表面增強(qiáng)拉曼光譜法靈敏檢測(cè)亞硫酸根離子

高月瀅，萬玉琪，劉 琳，劉婧涵，李靖坤，皮付偉

（江南大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

亞硫酸鹽具有多種防腐性能，可以抑制微生物生長(zhǎng)、防止褐變，并具有抗氧化和漂白作用，被廣泛用作食品防腐劑。此外，亞硫酸鹽在藥物中還具有維持藥物穩(wěn)定性和效力的作用。由于這種廣泛應(yīng)用的歷史，在合適的劑量?jī)?nèi)，亞硫酸鹽通常被認(rèn)為安全，但仍有小部分人群對(duì)亞硫酸鹽敏感。其敏感性臨床表現(xiàn)包括皮膚疾病、呼吸系統(tǒng)疾病以及胃痙攣等胃腸道過敏反應(yīng)。此外，高濃度的亞硫酸鹽攝入甚至?xí)?dǎo)致休克等。其中，哮喘患者是亞硫酸鹽敏感癥的高發(fā)人群，尤其是類固醇依賴性哮喘患者。Kü?ükatay等也提出亞硫酸鹽會(huì)提高大鼠脊髓反射的興奮性，進(jìn)而對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p傷。因此，食品中亞硫酸鹽的使用成為消費(fèi)者和監(jiān)管機(jī)構(gòu)重點(diǎn)關(guān)注的問題。美國(guó)食品藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）要求含有10 mg/kg亞硫酸鹽的食品需在成分標(biāo)簽中進(jìn)行標(biāo)注，并禁止在新鮮水果和蔬菜及肉類食品中使用亞硫酸劑。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）提出每日可接受的亞硫酸鹽的攝入量為0.7 mg/kg。中國(guó)嚴(yán)格規(guī)定白砂糖中亞硫酸鹽含量需低于100 mg/kg。

目前，已經(jīng)建立了許多用于亞硫酸鹽檢測(cè)的分析技術(shù)，例如滴定法、熒光光譜法和色譜法等，但這些檢測(cè)方法耗時(shí)長(zhǎng)且需要復(fù)雜的測(cè)試儀器。表面增強(qiáng)拉曼散射（surface-enhanced Raman scattering，SERS）光譜作為一種超靈敏的分子傳感技術(shù)，由于其對(duì)多分子的即時(shí)信息獲取能力已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測(cè)、生物醫(yī)學(xué)和食品科學(xué)等領(lǐng)域。與有機(jī)分子不同，大多數(shù)無機(jī)離子不能直接產(chǎn)生拉曼信號(hào)，因此一般通過無機(jī)離子的特異性探針對(duì)其進(jìn)行捕獲。此外，開發(fā)用于識(shí)別和檢測(cè)各種離子的專用傳感器也是當(dāng)前SERS技術(shù)的熱點(diǎn)之一。探針分子與無機(jī)離子的結(jié)合會(huì)改變其分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致分子振動(dòng)特性的改變，因此可以監(jiān)測(cè)探針分子與陰離子識(shí)別產(chǎn)生的SERS光譜變化間接實(shí)現(xiàn)對(duì)特定陰離子的檢測(cè)。然而，與穩(wěn)定的陽(yáng)離子不同，大尺寸的陰離子具有廣泛的幾何形狀和更彌散的性質(zhì)，這需要探針分子對(duì)目標(biāo)陰離子具有更高的互補(bǔ)性以獲得良好的選擇性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檸檬酸鈉（98%）、3-氨基丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane，APTES，98%） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；4-巰基苯硼酸（90%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯化鉀、硝酸鉀、溴化鉀、亞硫酸鉀、亞硝酸鈉、磷酸二氫鉀、硝酸銀、氫氧化鉀（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氮?dú)猓∟，純度≥99.99%） 無錫太湖氣體公司；0.22 μm微孔濾膜（水系） 南通海之星實(shí)驗(yàn)器材有限公司；超親水蓋玻片 德國(guó)Karl-Hecht公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超純水純化系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司；Dxr2xi共聚焦拉曼顯微鏡 美國(guó)賽默飛生物技術(shù)有限公司；等離子體清洗機(jī) 德國(guó)Diener公司；JEM-2100場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡、SU-8230場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本電子株式會(huì)社。

