香豆素類熒光衍生試劑的合成及其柱前衍生氟蟲腈HPLC-FLD檢測方法的建立

劉 媛，劉 佳，唐道邦，涂勇剛，臧建威，吳雨青，陳繼光，張清峰，尹忠平,

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省農(nóng)產(chǎn)品加工與安全控制工程實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510610）

氟蟲腈是一種高效、廣譜的苯基吡唑類殺蟲劑，該物質(zhì)能與昆蟲體內(nèi)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)——-氨基丁酸受體結(jié)合，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)氯離子通道關(guān)閉，引起肌肉和神經(jīng)異于常態(tài)、極度興奮，最終導(dǎo)致昆蟲麻痹、死亡。該殺蟲劑使用方便（可直接施入土壤中，也可噴灑于葉面上），藥效持久，且對農(nóng)作物本身沒有毒害作用，因此曾被廣泛用于蔬菜、水果、棉花、果樹等作物害蟲防控以及畜牧生產(chǎn)、公共衛(wèi)生和醫(yī)療等方面。但是氟蟲腈在自然條件下難以降解，半衰期長，易造成環(huán)境污染問題，也容易在動物和人體中富集，導(dǎo)致健康和安全問題，此外對水生生物也有較高的毒性。因此，對農(nóng)產(chǎn)品中氟蟲腈的殘留進(jìn)行檢測和控制十分必要。

目前，氟蟲腈的檢測方法主要有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLCMS/MS）法、氣相色譜法以及氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用法，這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。HPLC-MS/MS、GC-MS具有較高的靈敏度，應(yīng)用范圍較廣，但檢測成本相對較高，需要較為貴重的精密儀器，操作人員技能要求較高。HPLC檢測成本低，操作較為簡便，但靈敏度不高。因此，開發(fā)靈敏度高、選擇性強(qiáng)、干擾小的氟蟲腈殘留檢測方法具有重大意義。

高效液相色譜-熒光檢測（high performance liquid chromatography-fluorescence detection，HPLC-FLD）靈敏、穩(wěn)定、干擾小，因此被廣泛應(yīng)用于痕量和微量檢測。HPLC-FLD檢測的靈敏度主要取決于熒光衍生試劑的性質(zhì)，高熒光強(qiáng)度就意味著高靈敏度。一個優(yōu)良的熒光衍生試劑必需具備一個高強(qiáng)度的發(fā)色基團(tuán)和一個高效率的衍生基團(tuán)。在熒光衍生試劑的分子結(jié)構(gòu)中，發(fā)色團(tuán)是最為重要的部分，可以說該基團(tuán)決定了HPLC-FLD的檢測靈敏度，因此發(fā)色團(tuán)的設(shè)計合成又是熒光衍生試劑設(shè)計合成的核心。此外，衍生化反應(yīng)基團(tuán)是熒光衍生試劑另一個重要的必需結(jié)構(gòu)，是連接待測物與熒光體的“手臂”，這個基團(tuán)決定了衍生化反應(yīng)效率的高低。

香豆素類化合物具有良好的光物理和光化學(xué)性質(zhì)，對環(huán)境有極強(qiáng)的敏感性，同時具有較大的Stokes位移，因此在熒光檢測中具有很好的應(yīng)用前景。該類物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中的取代基位置和類型對其熒光性質(zhì)有較大的影響，不同位置的供電子基團(tuán)和吸電子基團(tuán)能在其結(jié)構(gòu)上建立“推、拉”電子體系，可減弱或增強(qiáng)該體系，進(jìn)而有效地控制熒光強(qiáng)度；同時，其結(jié)構(gòu)中的供、吸電子基團(tuán)容易被修飾，從而使其熒光波長在大且寬的范圍之內(nèi)得到更好的拓展。因此，香豆素類化合物作為熒光衍生試劑還具有很大的改造和提升空間。

研究表明，氟蟲腈分子結(jié)構(gòu)中吡唑環(huán)上3位腈基、4位三氟甲基亞砜基及5位游離的氨基均可被修飾和改造，可利用這一結(jié)構(gòu)特點(diǎn)設(shè)計和合成氟蟲腈柱前熒光衍生試劑，從而建立氟蟲腈HPLC-FLD檢測方法。相比較而言，吡唑環(huán)上的5位氨基更易被修飾，因此針對該基團(tuán)進(jìn)行特異性反應(yīng)生成較強(qiáng)熒光強(qiáng)度的氟蟲腈衍生物是可行的。

