基于超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定9 種食品基質(zhì)中3 種大麻素

唐慶強(qiáng)，葉 洪，陳 迪，楊 方，曹 丹，薛昆鵬

（1.福州海關(guān)技術(shù)中心，福建 福州 350001；2.三明海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，福建 三明 365001；3.福州國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心，福建 福州 350001；4.榕城海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，福建 福州 350001；5.金華海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，浙江 金華 321001；6.浙江月旭材料科技有限公司，浙江 金華 321001）

大麻素是大麻植物中特有的含烷基及單萜分子結(jié)構(gòu)的一類次生代謝產(chǎn)物，最具代表性的為9-四氫大麻酚（9-tetrahydrocannabinol，9-THC）、大麻二酚（cannabidion，CBD）和大麻酚（cannabinol，CBN）。9-THC因具有使人成癮和致幻的效果，被聯(lián)合國(guó)《1971年精神藥物公約》列為與海洛因、可卡因并列的三大毒品。近年來(lái)，多國(guó)對(duì)大麻的管控政策有所松動(dòng)。然而，過量攝入9-THC對(duì)人體造成的危害和成癮性帶來(lái)的社會(huì)問題是無(wú)法忽視的，許多國(guó)家都對(duì)食品中9-THC進(jìn)行了限量控制。在我國(guó)，雖然云南等部分地區(qū)允許種植9-THC含量＜0.3%的工業(yè)大麻（又稱漢麻、火麻），并將“火麻仁”列入藥食同源產(chǎn)品，但對(duì)包括工業(yè)大麻提取物在內(nèi)的其他大麻制品仍加以嚴(yán)格管控。隨著各類大麻食品走向市場(chǎng)，特別是歐盟、美國(guó)等國(guó)對(duì)飼料用大麻的合法化，使大麻素通過飼料進(jìn)入養(yǎng)殖動(dòng)物，再經(jīng)食品工業(yè)化加工后流入各類食品的可能性大大增加，食品中所含大麻素的來(lái)源更為復(fù)雜、涉及范圍更廣且含量更微。

目前檢測(cè)大麻素的常用方法包括液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等，但針對(duì)的基質(zhì)多為毛發(fā)、血液、尿液和疑似毒品，較少關(guān)注食品中大麻素的檢測(cè)，無(wú)法滿足當(dāng)前國(guó)際上已出現(xiàn)的多種含大麻素食品的現(xiàn)狀。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)照主要國(guó)家對(duì)食品基質(zhì)的要求，選取牛肉、牛奶、橄欖油、蜂蜜、面包、巧克力、大豆、飲料和啤酒這9 種有代表性的食品基質(zhì)，建立基于超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜的方法用于多種食品基質(zhì)中9-THC、CBD和CBN的同時(shí)檢測(cè)，將對(duì)識(shí)別含有大麻素的食品和防范風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

9-THC、CBD、CBN、9-THC-標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度均為0.1 mg/mL） 天津阿爾塔科技有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國(guó)Merck公司；乙酸銨（色譜純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Captiva EMR-Lipid固相萃取柱（100 mg，3 mL）美國(guó)Agilent公司；二乙烯苯--乙烯基吡咯烷酮（HLB）固相萃取柱（60 mg，3 mL） 美國(guó)Waters公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或優(yōu)級(jí)純；實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T 6682—2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》中規(guī)定的一級(jí)水。

火麻仁、火麻籽、火麻茶、火麻糊、火麻油、火麻膏和火麻粉 廣西火麻食品專賣店；牛肉、牛奶、橄欖油、蜂蜜、面包、巧克力、大豆、飲料和啤酒均購(gòu)自當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

Xevo TQD超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源） 美國(guó)Waters公司；3-18K高速離心機(jī)德國(guó)Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：移取適量大麻素標(biāo)準(zhǔn)溶液（9-THC、CBD、CBN），用甲醇稀釋配制成1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，于-20 ℃避光保存。

