熒光假單胞菌和熱殺索絲菌對(duì)低溫貯藏期間豬肉品質(zhì)變化的影響

周彬靜，劉小花，彭 菁，屠 康，潘磊慶,*，武 杰

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.蚌埠學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，安徽 蚌埠 233030）

肉類食品自身營(yíng)養(yǎng)豐富、水分含量高，是一種高度易腐的食品。微生物是造成豬肉腐敗變質(zhì)的最主要因素之一，由微生物引起的多相污染會(huì)促使肉品腐敗變質(zhì)速率加快，貯藏時(shí)間縮短，品質(zhì)以及安全性下降。引起肉品腐敗變質(zhì)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌的來(lái)源廣泛，種類繁多，所以肉及肉制品的品質(zhì)劣變不易控制。貯藏條件對(duì)腐敗微生物的生長(zhǎng)繁殖、分布和多樣性都有較大的影響，導(dǎo)致豬肉品質(zhì)變化存在很大差異。熒光假單胞菌（）和熱殺索絲菌（）分別是有氧和低氧條件下導(dǎo)致肉和肉制品腐敗的主要優(yōu)勢(shì)菌。熒光假單胞菌是假單胞菌屬（）嗜冷微生物，屬于革蘭氏陰性需氧菌，具有分布廣、數(shù)量多、繁殖快和致腐能力極強(qiáng)的特點(diǎn)，常見(jiàn)于冷鮮肉、海鮮和乳制品中，可導(dǎo)致敗血癥、敗血性休克和血管內(nèi)凝血等疾病。熱殺索絲菌是一種革蘭氏陽(yáng)性嗜冷菌，是氣調(diào)和真空包裝豬肉冷藏過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)微生物。新鮮豬肉和牛肉中的熱殺索絲菌含量非常高，有氧條件下貯藏腐敗的肉類樣品均含有這種菌，且其菌落數(shù)高于6.0（lg（CFU/g））。豬肉加工、運(yùn)輸、貯存和銷(xiāo)售過(guò)程中一旦污染了熒光假單胞菌或熱殺索絲菌，這兩種菌便快速生長(zhǎng)繁殖，逐漸演變?yōu)閮?yōu)勢(shì)菌群，快速分解蛋白質(zhì)和脂肪，產(chǎn)生有毒、有害代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致豬肉腐敗變質(zhì)，食用價(jià)值降低。因此，研究這兩種優(yōu)勢(shì)腐敗菌對(duì)豬肉品質(zhì)變化的影響對(duì)正確合理評(píng)估豬肉品質(zhì)以及其在分配、運(yùn)輸和加工尤其重要。

目前，肉品主要的品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)有微生物、物理、化學(xué)指標(biāo)和感官評(píng)價(jià)指標(biāo)。相比其他品質(zhì)指標(biāo)，感官評(píng)價(jià)存在主觀性較強(qiáng)且不能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)貨架期的缺點(diǎn)，較少使用。微生物主要通過(guò)降解葡萄糖、脂肪和蛋白質(zhì)導(dǎo)致豬肉腐敗變質(zhì)。葡萄糖是微生物最為直接的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其含量變化可反映豬肉的腐敗類型和腐敗速率。微生物最先利用葡萄糖，隨后分解肉品中其他物質(zhì)并產(chǎn)生相應(yīng)代謝物。在微生物和微生物酶的作用下，蛋白質(zhì)和氨基酸等含氮化合物發(fā)生降解，產(chǎn)生氨及胺類等堿性含氮物質(zhì)。此外，微生物的過(guò)度生長(zhǎng)還會(huì)造成脂肪氧化分解，丙二醛（malondialdehyde，MDA）、膽固醇氧化產(chǎn)物以及揮發(fā)性羰基、醇和酸等物質(zhì)含量增加，并產(chǎn)生異常氣味。脂肪氧化又會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)氧化，進(jìn)一步加快腐敗。目前許多研究通過(guò)測(cè)定肉品中的微生物、總糖含量、總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）值、硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值等來(lái)反映肉品的腐敗變質(zhì)程度，進(jìn)而評(píng)估肉品品質(zhì)等級(jí)、新鮮度及貨架期。