以4-(二乙氨基)水楊醛為母體，合成以羧酸基團(tuán)為衍生化反應(yīng)基團(tuán)的香豆素類熒光衍生試劑——7-(二乙氨基)-2-氧-2-色酮-3-羧酸（記為L1），以L1與氟蟲腈進(jìn)行衍生化反應(yīng)，生成柱前熒光衍生產(chǎn)物-(3-氰基-1-(2,6-二氯-4-(三氟甲基)苯基)-4-((三氟甲基)亞磺?；?-1-吡唑-5-基)-7-(二乙氨基)-2-氧-2-色酮-3-甲酰胺（記為SF1），在此基礎(chǔ)上建立高靈敏度的氟蟲腈HPLC-FLD檢測方法。本實(shí)驗(yàn)所合成的結(jié)構(gòu)新穎的香豆素類熒光衍生試劑L1具有高熒光強(qiáng)度，因此在HPLC-FLD檢測中具有較高的應(yīng)用價值；基于羧基和氨基建立的柱前衍生化反應(yīng)方法，還可用于其他具有氨基基團(tuán)的待測目標(biāo)物的檢測，因此，本實(shí)驗(yàn)檢測設(shè)計思路和研究方案對HPLCFLD方法研究具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4-(二乙氨基)水楊醛（純度≥98%） 天津希恩思生化科技有限公司；丙二酸二乙酯（純度≥99%） 上海畢得醫(yī)藥科技有限公司；乙醇、氫氧化鈉、二氯甲烷（dichloromethane，DCM）、,-二甲基甲酰胺（,-dimethylformamide，DMF）、鹽酸（均為分析純） 西隴科學(xué)股份有限公司；氟蟲腈（純度≥98%）、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC，純度≥99%） 薩恩化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司；哌啶（分析純）、四氫呋喃（tetrahydrofuran，THF，化學(xué)純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；4-二甲氨基吡啶（4-dimethylaminopyridine，DMAP，分析純）、,-二環(huán)己基碳酰亞（dicyclohexyl carbodiimide，DCC，分析純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷（benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate，PyBOP，分析純）、三乙胺（triethylamine，TEA，分析純） 西寶生物科技（上海）股份有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，純度≥99%） 上海索來寶科技有限公司；乙腈（acetonitrile，ACN，色譜純）美國Tieda試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

400/500MHz核磁共振波譜儀 德國布魯克科技有限公司；7890A-5975C GC-MS聯(lián)用儀、1260-G1321B HPLC-FLD儀 安捷倫科技有限公司；SGW X-4B顯微數(shù)字熔點(diǎn)測定儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；DLSB-5/25低溫冷卻液循環(huán)泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；MR Hei-End恒溫加熱磁力攪拌器、Precision MLG3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國海道夫集團(tuán)；PS-06A數(shù)控超聲波清洗儀 深圳市恒達(dá)康科技有限公司；超純水制備儀 美國Milli-Q科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 香豆素類熒光衍生試劑的合成路線與方法

1.3.1.1 香豆素類熒光衍生試劑的合成路線

在實(shí)驗(yàn)室前期合成工作基礎(chǔ)上，以4-(二乙氨基)水楊醛為原料，在哌啶催化下與丙二酸二乙酯縮合成環(huán)，再經(jīng)酯水解等反應(yīng)，合成熒光衍生試劑L1，具體合成路線如圖1所示。

圖1 香豆素類熒光衍生試劑（L1）的合成路線Fig.1 Synthesis routes of fluorescent coumarin derivatization reagent (L1)

1.3.1.2 香豆素類熒光衍生試劑的合成方法

中間體化合物1-1的合成：分別將4-(二乙氨基)水楊醛（9.7 g，1.0 mmol）和丙二酸二乙酯（16.0 g，2.0 mmol）溶于150 mL無水乙醇溶液中，添加10 mL哌啶，將其混合溶液在80 ℃攪拌反應(yīng)6 h，薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）法監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。待反應(yīng)結(jié)束，溶液冷卻至室溫，脫溶，硅膠拌樣，柱層析純化分離制得化合物1-1（洗脫劑：石油醚-乙酸乙酯（10∶1，/））。