1.3 方法

1.3.1 銀納米顆粒（silver nanoparticles，AgNPs）的合成

AgNPs按照檸檬酸鈉還原策略合成。即在600 r/min磁力攪拌下將2 mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的檸檬酸三鈉加入沸騰的AgNO溶液（1×10mol/L，100 mL）中煮沸1 h。溶液顏色逐漸變?yōu)辄S綠，冷卻至室溫后置于4 ℃避光保存作為儲(chǔ)備液。

1.3.2 4-MPBA修飾的AgNPs（4-MPBA@AgNPs）芯片的制備

玻璃蓋玻片分別用超純水和無水乙醇超聲清洗30 min，放入等離子體清洗機(jī)進(jìn)行羥基化處理。隨后，將APTES通過氣相沉積修飾在玻璃襯底上，從而完成基底的硅烷化處理。將硅烷化襯底浸入10 倍濃縮的AgNPs膠體中反應(yīng)4 h，通過Ag-N鍵將AgNPs固定在玻璃襯底上，得到單層的AgNPs基底。將AgNPs芯片浸泡在4-MPBA乙醇溶液（1×10mol/L）中過夜，隨后用乙醇徹底沖洗，即得到4-MPBA@AgNPs芯片（圖1）。

圖1 4-MPBA@AgNPs芯片制備的流程圖Fig.1 Flow chart of the fabrication of 4-MPBA@AgNPs chip

配制0.01 mol/L的KSO標(biāo)準(zhǔn)溶液，并將其進(jìn)行連續(xù)稀釋，得到一系列濃度梯度的KSO標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)液。隨后，向待測(cè)樣品中滴加適量的高濃度氧化劑，振蕩搖勻并靜置反應(yīng)，使得KSO完全轉(zhuǎn)化為KSO。調(diào)節(jié)樣品溶液pH值至中性，然后將在1.5 mL的樣品溶液滴加在4-MPBA@AgNPs芯片表面，充分反應(yīng)10 min。

反應(yīng)后的4-MPBA@AgNPs基底從氧化液中取出，自然晾干后進(jìn)行拉曼檢測(cè)。測(cè)試參數(shù)：激發(fā)波長(zhǎng)532 nm，激光功率2.0 mW，曝光時(shí)間0.01 s，10 次積累。實(shí)驗(yàn)中對(duì)所有4-MPBA光譜的SERS基線校正光譜在1 070 cm處進(jìn)行歸一化處理。誤差棒表示基于10 個(gè)獨(dú)立測(cè)量值的標(biāo)準(zhǔn)差。

1.3.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

白糖參照SN/T 2918—2011對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理。將4 g樣品溶解在100 mL水中并加入2 mL的NaOH溶液（1 mol/L）。搖勻后9 000 r/min離心30 min。使用0.2 μm濾膜將上清液過濾并再次使用超濾管離心。使用最佳氧化條件對(duì)加標(biāo)樣品進(jìn)行處理，反應(yīng)后調(diào)節(jié)pH值至中性。隨后將樣品引入反應(yīng)體系進(jìn)行SERS圖譜采集。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）基于10 次平行測(cè)量值。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于4-MPBA@AgNPs芯片的檢測(cè)機(jī)理

圖2 4-MPBA@AgNPs芯片檢測(cè)的示意圖Fig.2 Schematic illustration of detection by 4-MPBA@AgNPs chip

圖3 不同pH值環(huán)境下4-MPBA（a）和與共存溶液中4-MPBA（b）的紫外吸收光譜Fig.3 UV-vis absorption spectra of 4-MPBA in the absence (a) or presence (b) of under different pH environments

2.2 AgNPs的表征

參照傳統(tǒng)的檸檬酸三鈉還原法成功制備AgNPs，對(duì)其紫外特征吸收峰進(jìn)行表征。如圖4所示，AgNPs在波長(zhǎng)407 nm處顯示出較強(qiáng)的特征吸收峰。此外，其紫外吸收峰的半峰寬較窄，說明AgNPs的粒徑尺寸較為均勻。進(jìn)一步，使用透射電子顯微鏡對(duì)AgNPs的形貌進(jìn)行表征（圖4b），可以看出合成的AgNPs粒徑分布均勻，且呈現(xiàn)出良好的顆粒形態(tài)與分散性。