本研究以冷卻肉為研究對(duì)象，通過(guò)測(cè)定在4 ℃貯藏條件下豬肉的菌落數(shù)、pH值、總糖含量、TVB-N值、TBARS值、色澤（*、*、*值）、質(zhì)構(gòu)特性、微觀結(jié)構(gòu)來(lái)分析熒光假單胞菌和熱殺索絲菌對(duì)豬肉品質(zhì)的影響，同時(shí)結(jié)合掃描電子顯微鏡觀察豬肉微觀結(jié)構(gòu)的變化，并對(duì)各組指標(biāo)之間進(jìn)行相關(guān)性分析，為冷鮮肉貨架期的預(yù)測(cè)和品質(zhì)控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料與試劑

熒光假單胞菌由課題組前期分離自腐敗豬肉；熱殺索絲菌ACCC 03872 中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

豬肉購(gòu)于南京雨潤(rùn)零售店，為宰后冷卻24 h的豬肉背最長(zhǎng)肌，長(zhǎng)約（60±2）cm、質(zhì)量約1.50 kg，切割后30 min內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、熱殺索絲菌分離（streptomycin thallous acetate actidione，STAA）瓊脂培養(yǎng)基（含STAA添加劑）、假單胞菌瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基、平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基 青島海博科技有限公司；硫酸 南京市化學(xué)試劑股份有限公司；氫氧化鈉 西隴科學(xué)股份有限公司；苯酚、氧化鎂、硫代巴比妥酸 上海麥克林生化科技有限公司；三氯甲烷 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA） 北京索萊寶科技有限公司；戊二醛、1,1,3,3-四乙氧基丙烷 上海源葉生物科技有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；恒溫恒濕培養(yǎng)箱 南京貝蒂實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；CR型便攜式色差計(jì) 日本Minolta公司；UV1800紫外分光光度計(jì)日本島津公司；半微量定氮裝置 南京壽德生物科技有限公司；Testr30 pH計(jì) 新加坡Oakton公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理與接種

豬肉樣品處理與微生物接種參照Gu Xinzhe等的方法。挑取斜面低溫保藏的熒光假單胞菌/熱殺索絲菌接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，30 ℃活化培養(yǎng)24 h，挑取典型單菌落后進(jìn)行劃線培養(yǎng)，30 ℃培養(yǎng)24 h，分別加入10 mL無(wú)菌生理鹽水沖洗營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，收集活化后的熒光假單胞菌和熱殺索絲菌并制成菌懸液，調(diào)整濃度至10～10CFU/mL，備用。挑選大小形態(tài)一致、無(wú)脂肪、無(wú)筋膜、新鮮的冷鮮肉。用75%乙醇溶液擦拭后，紫外燈照射30 min，在無(wú)菌環(huán)境下分割成4 cm×4 cm×1 cm的長(zhǎng)方體。按照料液比1∶1（/）將豬肉樣品分別浸泡在熒光假單胞菌和熱殺索絲菌的菌懸液中，以相同料液比浸泡在無(wú)菌生理鹽水的豬肉作為對(duì)照組。浸泡接種15 s后，取出瀝干多余水分，每塊樣品單獨(dú)置于直徑90 mm的培養(yǎng)皿中，并使用封口膜封口，將盛有豬肉樣品的培養(yǎng)皿置于（4±1）℃、相對(duì)濕度（85±5）%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，每隔24 h取樣，進(jìn)行微生物、pH值、色澤、質(zhì)構(gòu)特性、總糖含量、TVB-N值、TBARS值的測(cè)定。取0 h對(duì)照組豬肉樣品、在4 ℃條件下貯藏216 h的對(duì)照組、接種熒光假單胞菌組、接種熱殺索絲菌組的豬肉樣品進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)觀察。