香豆素類熒光衍生試劑L1的合成：將中間體化合物1-1（1.45 g，10 mmol）溶于20 mL無水乙醇，添加10 mL 10% NaOH溶液，95 ℃回流攪拌反應(yīng)2 h，TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。待反應(yīng)結(jié)束，溶液冷卻至室溫，加鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH值至2，0 ℃下冷卻結(jié)晶，生成大量沉淀；靜置、抽濾，冰水沖洗；真空干燥，得到目標(biāo)產(chǎn)物L(fēng)1。經(jīng)檢測產(chǎn)物純度高，無需純化，可直接用于后續(xù)反應(yīng)。

1.3.2 熒光光譜掃描

以ACN為溶劑，配制不同濃度的熒光衍生試劑L1及其與氟蟲腈衍生化產(chǎn)物SF1的儲備液，采用熒光分光光度計掃描檢測其熒光光譜性質(zhì)。熒光分光光度計的狹縫設(shè)置為10 nm/10 nm，掃描所用石英皿為1 cm×1 cm，以最大吸收波長進(jìn)行掃描獲取發(fā)射波長；同時，根據(jù)所測定的發(fā)射波長與激發(fā)波長計算Stokes位移（發(fā)射波長與激發(fā)波長之間的差值）。

1.3.3 氟蟲腈柱前衍生化反應(yīng)

1.3.3.1 衍生化反應(yīng)試劑的配制

氟蟲腈標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.043 7 g氟蟲腈，用ACN溶解并定容至10 mL，配制成1.0×10mol/L的氟蟲腈標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于4 ℃冰箱中貯存，備用。

DCC溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.103 2 g DCC，用ACN溶解并定容至5 mL，配制成0.1 mol/L的DCC溶液，置于4 ℃冰箱中貯存，備用。

EDC溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.095 8 g EDC，用ACN溶解并定容至5 mL，配制成0.1 mol/L的EDC溶液，置于4 ℃冰箱中貯存，備用。

PyBOP溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.260 2 g PyBOP，用ACN溶解并定容至5 mL，配制成0.1 mol/L的PyBOP溶液，置于4 ℃冰箱中貯存，備用。

DMAP溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.122 2 g DMAP，用ACN溶解并定容至5 mL，配制成0.2 mol/L的DMAP溶液，置于4 ℃冰箱中貯存，備用。

熒光衍生試劑L1溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.032 6 g所合成的L1，用ACN溶解并定容至25 mL（利用超聲完全促溶），配制成5.0×10mol/L的L1溶液，置于4 ℃冰箱中貯存，備用。

1.3.3.2 衍生化產(chǎn)物SF1的制備

L1與氟蟲腈的衍生化反應(yīng)如圖2所示。具體的衍生化產(chǎn)物SF1的制備方法如下：將熒光衍生試劑L1（0.47 g，1 mmoL）和40 mL二氯甲烷加入100 mL茄形瓶中，35 ℃攪拌下依次加入DMAP（0.19 g，0.85 mmoL）、EDC（0.19 g，0.5 mmoL）和氟蟲腈（0.32 g，0.4 mmoL），繼續(xù)反應(yīng)，TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。待反應(yīng)結(jié)束后，加入40 mL飽和NaOH溶液和20 mL水（超純水，以下同），以二氯甲烷萃?。?×50 mL），合并有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，脫溶，以硅膠柱層析進(jìn)行分離純化（洗脫劑為正己烷-乙酸乙酯，3∶1，/），得到黃綠色的衍生化產(chǎn)物SF1。

圖2 L1與氟蟲腈的衍生化反應(yīng)Fig.2 Derivatiation reaction of L1 and fipronil

1.3.3.3 氟蟲腈柱前衍生化反應(yīng)體系和方法

取2 mL安瓿瓶，依次加入300 μL DCM、90 μL EDC（0.1 mol/L）、90 μL DMAP（0.2 mol/L）、30 μL氟蟲腈溶液（1.0×10mol/L）和660 μL熒光衍生試劑L1（5.0×10mol/L），密封；充分混勻后置于45 ℃水浴中振蕩反應(yīng)60 min，取出冷卻至室溫，ACN定容至10 mL，取10 μL進(jìn)行HPLC-FLD檢測。