內(nèi)標(biāo)溶液：移取適量?jī)?nèi)標(biāo)溶液（9-THC-），用甲醇稀釋使其質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL，于-20 ℃避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確移取一定體積的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，用75%甲醇溶液（/）配制成系列質(zhì)量濃度為10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L和200.0 μg/L（分別含50.0 μg/L內(nèi)標(biāo)）的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 樣品提取

橄欖油：稱量2.00 g（精確至0.01 g）樣品于50 mL離心管中，加100 μL 1.0 μg/mL9-THC-內(nèi)標(biāo)溶液和10 mL乙腈，渦旋混勻30 s，50 ℃超聲提取15 min，10 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液待凈化。

大豆、牛肉、面包、蜂蜜、巧克力：稱量2.00 g（精確至0.01 g）樣品于50 mL離心管中，加100 μL 1.0 μg/mL9-THC-內(nèi)標(biāo)溶液和10 mL甲醇，渦旋混勻30 s，50 ℃超聲提取15 min，10 000 r/min離心5 min。取5 mL上清液，加5 mL水稀釋后渦旋混勻，10 000 r/min離心5 min，取全部上清液待凈化。

牛奶：稱量2.00 g（精確至0.01g）樣品于50 mL離心管中，加100 μL 1.0 μg/mL9-THC-內(nèi)標(biāo)溶液、5 g氯化鈉和10 mL甲醇，渦旋混勻30 s，50 ℃超聲提取15 min，再加入1 g三氯乙酸，靜置15～20 min沉淀蛋白質(zhì)后，10 000 r/min離心5 min。取5 mL上清液，加5 mL水稀釋后渦旋混勻，10 000 r/min離心5 min，取全部上清液待凈化。

飲料、啤酒：稱量2.00 g（精確至0.01 g）樣品于50 mL離心管中，加100 μL 1.0 μg/mL9-THC-內(nèi)標(biāo)溶液、5 g氯化鈉和10 mL甲醇，渦旋混勻30 s，50 ℃超聲提取15 min，10 000 r/min離心5 min。取5 mL上清液，加5 mL水稀釋后渦旋混勻后待凈化。

1.3.2.2 樣品凈化

橄欖油：將待凈化液轉(zhuǎn)移至事先用2 mL乙腈活化過的Captiva EMR-Lipid固相萃取小柱中，待其自然重力流出后，用5 mL乙腈淋洗小柱，減壓抽干30 s。上樣和洗脫流速均應(yīng)小于1 mL/min。收集全部流出液，在40 ℃下氮吹至干，加入1 mL 75%甲醇溶液（/），渦旋混勻30 s，超聲3 min，過0.22 μm濾膜后待測(cè)定。

其他樣品：將待凈化液轉(zhuǎn)移至事先用5 mL甲醇和5 mL水活化過的HLB固相萃取小柱中，待其自然重力流出后，用5 mL 50%甲醇溶液（/）淋洗小柱，棄去全部淋洗液并減壓抽干30 s，用5 mL乙腈洗脫小柱。上樣和洗脫流速均應(yīng)小于1 mL/min。收集全部洗脫液，在40 ℃下氮吹至干，加入1 mL 75%甲醇溶液（/），渦旋混勻30 s，超聲3 min，過0.22 μm濾膜后待測(cè)定。

1.3.3 超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜分析

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：10 mmol/L乙酸銨溶液∶甲醇（2∶8，/）；流速：0.2 mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源；正離子模式；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）；毛細(xì)管電壓：3 kV；離子源溫度：350 ℃；霧化氣：氮?dú)?；霧化氣流速：1 000 L/h；碰撞氣：氦氣；碰撞氣流速：50 L/h；其他參數(shù)見表1。

表1 3 種大麻素及內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for three cannabinoids and internal standard