1.3.2 菌落數(shù)的測(cè)定

在無(wú)菌超凈臺(tái)中取10 g肉樣剪碎，置于裝有90 mL無(wú)菌生理鹽水的均質(zhì)袋中，振搖30 min，選擇2～3 個(gè)合適梯度進(jìn)行稀釋，分別取100 μL涂布于平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基（對(duì)照組）、假單胞菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基（熒光假單胞菌組）和STAA培養(yǎng)基（熱殺索絲菌）上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（48±1）h后記錄菌落數(shù)。

1.3.3 pH值的測(cè)定

分別選取樣品四角及中心的5 個(gè)測(cè)試點(diǎn)，利用Testr30 pH計(jì)測(cè)定pH值。

1.3.4 總糖含量測(cè)定

參照GB/T 9695.31—2008《肉制品 總糖含量測(cè)定》中的分光光度計(jì)法測(cè)定。

1.3.5 TVB-N值測(cè)定

參照GB 5009.228—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》中的半微量凱氏定氮法測(cè)定。

1.3.6 硫代巴比妥酸反應(yīng)物值的測(cè)定

TBARS值的測(cè)定參照J(rèn)ongberg等的方法。稱取5 g切碎的肉樣于離心管中，加入10 mL 7.5 g/100 mL三氯乙酸溶液（含0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）EDTA），振蕩均質(zhì)30 s，12 000 r/min下離心5 min，取2 mL上清液加入盛有2 mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸溶液的試管中，在100 ℃水浴中加熱30 min，溶液顏色變?yōu)榉奂t色。然后室溫冷卻30 min，測(cè)定上層液體在532 nm波長(zhǎng)處的吸光度，同時(shí)以2 mL 7.5 g/100 mL三氯乙酸、2 mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸溶液混合液作為空白對(duì)照。用1,1,3,3-四乙氧基丙烷配制MDA標(biāo)準(zhǔn)溶液，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。TBARS值以1 kg肉樣中所含MDA的質(zhì)量表示，單位為mg/kg。

1.3.7 色澤的測(cè)定

采用CR型便攜式色差計(jì)測(cè)定樣品的亮度（*值）、紅綠度（*值）和黃藍(lán)度（*值）。每個(gè)豬肉樣品選取3 個(gè)測(cè)試點(diǎn)。

1.3.8 質(zhì)構(gòu)特性的測(cè)定

選取硬度、彈性、黏附性和咀嚼性4 個(gè)指標(biāo)表征豬肉的質(zhì)構(gòu)特性。采用A/MORS探頭，觸發(fā)力1 000 N，檢測(cè)速率為120 mm/min，形變量為50%，兩次間隔時(shí)間為2 s，測(cè)試模式為壓縮。

1.3.9 微觀結(jié)構(gòu)的測(cè)定

將0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm的豬肉樣品分別浸于5 mL體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛中24 h后，用不同體積分?jǐn)?shù)（50%、70%、80%、90%）乙醇溶液逐級(jí)脫水，每級(jí)脫水15 min；再用無(wú)水乙醇脫水3 次，每次30 min；最后用叔丁醇置換3 次，每次30 min。將樣品凍干后進(jìn)行黏臺(tái)，采用離子濺射儀噴金，加速電壓為20 kV，通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察肌纖維微觀結(jié)構(gòu)的變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用R 3.6.3軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan法多重比較進(jìn)行顯著性分析，＜0.05表示差異顯著。對(duì)豬肉貯藏過(guò)程中的貯藏時(shí)間、菌落數(shù)、pH、總糖含量、TVB-N值、TBARS值、色澤（*、*、*值）、硬度、彈性、黏附性和咀嚼性進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷藏豬肉菌落數(shù)的變化