1.3.4 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

合成的中間體化合物1-1、熒光衍生試劑L1及氟蟲腈柱前衍生化產(chǎn)物SF1，均以氫核磁共振（hydrogen nuclear magnetic resonance，H NMR）、C核磁共振（C nuclear magnetic resonance，C NMR）和高分辨率質(zhì)譜儀（high resolution mass spectrometer，HRMS）波譜技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定與表征。

1.3.5 衍生化反應(yīng)條件的優(yōu)化

采用單因素試驗(yàn)對衍生化反應(yīng)主要條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)因素梯度設(shè)計如下：催化劑分別選取EDC/DMAP、DCC/DMAP和PyBOP/TEA；反應(yīng)溶劑分別選取DCM、ACN、THF、DMF、DMSO；反應(yīng)時間分別設(shè)置10、20、30、40、50、60、70、80 min；反應(yīng)溫度分別設(shè)置5、15、25、35、45、55、65 ℃；熒光衍生試劑與氟蟲腈體積比分別設(shè)置1∶1、3∶1、5∶1、7∶1、9∶1、11∶1、13∶1、14∶1。優(yōu)化試驗(yàn)中的衍生產(chǎn)物，均以HPLC-FLD進(jìn)行檢測，以測得峰面積為指標(biāo)衡量反應(yīng)的效率。

1.3.6 氟蟲腈柱前衍生化HPLC-FLD檢測方法和條件

HPLC-FLD檢測方法和條件如下：Symmetry C色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流速1.0 mL/min；流動相A為100%純ACN，流動相B為超純水；等度洗脫，時間為15 min，A相為80%，B相為20%；激發(fā)光波長和發(fā)射光波長分別為454 nm和490 nm；檢測前色譜柱先用流動相平衡10 min，所有檢測樣品進(jìn)樣前均先經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。

1.3.7 氟蟲腈柱前衍生化HPLC-FLD檢測方法評價

1.3.7.1 精密度實(shí)驗(yàn)

精確吸取優(yōu)化條件下反應(yīng)后的溶液10 μL，按照1.3.6節(jié)色譜分離條件，連續(xù)進(jìn)樣檢測20 次，測定衍生化產(chǎn)物SF1的保留時間和峰面積，并計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.7.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將衍生化反應(yīng)產(chǎn)物在室溫條件下分別放置1、2、4、8、24 h后進(jìn)行HPLC-FLD檢測，記錄放置不同時間后衍生產(chǎn)物SF1的保留時間和峰面積，并計算其RSD，以此評價檢測方法的穩(wěn)定性。

1.3.7.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按照1.3.3.3節(jié)氟蟲腈柱前衍生化反應(yīng)條件，進(jìn)行10 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，在相同條件下進(jìn)行HPLC-FLD檢測，計算衍生產(chǎn)物SF1的保留時間和峰面積的RSD，以評價方法的重復(fù)性。

1.3.7.4 檢出限和定量限的計算

檢出限和定量限分別以＝3和＝10進(jìn)行計算，按式（1）計算：

式中：為檢出限；為檢測器靈敏度；為噪音。

靈敏度按式（2）計算：

式中：為靈敏度；為信號響應(yīng)值；為進(jìn)樣量。

合并2 個公式，得式（3）：

信號響應(yīng)值與噪音之比為該進(jìn)樣量下的信噪比；HPLC-FLD檢測時，儀器可自動分析顯示信噪比，直接用于計算檢出限、定量限。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及繪圖軟件為Microsoft Excel 2019、IBM SPSS statistics 25、GraphPad Prism 8.0和ChemBioDraw 14。樣本間的多重比較采用Duncan新復(fù)極差法（＜0.05和＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 香豆素類熒光衍生試劑的合成與結(jié)構(gòu)表征

以4-(二乙氨基)水楊醛為先導(dǎo)物，在哌啶催化下與丙二酸二乙酯縮合成環(huán)，再經(jīng)酯水解得到香豆素類熒光衍生試劑L1。采用H NMR、C NMR和HRMS波譜技術(shù)對熒光衍生試劑L1及中間體化合物1-1進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定與表征，結(jié)果如下：

