多根多段肋骨骨折對新西蘭兔側肺損傷及生物學指標變化影響研究

黃素偉，張偉巍，逯 娜，張 雁，徐昌富

張家口市第一醫(yī)院 胸外科，河北 張家口 075041

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）多由直接和間接致傷因素導致肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞損傷，造成彌漫性肺間質及肺泡水腫，進而出現(xiàn)急性低氧性呼吸功能不全［1-5］。有研究表明，炎癥因子白細胞介素4（interleukin 4，IL-4）、白細胞介素8（interleukin 8，IL-8）與toll 樣受體4（toll like receptor 4，TLR4）炎性信號通路相關，通過刺激巨噬細胞的激活干預ALI 的進展［6-7］。在急性肺損傷的治療中，IL-4、白細胞介素10（interleukin 10，IL-10）和白細胞介素13（interleukin 13，IL-13）也發(fā)揮重要作用［8］。由此可見，炎癥因子是ALI 的重要生物學標志物，同時有研究表明，炎癥因子可能通過誘導肺部細胞凋亡對ALI進行干預［9-10］。本研究建立新西蘭兔單根多根多段ALI 模型，旨在探討多根多段與單根肋骨骨折ALI 炎癥生物學標志物的變化差異，并分析多根多段肋骨骨折是否會影響肺組織細胞的凋亡?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 60 只8 月齡新西蘭兔，體質量（3.0±0.2）kg，雌雄各30 只，購于北京市海淀興旺動物養(yǎng)殖場［SYXK（京）2019-0054］。所有新西蘭兔月齡相近、體質量相差不超過0.1 kg 雌雄各半。將新西蘭兔隨機分為3 組，對照組、單根組和多根組每組各20 只。本實驗通過醫(yī)院倫理委員會審核。PM7000 心電監(jiān)護儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司），AVlCOMPACT3 型血氣分析儀（瑞士雷度公司），LECA-RM2135 型石蠟切片機（德國萊卡公司），olympus bx40 光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司），KS50R 低速離心機（凱達科學儀器有限公司），680 全自動ELISA 儀（美國BIO-RAD 公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 新西蘭兔模型構建、分組及處理 實驗前，新西蘭兔禁食6 h。用3% 戊巴比妥鈉注射液（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，取仰臥位固定于動物固定臺上，脫去胸部及上腹部兔毛。將單根組新西蘭兔置于BIM-Ⅵ型生物撞擊機下，采用重362.8 g、直徑4.4 cm鋼球自撞擊機鋼管從1.0 m 高處，以自由下落方式撞擊動物右側胸壁處致傷，多根組從1.5 m 高處，以自由下落方式撞擊動物右側胸壁處致傷，對照組僅麻醉不撞擊，連接心電監(jiān)護儀記錄各組新西蘭兔傷前和傷后的呼吸頻率變化。

1.2.2 新西蘭兔血氣分析 在致傷后24 h，用1.0 ml 動脈血氣針抽取各組新西蘭兔股動脈血液樣本0.5 ml，在AVlCOMPACT3 型全自動血氣分析儀上測定肺泡動脈氧分壓（arterial partial pressure of oxygen，PaO2），動脈血二氧化碳分壓（arterial partial pressure of carbon dioxide，PaCO2），血氧飽和度（blood oxygen saturation，SaO2）。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附法檢測炎癥標志物表達 新西蘭兔取動脈血2 ml，4℃下3 000 r/min 離心10 min，收集上清液，分裝到EP 管中，嚴格按照試劑盒說明采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清中IL-4（RAB0301，美國sigma 公司）、IL-8（RAB1110，美國sigma 公司）和IL-10（RAB0802，美國sigma 公司）表達水平，于吸光度450 nm 下進行各樣本吸光度檢測，每個樣本3 個復孔。

1.2.4 蘇木精-伊紅染色法檢測肺病理損傷 取各組新西蘭兔肺組織的石蠟包埋組織，用石蠟切片機切4 μm 厚度切片，60℃烘5 min；二甲苯Ⅰ脫臘20 min，二甲苯Ⅱ脫臘10 min，1/2 二甲苯+1/2 無水乙醇-100%-95%-85%-70%-50% 乙醇各1 min，自來水沖洗15 s；蘇木素染色5 min，自來水沖洗1 min，使切片變藍；1% 鹽酸乙醇分化10 s，自來水沖洗1 min；1% 稀氨水返藍10 s，自來水洗1 min；伊紅染色1 min，自來水洗30 s；依次運用不用濃度的50%、70%、80% 乙醇脫水各1 min，再用95% 乙醇漂色1 min，無水乙醇脫水5 min，最后放入二甲苯Ⅰ3 min，二甲苯Ⅱ3 min；中性樹膠封片后顯微鏡下進行觀察。

1.2.5 蛋白免疫印跡法檢測凋亡標志蛋白表達 取適量肺組織在液氮中研磨并取總蛋白，使用BCA 法測定蛋白濃度，采用5×十二烷基硫酸鈉的蛋白上樣緩沖液在98℃上煮沸10 min 后儲存于-80℃冰箱備用。實驗時將各樣本加入不同的泳道，濃縮膠電壓80 V 10 min，分離膠電壓110 V 2 h，后轉至PVDF 膜，5% 脫脂奶粉封閉2 h。加入特異性一抗B 淋巴細胞瘤-2 基因（B-lymphocytoma-2 gene BCL2）、BCL2-associated X 的蛋白質（BCL2-associated X protein，BAX）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase3）和GAPDH（1∶2 000，bs-0755R，北京Bioss 有限公司）于4℃冰箱過夜。TBST 洗膜3 次，每次5 min，加入特異性二抗，孵育1 h。TBST 洗膜3 次，每次5 min，采用ECL 化學發(fā)光液曝光顯影，使用Photoshop 圖像分析軟件系統(tǒng)進行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用雙尾獨立樣本t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組新西蘭兔的呼吸頻率比較 建模前，3 組新西蘭兔的呼吸頻率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。建模后，與對照組比較，單根組和多根組新西蘭兔呼吸頻率顯著升高，且多根組顯著高于單根組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 3 組新西蘭兔呼吸頻率變化情況比較（，次/min）