微生物的生長(zhǎng)繁殖會(huì)促進(jìn)豬肉的腐敗變質(zhì)，在生產(chǎn)加工過(guò)程中減少微生物的污染，可以減緩品質(zhì)劣變。如圖1所示，在冷藏期間，3 種處理組的豬肉樣品中的菌落數(shù)都呈現(xiàn)上升狀態(tài)，對(duì)照組、接種熒光假單胞菌組和接種熱殺索絲菌組豬肉4 ℃冷藏約96、96、72 h時(shí)達(dá)到微生物腐敗閾值（6.0（lg（CFU/g））），冷藏216 h菌落數(shù)分別上升至8.52、8.83、9.02（lg（CFU/g））。其中，對(duì)照組豬肉樣品在冷藏早期菌落數(shù)增長(zhǎng)量較少，增長(zhǎng)速率低于其他兩組，隨后微生物的菌落總數(shù)快速增長(zhǎng)。而熱殺索絲菌的菌落數(shù)明顯高于其他兩組。這說(shuō)明熱殺索絲菌的生長(zhǎng)速率比其他優(yōu)勢(shì)腐敗菌快，其腐敗能力也可能高于其他微生物。與Andritsos、Reid等研究結(jié)果一致，豬肉中的熱殺索絲菌濃度均比較高。而與其他腐敗菌相比，熱殺索絲菌和熒光假單胞菌在冷藏溫度下的生長(zhǎng)速率具有明顯優(yōu)勢(shì)，可以快速成為豬肉腐敗菌中的優(yōu)勢(shì)菌，并導(dǎo)致豬肉腐敗變質(zhì)及貨架期縮短。

圖1 不同微生物對(duì)冷藏期間豬肉中菌落數(shù)的影響Fig. 1 Effects of inoculation with different spoilage bacteria on total microbial counts in chilled pork during storage

2.2 冷藏豬肉pH值的變化

如圖2所示，豬肉冷藏48 h期間，pH值呈現(xiàn)波動(dòng)變化，隨后pH值隨著冷藏時(shí)間延長(zhǎng)明顯上升。接種熱殺索絲菌豬肉樣品的pH值在冷藏48 h時(shí)與其他兩組出現(xiàn)顯著性差異（＜0.05），pH值的升高速率高于其他兩組，于冷藏216 h升高至6.38?？瞻讓?duì)照組和接種熒光假單胞菌的豬肉樣品的pH值升高較為緩慢，差異不顯著（＞0.05）。冷藏期間豬肉的pH值變化主要與微生物對(duì)肌糖原的酵解速率和蛋白質(zhì)的分解速率有關(guān)。微生物菌群與生長(zhǎng)繁殖速率對(duì)豬肉pH值有影響，在微生物作用下發(fā)生的蛋白水解反應(yīng)導(dǎo)致堿性化合物增多，pH值升高。由此可知，熱殺索絲菌的蛋白水解能力高于其他微生物菌群，其生長(zhǎng)速率高于熒光假單胞菌，這可能與不同微生物在低溫貯藏時(shí)的生長(zhǎng)狀態(tài)有關(guān)。

圖2 不同微生物對(duì)冷藏期間豬肉pH值的影響Fig. 2 Effects of inoculation with different spoilage bacteria on pH of chilled pork during storage

2.3 冷藏豬肉總糖含量的變化

在任何包裝條件下冷藏的肉類食品中，大多數(shù)細(xì)菌將逐步分解葡萄糖、乳酸、丙酮酸、葡萄糖酸、乙酸、氨基酸、核糖、甘油等，葡萄糖是大多數(shù)細(xì)菌最為直接的能量來(lái)源，是首選底物。因此，可以通過(guò)豬肉中總糖含量的變化體現(xiàn)豬肉的前期腐敗。如圖3所示，新鮮豬肉的初始總糖含量在0.60～0.62 mg/100 g之間。在豬肉冷藏期間，總糖含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。接種假單胞菌和熱殺索絲菌的豬肉中葡萄糖含量下降速率均快于對(duì)照組，熱殺索絲菌處理組下降得最快。熱殺索絲菌和熒光假單胞菌都會(huì)優(yōu)先分解葡萄糖和乳酸，導(dǎo)致豬肉中總糖含量下降。貯藏過(guò)程中葡萄糖含量的變化與微生物數(shù)相關(guān)，通過(guò)測(cè)定豬肉中總糖含量，可以及時(shí)了解微生物的生長(zhǎng)狀況、豬肉的腐敗類型和腐敗速率。