中間體化合物1-1：7-(二乙氨基)-2-氧-2-色酮-3-羧酸乙酯，紅褐色固體，產(chǎn)率75.8%。H NMR（500 MHz，DMSO）8.54（s,1H），7.62（d,＝9.0 Hz,1H），6.76（dd,＝9.0,2.4 Hz,1H），6.53（d,＝2.3 Hz,1H），4.24（q,＝7.1 Hz,2H），3.48（q,＝7.0 Hz,4H），1.29（t,＝7.1 Hz,3H），1.14（t,＝7.0 Hz,6H）。HRMS（ESI）/[M+H]：CHNO，理論計算值289.131 4，實(shí)際檢測值290.136 9。

熒光衍生試劑L1：7-(二乙氨基)-2-氧-2-色酮-3-羧酸，橙黃色固體，產(chǎn)率97.2%。H NMR（500 MHz，DMSO）12.55（bs,1H），8.59（s,1H），7.68～7.61（m,1H），6.80（dd,＝9.0,2.4 Hz,1H），6.57（d,＝2.3 Hz,1H），3.49（q,＝7.0 Hz,4H），1.14（t,＝7.0 Hz,6H）。C NMR（126 MHz,DMSO）164.45、159.57、157.84、152.86、149.37、131.79、110.01、107.35、107.12、95.88、44.36、12.27。HRMS（ESI）/[M+H]：CHNO，理論計算值261.100 1，實(shí)際檢測值261.099 3。

2.2 SF1的分離純化與結(jié)構(gòu)表征

選用EDC/DMAP為催化縮合劑，二氯甲烷為反應(yīng)溶劑，氟蟲腈與熒光衍生試劑L1用量比為1∶11，在45 ℃水浴中反應(yīng)60 min，制得衍生化反應(yīng)產(chǎn)物SF1。利用硅膠柱層析法，對所制備的SF1進(jìn)行分離和純化，并通過H NMR、C NMR和HRMS波譜技術(shù)對其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定與表征，結(jié)果如下：

柱前熒光衍生化產(chǎn)物SF1：-(3-氰基-1-(2,6-二氯-4-(三氟甲基)苯基)-4-((三氟甲基)亞磺酰基)-1-吡唑-5-基)-7-(二乙氨基)-2-氧-2-色酮-3-甲酰胺，黃綠色固體，產(chǎn)率81.5%。H NMR（400 MHz,DMSO）11.69（s,1 H ），8.79（s,1 H ），8.46（d d,＝17.0,1.3 Hz,2H），7.73（d,＝9.2 Hz,1H），6.87（dd,＝9.2,2.3 Hz,1H），6.61（d,＝2.1 Hz,1H），3.50（q,＝7.0 Hz,4H），1.13（t,＝7.0 Hz,6H）。C NMR（101 MHz,DMSO）162.92、160.03、157.85、153.99、149.77、139.10、135.24、135.15、133.46、132.75、127.33、126.07、123.39、120.66、111.23、110.93、108.28、104.33、95.98、44.64、12.26。

2.3 熒光衍生試劑L1和衍生產(chǎn)物SF1的熒光光譜特性

由圖3可知，熒光衍生試劑L1和氟蟲腈熒光衍生產(chǎn)物SF1的熒光光譜性質(zhì)差別不太大，SF1的激發(fā)光波長和發(fā)射光波長分別為454 nm和490 nm，Stokes位移為36 nm；L1的激發(fā)光波長和發(fā)射光波長分別為454 nm和480 nm，Stokes位移為26 nm。從峰形看，L1更加對稱、平滑，其峰形比SF1稍好一些；從熒光強(qiáng)度看，在相同濃度下的L1和SF1都具有較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度；從Stokes位移看，衍生化反應(yīng)產(chǎn)物SF1比L1要大10 nm。根據(jù)宋昊翰的研究，Stokes位移越大，熒光檢測時激發(fā)光對發(fā)射光的干擾就越小，因此檢測會更加穩(wěn)定些。上述結(jié)果顯示，氟蟲腈通過衍生化反應(yīng)后所形成的產(chǎn)物，具有良好的熒光光譜性質(zhì)，使建立高靈敏度的氟蟲腈殘留檢測方法成為可能。

圖3 熒光衍生試劑L1（A）和氟蟲腈衍生產(chǎn)物SF1（B）在ACN中的熒光光譜掃描圖Fig.3 Fluorescence spectra of fluorescent derivatization reagent L1 (A) and fipronil derivative SF1 (B) in acetonitrile