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Masslynx數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集、分析和處理，采用Origin 9.0和Excel軟件進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱和流動(dòng)相的選擇

選取Waters的C（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）、PFP（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）、1-AA（3 mm×75 mm，1.7 μm）、HSS T3（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）色譜柱對(duì)各目標(biāo)物的分離和響應(yīng)情況進(jìn)行比較。結(jié)果表明，使用1-AA、PFP色譜柱時(shí)，9-THC和CBD的分離度不理想，使用梯度法也較難分離。HSS T3色譜柱可以較好地分離9-THC和CBD，但對(duì)3 種大麻及內(nèi)標(biāo)的信號(hào)響應(yīng)值偏低。C色譜柱中3 種大麻及內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)值、保留時(shí)間以及分離度最好。進(jìn)一步比較幾個(gè)不同品牌的C色譜柱，結(jié)果沒有明顯差異。本實(shí)驗(yàn)使用Waters ACQUITY UPLC BEH C色譜柱。

此外，還對(duì)流動(dòng)相的組成進(jìn)行考察，比較用甲醇、乙腈作為有機(jī)相，用0.1%甲酸、10 mmol/L乙酸銨、10 mmol/L乙酸銨+0.1%甲酸作為水相的情況。結(jié)果顯示，用0.1%甲醇作為有機(jī)相時(shí)，3 種大麻及內(nèi)標(biāo)物的信號(hào)響應(yīng)值優(yōu)于乙腈，且乙腈體系下各目標(biāo)物的出峰時(shí)間過早，甲醇體系下的出峰時(shí)間更為合適。以10 mmol/L乙酸銨作為水相時(shí)，各目標(biāo)物的信號(hào)響應(yīng)最好，且等度和梯度洗脫時(shí)各目標(biāo)物的信號(hào)響應(yīng)相當(dāng)，可選擇較為簡(jiǎn)單的等度洗脫。進(jìn)一步比較有機(jī)相體積分?jǐn)?shù)為70%、75%、80%、85%時(shí)各目標(biāo)物的信號(hào)響應(yīng)和分離情況，發(fā)現(xiàn)在80%有機(jī)相條件下，3 種大麻及內(nèi)標(biāo)物有最好的信號(hào)響應(yīng)和分離情況。為獲得更好的信號(hào)響應(yīng)值，還比較了3 種大麻及內(nèi)標(biāo)物用60%、75%、80%甲醇溶液（/）配制后信號(hào)響應(yīng)情況，結(jié)果表明，3 種大麻及內(nèi)標(biāo)物用75%甲醇溶液配制成的標(biāo)準(zhǔn)工作液具有最好的信號(hào)響應(yīng)值，如圖1所示。

圖1 Δ9-THC（a）、CBD（b）、CBN（c）和Δ9-THC-D3（d）MRM色譜圖（200 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作液）Fig.1 MRM chromatograms of Δ9-THC (a),CBD (b),CBN (c),and Δ9-THC-D3 (d) (in mixed standard solution at 200 μg/L)

2.2 提取條件的優(yōu)化

選取甲醇和乙腈這兩種文獻(xiàn)中檢測(cè)大麻最常用的提取溶劑，對(duì)天然含有9-THC、CBD、CBN的火麻油、火麻仁和火麻茶樣品進(jìn)行提取，用峰面積比較提取效果。從圖2a可以看出，乙腈溶劑對(duì)油類樣品中3 種大麻素的提取效果高于甲醇，其他樣品則是甲醇優(yōu)于乙腈。為驗(yàn)證這一結(jié)論，進(jìn)一步使用空白樣品加標(biāo)的方法比較兩種溶劑的提取效果（圖2b），結(jié)果表明，使用乙腈提取油脂類樣品和使用甲醇提取其他種類的樣品時(shí)，提取率均達(dá)到90%以上。

圖2 不同提取溶劑（a、b）和提取方式（c）的提取效果比較Fig.2 Comparison of extraction efficiency of different extraction solvents (a and b) and extraction methods (c)