圖3 不同微生物對(duì)冷藏期間豬肉中總糖含量的影響Fig. 3 Effects of inoculation with different spoilage bacteria on total sugar content of chilled pork during storage

2.4 冷藏豬肉TVB-N值的變化

TVB-N是指食品在發(fā)生腐敗變質(zhì)過(guò)程中，由于蛋白質(zhì)和其他含氮化合物的降解而產(chǎn)生的有機(jī)胺等揮發(fā)性含氮物質(zhì)。如圖4所示，豬肉TVB-N值隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。其中，接種熱殺索絲菌豬肉樣品的TVB-N值增長(zhǎng)速率較快，接種熒光假單胞菌豬肉樣品的TVB-N值呈現(xiàn)較為緩慢的上升趨勢(shì)。接菌豬肉樣品TVB-N值的增長(zhǎng)速率均高于對(duì)照組，并分別于冷藏168 h和216 h達(dá)到GB 2707—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 鮮（凍）畜、禽產(chǎn)品》規(guī)定的腐敗閾值（15 mg/100 g）。以上表明，這兩種腐敗微生物均會(huì)加快豬肉在冷藏過(guò)程中蛋白質(zhì)的氧化和降解，對(duì)照組豬肉樣品的TVB-N值在冷藏期間上升緩慢，也從側(cè)面反映出豬肉中TVB-N值變化會(huì)受到腐敗微生物種類和酶活性的影響。Saenz-Garcia等研究表明貯藏期間接種假單胞菌和熱殺索絲菌雞肉樣品的TVB-N值遠(yuǎn)高于其他腐敗菌，表明假單胞菌和熱殺索絲菌都具有很強(qiáng)的分解蛋白質(zhì)能力。

圖4 不同微生物對(duì)冷藏期間豬肉中TVB-N值的影響Fig. 4 Effects of inoculation with different spoilage bacteria on TVB-N value of chilled pork during storage

2.5 冷藏豬肉TBARS值的變化

在肉及肉制品中，TBARS值是常用的檢測(cè)脂質(zhì)過(guò)氧化的指標(biāo)，可用于評(píng)價(jià)肉類貯藏過(guò)程中脂質(zhì)氧化的程度。TBARS是由自由氧化的第二階段引起的，其中過(guò)氧化物被氧化成醛和酮等。如圖5所示，各組樣品的起始TBARS值都低于0.5 mg/kg，隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，TBARS值不斷上升且冷藏后期的變化程度更大。這意味著在冷藏后期脂肪氧化分解成醛、酮等物質(zhì)的速率加快，豬肉的脂肪氧化程度加劇，進(jìn)一步加劇了豬肉的腐敗變質(zhì)。接種熱殺索絲菌豬肉樣品的TBARS值升高速率最快，并能通過(guò)嗅覺(jué)聞到異味。當(dāng)TBARS值高于0.5 mg/kg時(shí)，豬肉由于脂肪氧化而產(chǎn)生的腐臭異味可以被感知。這是TBARS值通常被用作氧化過(guò)程中早期外觀和分析方法的敏感性指標(biāo)的原因之一。假單胞菌屬分解脂肪的能力強(qiáng)，但熱殺索絲菌的生長(zhǎng)速率明顯高于假單胞菌，因此在冷藏后期，接種熱殺索絲菌組和接種熒光假單胞菌組豬肉的TBARS值差異不顯著（＞0.05）。在豬肉生產(chǎn)加工貯藏過(guò)程中，可以通過(guò)減少微生物數(shù)量尤其是具有強(qiáng)脂肪氧化能力的微生物數(shù)量，以延緩豬肉脂肪氧化變質(zhì)的進(jìn)程。