2.4 氟蟲腈柱前衍生化反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.4.1 催化劑對衍生反應(yīng)效率的影響

根據(jù)文獻(xiàn)報道，選擇EDC/DMAP、DCC/DMAP和PyBOP/TEA三種堿性催化劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測分析其對氟蟲腈與熒光衍生試劑L1的衍生化反應(yīng)效率的影響。如圖4所示，在EDC/DMAP的催化作用下，衍生產(chǎn)物SF1的HPLC-FLD檢測所得峰面積極顯著高于DCC/DMAP和PyBOP/TEA（＜0.01），因此EDC/DMAP為衍生化反應(yīng)的優(yōu)選催化劑。王夢等的研究表明，EDC/DMAP在氟蟲腈亞砜酰胺化反應(yīng)中為較優(yōu)催化劑。

圖4 催化劑對香豆素類熒光衍生試劑與氟蟲腈衍生化反應(yīng)效率的影響Fig.4 Influence of catalyzer on the derivatization reaction efficiency between fluorescent coumarin derivatization reagent and fipronil

2.4.2 反應(yīng)溶劑對衍生反應(yīng)效率的影響

對衍生化反應(yīng)所使用的溶劑進(jìn)行優(yōu)選，選擇DCM、ACN、THF、DMF和DMSO 5種常用的衍生化反應(yīng)溶劑進(jìn)行試驗(yàn)，分析其對衍生反應(yīng)效率的影響，結(jié)果如圖5所示。衍生化反應(yīng)在DCM中的效率最高，檢測到衍生產(chǎn)物SF1的峰面積最大，熒光衍生化反應(yīng)最完全，其次是在ACN中，而在THF、DMF和DMSO中反應(yīng)不完全，效率很低。衍生化反應(yīng)之所以在DCM中反應(yīng)效率高，主要是因?yàn)闊晒庋苌噭㎜1和氟蟲腈在DCM中都具有很好的溶解性。基于上述試驗(yàn)結(jié)果，優(yōu)選DCM為衍生化反應(yīng)的溶劑。

圖5 反應(yīng)溶劑對香豆素類熒光衍生試劑與氟蟲腈衍生化反應(yīng)效率的影響Fig.5 Influence of reaction solvent on the derivatization reaction efficiency between fluorescent coumarin derivatization reagent and fipronil

2.4.3 反應(yīng)時間對衍生反應(yīng)效率的影響

如圖6所示，在10～80 min時間范圍內(nèi)，衍生化產(chǎn)物SF1的峰面積隨反應(yīng)時間的延長而增大，60 min時達(dá)到了峰值；進(jìn)一步延長反應(yīng)時間，產(chǎn)物的峰面積不再增加，基本保持不變。上述結(jié)果說明，60 min時衍生化反應(yīng)基本完成，因此優(yōu)選60 min為衍生化反應(yīng)時間。

圖6 反應(yīng)時間對香豆素類熒光衍生試劑與氟蟲腈衍生化反應(yīng)效率的影響Fig.6 Influence of reaction time on the derivatization reaction efficiency between fluorescent coumarin derivatization reagent and fipronil

2.4.4 衍生溫度對衍生反應(yīng)效率的影響

溫度是最重要的反應(yīng)條件之一，直接影響衍生化反應(yīng)的速率和效率，同時也對熒光衍生試劑和衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性有一定的影響。為了獲得適合的衍生化反應(yīng)溫度，設(shè)定反應(yīng)時間為60 min，在5～65 ℃范圍內(nèi)對溫度進(jìn)行考察，結(jié)果如圖7所示。在0～45 ℃溫度區(qū)域內(nèi)，衍生產(chǎn)物SF1的峰面積隨溫度的升高而增大；當(dāng)衍生溫度超過45 ℃時，溫度升高會導(dǎo)致衍生效率降低，這可能是熒光衍生試劑和衍生產(chǎn)物在高于45 ℃的反應(yīng)體系中穩(wěn)定性下降所致。王夢等報道了類似研究結(jié)果，45 ℃ 為比較合適的衍生化反應(yīng)溫度。以上結(jié)果表明，45 ℃時衍生效率達(dá)到峰值，因此45 ℃為優(yōu)選衍生化反應(yīng)溫度。