此外，還比較了不同提取方式的效率，分別比較了渦旋提取、均質(zhì)提取和超聲提取的情況。由圖2c表示，在相同提取時(shí)間下，超聲方式對(duì)3 種大麻素的提取效率均高于90%，優(yōu)于渦旋振蕩和均質(zhì)提取的效率。繼續(xù)對(duì)超聲提取的時(shí)間和溫度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，當(dāng)超聲時(shí)間大于15 min時(shí)，3 種大麻的峰面積基本不再增加，超聲溫度高于50 ℃時(shí)，峰面積趨于穩(wěn)定。因此，本實(shí)驗(yàn)最終選擇用乙腈和甲醇作為油類和其他食品基質(zhì)的提取溶劑，50 ℃超聲15 min的提取方式。

2.3 凈化方法的優(yōu)化

根據(jù)目標(biāo)化合物的極性和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，采用空白樣品加標(biāo)的方式，將中性氧化鋁小柱（Alumina-N）、Captive EMR-Lipid小柱和凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）凈化方法應(yīng)用于橄欖油樣品并進(jìn)行比較。將石墨化炭黑/炭基（Carb/NH）、HLB、石墨化炭黑/硅膠鍵合-丙基乙二胺（GCB/PSA）固相萃取小柱凈化和QuEChERS（PSA+C+檸檬酸鈉+檸檬酸二鈉）基質(zhì)分散萃取凈化方法應(yīng)用于其他基質(zhì)樣品并進(jìn)行比較。

從圖3a可以看出，對(duì)于油類基質(zhì)樣品，Alumina-N小柱回收率一般，EMR小柱和GPC凈化方法都能取得較好的回收率，但GPC凈化操作繁瑣，且需額外增加凝膠滲透色譜儀設(shè)備。由圖3b可知，其他基質(zhì)的樣品中，HLB小柱的回收率明顯優(yōu)于其他類型的小柱。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇EMR、HLB小柱分別作為油類和其他基質(zhì)樣品的凈化小柱。在此基礎(chǔ)上，還進(jìn)一步比較了不同品牌小柱及甲醇、乙腈作為淋洗液和洗脫液時(shí)的情況，并據(jù)此優(yōu)化了淋洗液的體積、體積分?jǐn)?shù)和上柱時(shí)的溶劑組成。結(jié)果表明，使用不同體積的溶液和不同品牌的小柱時(shí)，結(jié)果間存在一定差異，使用5 mL乙腈淋洗Captiva EMR-Lipid小柱和使用5 mL 50%甲醇溶液（/）作為Waters HLB小柱的洗脫液時(shí)，能達(dá)到較好的回收率和凈化效果。

圖3 不同凈化方式對(duì)橄欖油樣品（a）和其他基質(zhì)樣品（b）的凈化效果Fig.3 Comparison of purification efficiency of different purification methods for olive oil sample (a) and other matrix samples (b)

2.4 基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）和定量方法的選擇

不同基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物的影響會(huì)產(chǎn)生不同的ME，進(jìn)而影響結(jié)果的準(zhǔn)確度。參考González等的方法，使用甲醇配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率（）和用空白基質(zhì)配制的相同濃度樣品得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率（）進(jìn)行比較，按ME/%＝（-）/×100計(jì)算各種樣品的ME，并分別比較了內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)法定量時(shí)的ME，如表2所示。

表2 不同樣品的METable 2 ME for different samples %

根據(jù)判斷標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)|ME|＜20%時(shí)為弱ME，當(dāng)20%＜|ME|＜50%時(shí)為中等強(qiáng)度ME，|ME|＞50%時(shí)為強(qiáng)ME。從表2可以看出，使用外標(biāo)法定量時(shí)各種基質(zhì)大多呈現(xiàn)中等強(qiáng)度的ME，而用內(nèi)標(biāo)定量后所有基質(zhì)ME均有所變化，均在弱ME的范圍里，這與同位素內(nèi)標(biāo)具有校準(zhǔn)ME的結(jié)論相符。因此，本實(shí)驗(yàn)使用9-THC-作為內(nèi)標(biāo)，并用內(nèi)標(biāo)法定量各樣品含量。