圖5 不同微生物對(duì)冷藏期間豬肉中TBARS值的影響Fig. 5 Effects of inoculation with different spoilage bacteria on TBARS value of chilled pork during storage

2.6 冷藏豬肉色澤的變化

豬肉的色澤也是消費(fèi)者用來(lái)評(píng)估肉類質(zhì)量和可接受性的重要指標(biāo)之一。如表1所示，不同處理與冷藏時(shí)間對(duì)豬肉的色澤（*、*、*值）有很大影響。冷藏過(guò)程中，所有實(shí)驗(yàn)組豬肉樣品的*值都呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，但各組*值達(dá)到最高值的時(shí)間不同。對(duì)照組、接種熒光假單胞菌組、熱殺索絲菌組的豬肉樣品的*值分別在120、96、72 h達(dá)到最高值，分別為46.33、45.98、44.83。3 組樣品的*值在前期并沒(méi)有發(fā)生較為明顯的變化，而與冷藏0 h相比，冷藏216 h豬肉樣品的*值下降。樣品在冷藏前期*值可能呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。這樣的變化與陳曉亮等的研究結(jié)果一致。這主要是因?yàn)樵诶洳厍捌?，豬肉與空氣中的氧氣接觸，在一些蛋白酶作用下產(chǎn)生氧合肌紅蛋白，使豬肉樣品在短時(shí)間內(nèi)保持原有色澤，進(jìn)而促使豬肉樣品的*值增加。但是由于豬肉在隨后的冷藏過(guò)程中會(huì)發(fā)生腐敗變質(zhì)，產(chǎn)生氧化肌紅蛋白，豬肉樣品的顏色變暗，故*值下降。其中，接種熱殺索絲菌的豬肉樣品*值下降的趨勢(shì)較為明顯。各組豬肉樣品的*值于冷藏0～24 h呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，隨后上升幅度略微減小。*值與脂肪氧化有關(guān)，*值升高，一方面與樣品的脂肪氧化有關(guān)；另一方面的原因是在微生物的作用下形成了硫化肌紅蛋白。*值增加也說(shuō)明豬肉的品質(zhì)進(jìn)一步降低。

表1 接種不同腐敗菌對(duì)冷藏豬肉色澤的影響Table 1 Effects of inoculation with different spoilage bacteria on the color characteristics of chilled pork during storage

2.7 冷藏豬肉的質(zhì)構(gòu)變化

如圖6所示，3 種處理對(duì)冷藏豬肉質(zhì)構(gòu)特性影響較小，豬肉在冷藏期間質(zhì)構(gòu)特性變化波動(dòng)不大。豬肉樣品各質(zhì)構(gòu)特性測(cè)定值的標(biāo)準(zhǔn)差較大，主要受豬肉樣品個(gè)體差異大的影響。在冷藏前期，豬肉中的蛋白質(zhì)被分解，內(nèi)部結(jié)構(gòu)被破壞，硬度下降；冷藏后期豬肉的水分流失，導(dǎo)致硬度增加。豬肉樣品的彈性隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢(shì)。彈性下降與微生物生長(zhǎng)繁殖所引起的蛋白質(zhì)降解從而使肌纖維結(jié)構(gòu)受到破壞有關(guān)。豬肉的黏附性沒(méi)有明顯的變化趨勢(shì)，但可以看到黏附性在冷藏216 h時(shí)遠(yuǎn)高于0 h，表明冷藏后期豬肉樣品的黏附性會(huì)增加，這與豬肉樣品中微生物生長(zhǎng)所產(chǎn)生的黏液有很大關(guān)系，微生物生長(zhǎng)繁殖速率越快，分泌的代謝產(chǎn)物越多，豬肉樣品表面的黏液也越多，豬肉腐敗也越快。3 種處理下豬肉樣品咀嚼性都隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)先降低后升高，咀嚼性與豬肉硬度和彈性緊密相關(guān)。