圖7 衍生溫度對香豆素類熒光衍生試劑與氟蟲腈衍生化反應(yīng)效率的影響Fig.7 Influence of derivatization temperature on the derivatization reaction efficiency between fluorescent coumarin derivatization reagent and fipronil

2.4.5 衍生試劑用量對衍生反應(yīng)效率的影響

為了保證熒光衍生化的效率，確保氟蟲腈能夠反應(yīng)完全，需要使用適量的熒光衍生試劑，因此本研究對熒光衍生試劑與氟蟲腈用量比進(jìn)行優(yōu)化。如圖8所示，隨著熒光衍生試劑L1用量的增加，衍生產(chǎn)物SF1的峰面積不斷增大，在用量比達(dá)到11∶1時，反應(yīng)產(chǎn)物不增加，維持在平衡、穩(wěn)定的狀態(tài)。因此，優(yōu)選的用量比（熒光衍生試劑∶氟蟲腈）為11∶1。

圖8 衍生試劑用量對香豆素類熒光衍生試劑與氟蟲腈衍生化反應(yīng)效率的影響Fig.8 Influence of derivatization reagent dosage on the derivatization reaction efficiency between fluorescent coumarin derivatization reagent and fipronil

綜上所述，氟蟲腈衍生化反應(yīng)的優(yōu)選條件如下：EDC/DMAP為催化劑，二氯甲烷為最佳反應(yīng)溶劑，反應(yīng)時間和衍生溫度分別為60 min、45 ℃，熒光衍生試劑用量比為11∶1。檢測色譜圖如圖9所示。

圖9 氟蟲腈柱前衍生化HPLC-FLD色譜圖Fig.9 HPLC-FLD chromatogram showing separation of L1 and SF1

2.5 基于L1建立的氟蟲腈柱前衍生HPLC-FLD檢測回歸方程和檢出限

在前述衍生化試劑合成和衍生化反應(yīng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，建立基于L1的氟蟲腈柱前衍生HPLC-FLD檢測方法，所得線性回歸方程和檢出限如表1所示。

表1 基于L1建立的氟蟲腈柱前衍生HPLC-FLD檢測方法參數(shù)Table 1 Analytical figures of merit of HPLC-FLD method for fipronil determination

由表1可知，檢測回歸方程具有較好的線性相關(guān)性，為0.999 6，檢出限和定量限分別達(dá)到了0.01 μg/L和0.036 μg/L，在氟蟲腈的痕量和微量檢測中具有較好的應(yīng)用前景。

2.6 基于L1建立的氟蟲腈柱前衍生HPLC-FLD檢測方法評價

對基于L1建立的氟蟲腈柱前衍生HPLC-FLD檢測方法的精密度、穩(wěn)定性以及重復(fù)性進(jìn)行評價，結(jié)果見表2。該方法的精密度、穩(wěn)定性以及重復(fù)性3 個指標(biāo)的保留時間的RSD均低于0.4%，峰面積的RSD均低于2.2%。上述結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)所建立的氟蟲腈HPLCFLD檢測方法具有較好的穩(wěn)定性和可靠性，可在實(shí)際檢測中進(jìn)行應(yīng)用。

表2 基于L1建立的氟蟲腈柱前衍生HPLC-FLD檢測方法評價RSD結(jié)果Table 2 Relative standard deviations (RSDs) for precision,stability and repeatability of HPLC-FLD method for fipronil determination %