2.5 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限分析

將3 種大麻素的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，在最優(yōu)前處理和色譜條件下，按質(zhì)量濃度由低到高的順序進(jìn)樣分析。以3 種大麻素化合物及其對(duì)應(yīng)氘代同位素內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而獲得線性方程和相關(guān)系數(shù)（）。如表3所示，3 種大麻素的均不小于0.998，說明其在10.0～200.0 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。在各空白樣品提取、凈化處理后的樣液中添加0.001～0.02 mg/L的3 種大麻素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按優(yōu)化后的儀器條件測(cè)定，以定量離子信噪比為3和10時(shí)的響應(yīng)為方法的檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）。根據(jù)信噪比的結(jié)果，部分種類基質(zhì)樣品的LOD和LOQ可以更低，但考慮到操作上的便捷和使用時(shí)的方便，基于最不靈敏化合物的LOD和LOQ進(jìn)行了統(tǒng)一，3 種大麻素的LOD和LOQ分別為3 μg/kg和10 μg/kg，該LOQ能夠滿足世界各國(guó)對(duì)食品中大麻素的限量要求。

表3 3 種大麻素的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Regression equations,correlation coefficients (R2),LODs and LOQs of three cannabinoids

2.6 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的準(zhǔn)確度和精密度分析

對(duì)不含待測(cè)物的橄欖油、大豆、牛肉、面包、牛奶、蜂蜜、巧克力、啤酒和可樂等9 種空白樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，設(shè)置10.0、20.0、100.0 μg/kg的添加水平，考察方法的準(zhǔn)確度和精密度。由表4可知，3 種大麻素的回收率為71.7%～108.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為4.6%～12.4%，方法準(zhǔn)確度和精密度良好，能滿足分析要求。

表4 3 種大麻素在不同食品中加標(biāo)回收率和RSD（n＝6）Table 4 Recoveries and RSDs of three cannabinoids in different spiked foods (n=6)

續(xù)表4

2.7 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的實(shí)際樣品分析

應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)建立方法對(duì)市場(chǎng)購(gòu)買的16 種火麻食品進(jìn)行測(cè)定，包括火麻茶、火麻油、火麻膏、火麻糊、火麻粉、火麻仁和火麻籽等。由表5可知，大部分樣品中均不同程度地檢出了大麻素，其中火麻油中大麻素的整體含量最高；不同品牌火麻油或火麻茶中3 種大麻素含量差別較大，這可能與原料、產(chǎn)地、大麻籽用量等有關(guān)；但全部樣品的9-THC含量均滿足歐盟或加拿大等主要國(guó)家對(duì)大麻食品中9-THC的限量要求（10 mg/kg）。

表5 實(shí)際樣品中3 種大麻素類化合物含量Table 5 Contents of 3 kinds of cannabinoids in real samples μg/kg

3 結(jié)論

建立了固相萃取-同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，測(cè)定9 種代表性的食品基質(zhì)中3 種大麻素的檢測(cè)方法。建立的方法回收率和精密度良好，線性范圍廣，重復(fù)性好，LOQ能滿足國(guó)內(nèi)外對(duì)食品中大麻素的限制要求，可作為快速的定性和定量分析方法偵測(cè)食品中的大麻素含量。此外，還使用同位素內(nèi)標(biāo)和多種固相萃取小柱凈化，優(yōu)化了多種食品檢測(cè)時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)，從而為我國(guó)開展食品中大麻素類化合物含量的安全評(píng)價(jià)提供技術(shù)支持。