表1 3 組新西蘭兔呼吸頻率變化情況比較（，次/min）

注：與對照組比較，①P＜0.05；與單根組比較，②P＜0.05

2.2 各組新西蘭兔骨動脈血氣比較 與對照組比較，單根組和多根組PaO2、SaO2顯著降低，PaCO2顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與單根組比較，多根組PaO2和SaO2顯著降低，PaCO2顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組新西蘭兔動脈血氣變化情況比較（）

表2 各組新西蘭兔動脈血氣變化情況比較（）

注：與對照組比較，①P＜0.05；與單根組比較，②P＜0.05；1 mmHg=0.133 kPa

2.3 各組新西蘭兔血清炎癥因子表達水平比較 與對照組比較，單根組和多根組IL-4、IL-8 和IL-10 表達水平顯著升高，且多根組較單根組升高更明顯，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組新西蘭兔血清炎癥因子表達水平比較（，pg/ml）

表3 各組新西蘭兔血清炎癥因子表達水平比較（，pg/ml）

注：與對照組比較，①P ＜0.05；與單根組比較，②P ＜0.05

2.4 各組新西蘭兔肺病理學比較 與對照組比較，單根組和多根組均出現(xiàn)急性肺損傷表現(xiàn)，肺組織明顯淤血，肺泡萎陷并呈局灶性、梅花樣的肺不張表現(xiàn)，肺組織可見大小不一的不規(guī)則點、片狀出血區(qū)域，切面可見紅色滲液溢出，并伴有炎性細胞浸潤；多根組病理學結果嚴重程度高于單根組，肺泡萎陷增加，出血區(qū)域擴大，炎性細胞浸潤增加，提示多根肋骨骨折造成了嚴重的肺部損傷和肺部細胞凋亡。見圖1。

圖1 各組新西蘭兔肺病理學結果比較（蘇木精-伊紅染色×200）

2.5 各組新西蘭兔肺部組織凋亡信號通路分子的比較 蛋白免疫印跡法檢測結果顯示，與對照組比較，單根組和多根組B 淋巴細胞瘤-2 基因（B-lymphocytoma-2 gene BCL2）-associated X 的 蛋白質（BCL2-associated X protein，BAX）、Casepase3蛋白表達水平顯著上升，BCL2 表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與單根組比較，多根組BAX、Casepase3 蛋白表達水平顯著上升，BCL2 表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組新西蘭兔肺部組織凋亡信號通路分子的比較

3 討論

ALI 的臨床特征為肺容積減少、肺順應性降低、通氣/血流比例失調，伴有進行性低氧血癥和呼吸窘迫，肺部影像學表現(xiàn)為非均一性的滲出性病變［11-12］。胸部撞擊傷致ALI 的致傷機制尚不完全清楚，有研究認為，直接暴力撞擊時強大的外力壓迫胸壁，使胸腔體積迅速縮小，胸腔內壓力快速升高，壓迫肺組織，使其出血、水腫，當外力撤除后，胸廓回彈，在產生胸腔內負壓的同時，受壓肺組織快速復張，加重肺組織原來受損區(qū)域的損傷，過度和失控的炎癥反應導致肺組織發(fā)生繼發(fā)性損傷。炎癥反應及炎性因子釋放在胸部撞擊傷致急性肺損傷的發(fā)展過程中起關鍵的作用，也是肺損傷后病情復雜的重要原因［13-17］。但白細胞介素在創(chuàng)傷造成的多根多段肋骨骨折所致肺損傷中發(fā)揮的作用尚不清晰。本研究結果顯示，單根組和多根組新西蘭兔肺損傷加劇，呼吸頻率顯著升高，PaO2和SaO2顯著降低，PaCO2顯著升高。這提示肺部功能的損傷。結合HE 病理分析，多根組出現(xiàn)肺組織淤血，肺泡萎陷及肺不張等炎性細胞浸潤表現(xiàn)，證實了多根多段肋骨骨折會造成顯著的肺細胞損傷。本研究結果顯示，單根組和多根組新西蘭兔外周血IL-4、IL-8、IL-10 等炎性因子均顯著增加，且多根組顯著高于單根組。這提示炎癥因子的釋放與骨折損傷程度存在一定關系。

BAX 和BCL2 是參與細胞凋亡的重要基因［18］。有研究表明，BAX/BCL2/Caspase9/Caspase3 途徑可以顯著調控非小細胞肺癌癌細胞增殖、凋亡過程，且參與肺癌細胞周期調控［19］。本研究結果顯示，單根組和多根組BAX、Casepase3 蛋白表達水平顯著上升，BCL2 表達水平降低，且多根組各蛋白表達水平的改變程度均高于單根組。這提示，BAX、BCL2 及Caspase3 分子是機械損傷致多根多段肋骨骨折造成肺組織損傷的重要調控因子，其參與了炎性誘導的肺損傷過程。

綜上所述，本研究證實了多根多段肋骨骨折會造成新西蘭兔肺部嚴重病理損傷，炎癥標志物表達水平上升，凋亡標志物表達水平發(fā)生顯著變化，且生物標志物改變水平可能與損傷程度有一定的相關性。