3 討論

HPLC-FLD靈敏、穩(wěn)定、干擾小，因此被廣泛應(yīng)用于痕量和微量檢測。由于氟蟲腈本身的熒光微弱，不能直接進(jìn)行熒光檢測，因此需要設(shè)計合成能對氟蟲腈進(jìn)行衍生化反應(yīng)的高熒光強(qiáng)度柱前衍生化試劑，從而建立高靈敏度的氟蟲腈HPLC-FLD檢測方法。從已有文獻(xiàn)資料看，目前尚無HPLC-FLD應(yīng)用于氟蟲腈檢測方面的報道。目前氟蟲腈的檢測方法主要有HPLC、HPLCMS/MS、GC以及GC-MS等，但這些方法還存在一些不足。HPLC-MS/MS、GC-MS具有較高的靈敏度，應(yīng)用范圍較廣，但檢測成本相對較高，需要較為貴重的精密儀器，操作人員技能要求較高；HPLC檢測成本低，操作較為簡便，但靈敏度不高，難以達(dá)到痕量檢測的要求。劉煒等建立了土壤中氟蟲腈等6 種農(nóng)藥的HPLC-MS/MS檢測方法，該方法氟蟲腈的定量限為0.01 mg/kg；郭敏等采用GC法測定土壤中氟蟲腈及其代謝物殘留，結(jié)果顯示，氟蟲腈及其代謝物的最低檢測濃度為1 μg/kg；王艷麗等采用負(fù)化學(xué)、電子轟擊技術(shù)聯(lián)用GC-MS法和GC-MS/MS法分別檢測蛋、肉及內(nèi)臟中氟蟲腈殘留，最低檢出限為0.05 μg/kg；本實(shí)驗(yàn)采用香豆素類熒光衍生試劑L1，建立氟蟲腈柱前熒光衍生化檢測方法，其檢出限為0.01 μg/L，定量限為0.036 μg/L，該方法靈敏、穩(wěn)定、可靠，因此具有很好的應(yīng)用前景。

根據(jù)楊子輝等的研究報道，在DCC/DMAP催化下，阿魏酸的羧酸基團(tuán)與氟蟲腈的氨基基團(tuán)容易發(fā)生反應(yīng)。為了制備建立HPLC-FLD檢測方法所需的氟蟲腈熒光衍生化產(chǎn)物，根據(jù)這一文獻(xiàn)，設(shè)計以實(shí)驗(yàn)室前期合成的香豆素-3-羧酸作為熒光衍生試劑、與氟蟲腈進(jìn)行衍生化反應(yīng)的研究方案，反應(yīng)路線如圖10所示。根據(jù)該研究方案，得到衍生化反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)二氯甲烷萃取（3×50 mL）后，再以硅膠柱層析法分離目標(biāo)物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物的純化比較困難，耗時久，產(chǎn)率較低，明顯低于上述文獻(xiàn)報道的76.2%；同時反應(yīng)后體系中極性相近的雜質(zhì)較多，對后續(xù)色譜分離檢測會產(chǎn)生干擾。因此，放棄以該化合物為熒光衍生試劑的研究方案，重新設(shè)計了以4-(二乙氨基)水楊醛為原料合成了熒光衍生試劑L1的方案。在建立和優(yōu)化熒光衍生試劑L1柱前衍生氟蟲腈主要反應(yīng)條件時，實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了大量的探索，曾設(shè)計和嘗試多種方案，最終優(yōu)化出如下反應(yīng)條件：催化縮合劑為EDC/DMAP，反應(yīng)溶劑為二氯甲烷，熒光衍生試劑L1與氟蟲腈的用量比為11∶1，反應(yīng)時間和衍生溫度分別為60 min和45 ℃。優(yōu)化條件下，衍生反應(yīng)效率較高，衍生產(chǎn)物SF1也比較容易純化。

圖10 香豆素-3-羧酸柱前衍生氟蟲腈合成熒光衍生化產(chǎn)物路線Fig.10 Synthesis routes of fluorescent derivative products of fipronil using coumarin-3-carboxylic acid as precolumn derivatization reagent

4 結(jié)論

以4-(二乙氨基)水楊醛為原料，經(jīng)縮合成環(huán)、水解等反應(yīng)合成了一種結(jié)構(gòu)新穎的香豆素類熒光衍生試劑L1，基于L1建立氟蟲腈柱前衍生化反應(yīng)體系，分離、純化、鑒定了衍生產(chǎn)物SF1；優(yōu)化后的柱前衍生條件如下：催化縮合劑為EDC/DMAP，反應(yīng)溶劑為二氯甲烷，熒光衍生試劑L1與氟蟲腈用量比為11∶1，反應(yīng)時間和衍生溫度分別為60 min和45 ℃；在此基礎(chǔ)上，建立氟蟲腈柱前衍生化HPLC-FLD檢測方法，該方法的檢出限達(dá)到了0.01 μg/L，定量限為0.036 μg/L。此外，建立的基于羧基和氨基的柱前衍生化反應(yīng)方法，還可用于其他具有氨基基團(tuán)的待測物的檢測。綜上所述，氟蟲腈柱前衍生化HPLC-FLD檢測方法具有較好的應(yīng)用前景，研究思路和方案對HPLCFLD方法研究具有一定的指導(dǎo)意義。