圖4 AgNPs的紫外可見吸收光譜（a）和透射電鏡圖（b）Fig.4 UV-Vis absorption spectrum (a) and TEM image (b) of AgNPs

2.3 AgNPs基底的制備與表征

選用玻璃蓋玻片作為襯底，界面羥基化使襯底獲得良好的親水性，也促使APTES修飾在襯底表面以完成硅烷化處理。最后將AgNPs滴加在硅烷化襯底表面孵育4 h，通過Ag-N鍵固定在襯底表面，得到單層AgNPs基底。如圖5所示，AgNPs通過與APTES的氨基基團(tuán)反應(yīng)而嫁接到玻璃基底上，形成AgNPs均勻分布的單層AgNPs基底。

圖5 AgNPs基底的掃描電鏡圖Fig.5 TEM image of AgNPs substrate

2.4 4-MPBA@AgNPs芯片的表征

通過Ag-S鍵將4-MPBA探針分子修飾到AgNPs表面，得到4-MPBA@AgNPs芯片。如圖6、表1所示，在4-MPBA的SERS光譜中，由于S—H拉伸振動(dòng)（（SH））產(chǎn)生的2 563 cm波段的峰完全消失，證明4-MPBA分子通過Ag—S鍵被成功修飾到AgNPs表面。此外，歸屬于C—S—H彎曲帶模式（（CSH））的911 cm處的峰也在SERS光譜中消失（圖6中的b），同樣證明了Ag—S鍵的形成。

圖6 4-MPBA的普通拉曼光譜（a）和修飾在AgNPs芯片上的SERS光譜（b）Fig.6 Raman spectrum of 4-MPBA power (a),and SERS spectrum of 4-MPBA adsorbed (b) on AgNPs substrate

表1 4-MPBA拉曼特征峰及其歸屬[24]Table 1 Assignments of characteristic Raman peaks of MPBA[24]

2.5 4-MPBA@AgNPs芯片對(duì)的檢測(cè)可行性

圖7 用4-MPBA@AgNPs芯片檢測(cè)氧化前后的離子的SERS響應(yīng)光譜及其空白對(duì)照Fig.7 SERS spectra of 4-MPBA@AgNPs chip for before and after oxidation and blank control

2.6 系統(tǒng)工作pH值的確定

圖8 隨pH值變化的4-MPBA@AgNPs芯片的SERS光譜Fig.8 SERS spectra of 4-MPBA@AgNPs chip under different pH environments

2.7 氧化劑的選擇

圖9 4-MPBA@AgNPs芯片檢測(cè)不同氧化劑處理離子的SERS光譜Fig.9 SERS spectra of 4-MPBA@AgNPs chip for treated with different oxidants

2.8 氧化時(shí)間的優(yōu)化

圖10 峰值比（I1382/I1070）隨離子氧化時(shí)間的變化Fig.10 Variation in I1382/I1070 with oxidation time of

2.9 氧化處理對(duì)4-MPBA@AgNPs芯片選擇性的影響

圖11 4-MPBA@AgNPs芯片檢測(cè)氧化處理后不同離子的SERS光譜Fig.11 SERS spectra of 4-MPBA@AgNPs chip for different anions treated by oxidants

2.10 的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖12 4-MPBA@AgNPs芯片對(duì)不同濃度離子的SERS光譜Fig.12 SERS spectra of 4-MPBA@AgNPs chip for different concentrations of

表2 本研究與其他離子檢測(cè)方法的對(duì)比Table 2 Comparison between this method and other methods for detection

2.11 白糖樣品中離子的檢測(cè)

圖13 4-MPBA@AgNPs芯片對(duì)白糖中離子的SERS響應(yīng)光譜Fig.13 SERS spectra of the proposed 4-MPBA@AgNPs chip for ion spiked in white sugar

表3 白糖中含量的測(cè)定Table 3 Recoveries and RSD of in spiked white sugar

3 結(jié)論