氨基酸的C和N值進行茶葉地理溯源，BP-ANN模型是其最佳認證方法。此外，3 種模型共同篩選出N和C為茶葉產(chǎn)地溯源中最重要的化學標記。

2.4.4 各預測模型在盲數(shù)據(jù)集的驗證性能

為進一步提高化學計量學應用于計算的穩(wěn)定性，比較各模型的驗證性能，使用PLS-DA、BP-ANN和LDA方法對盲數(shù)據(jù)進行識別。由表5可知，PLS-DA、BP-ANN和LDA方法的總體正確率分別為88.9%、94.4%和91.7%。在3 個模型中，秀山茶樣和宜賓茶樣的預測準確率均為100%，永川茶樣的預測準確率分別為88.9%、88.9%和77.8%，萬州茶樣的預測準確率分別為88.9%、88.9%和100%，江津茶樣的預測正確率均為80%，榮昌茶樣的預測準確率分別為75%、100%和100%。從這些結果可以看出，使用咖啡堿和6 種主要游離態(tài)氨基酸的C和N值進行茶葉地理溯源時，多數(shù)情況下BP-ANN模型可以最好地證實茶葉的地理來源，顯示最佳驗證性能。

表5 各模型在盲數(shù)據(jù)集下驗證性能結果Table 5 Results of performance verification of each model using blind data set

3 結論

開發(fā)一種GC-C-IRMS方法分析不同產(chǎn)地茶葉產(chǎn)品（秀芽）的咖啡堿和6 種主要游離態(tài)氨基酸C和N，并結合化學計量學模型對茶葉產(chǎn)地進行地理溯源。結果表明：采用咖啡堿和6 種主要游離態(tài)氨基酸的C和N指紋技術對茶葉地理溯源是可行的，GC-C-IRMS分析方法驗證效果好。PLS-DA、BP-ANN和LDA模型預測準確率達到85%以上，驗證準確率達到85%以上；其中BPANN模型認證性能最優(yōu)。同時篩選N和C為不同產(chǎn)地茶葉樣品認證的重要的化學標記。本研究結果為茶葉產(chǎn)品的認證體系的建立和完善提供一定技術和理論支撐，也為其他食品地理溯源研究提供研究思路和方法參考。今后建議在更大樣本集和不同地點對這種新方法進行測試，以進一步評價咖啡堿和氨基酸化合物碳氮穩(wěn)定同位素比值分析在茶葉產(chǎn)品認證中的適用性。