圖6 不同微生物對(duì)冷藏期間豬肉中質(zhì)構(gòu)特性的影響Fig. 6 Effects of inoculation with different spoilage bacteria on the textural properties of chilled pork during storage

2.8 冷藏豬肉微觀結(jié)構(gòu)的變化

微生物的生長(zhǎng)不僅僅局限于豬肉樣品的表面，會(huì)由外向內(nèi)深入到豬肉內(nèi)部，隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，微生物在肌纖維表面大量繁殖，對(duì)肌纖維產(chǎn)生不同程度的破壞。如圖7所示，在新鮮豬肉的里脊部分，肌纖維排列疏松，為交錯(cuò)網(wǎng)狀，紋理清楚，且表面沒(méi)有可見(jiàn)的微生物菌落。經(jīng)過(guò)不同處理冷藏216 h后，肌纖維的結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的變化。冷藏216 h對(duì)照組豬肉的肌原纖維蛋白粗絲、細(xì)絲存在相互橋聯(lián)，表面可以觀察到桿狀或偏橢球形的菌落形態(tài)。而接種熒光假單胞菌豬肉的肌纖維交錯(cuò)更為錯(cuò)亂，存在大量肌纖維黏附成塊的現(xiàn)象，這主要與蛋白質(zhì)降解有關(guān)。肌束膜通常由90%以上的膠原蛋白組成，冷藏過(guò)程中膠原蛋白存在溶解現(xiàn)象。在微生物酶和肌肉內(nèi)源性酶的作用下，肌纖維間的結(jié)合脂類及構(gòu)成肌絲的蛋白質(zhì)被分解，從而改變肌肉的組織結(jié)構(gòu)及理化特性。接種熱殺索絲菌的豬肉樣品肌纖維之間連接發(fā)生崩解，有明顯的短橫，且斷面之間被微生物填充，并且肌纖維表面的菌落數(shù)量多，且形態(tài)單一。微生物產(chǎn)生的代謝物質(zhì)也會(huì)黏附在肌纖維表面，使肌纖維的黏附性增大，排列結(jié)構(gòu)變得模糊。綜上，微生物繁殖會(huì)對(duì)豬肉肌纖維產(chǎn)生不同程度的破壞，進(jìn)一步影響豬肉的質(zhì)構(gòu)。

圖7 4 ℃下貯藏豬肉肌纖維的掃描電子顯微鏡圖Fig. 7 Scanning electron micrographs of pork muscle fibers stored at 4 ℃

2.9 冷藏豬肉各品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性分析

如圖8所示，3 組不同處理豬肉樣品的冷藏時(shí)間與菌落數(shù)、pH值、總糖含量、TVB-N值、TBARS值均呈現(xiàn)極顯著相關(guān)（＜0.01），表明菌落數(shù)、pH值、總糖含量、TVB-N值、TBARS值都可作為評(píng)價(jià)豬肉貨架期的指標(biāo)。其中，冷藏時(shí)間與菌落數(shù)的相關(guān)性最強(qiáng)，3 種處理組相關(guān)系數(shù)均在0.98以上，表明菌落數(shù)的變化可以及時(shí)反映冷藏時(shí)間，應(yīng)用于貨架期的準(zhǔn)確預(yù)測(cè)，進(jìn)而提高食品的安全性。在3 種處理組中，其他幾種指標(biāo)與冷藏時(shí)間關(guān)聯(lián)程度的次序存在差異，僅從豬肉單一品質(zhì)指標(biāo)變化的角度去判斷冷卻肉的品質(zhì)及貨架期可能會(huì)存在誤差。這主要是在特定環(huán)境下，豬肉中的主要腐敗微生物不同，引起葡萄糖水解、蛋白質(zhì)分解和脂肪氧化分解速率與程度存在差異。熒光假單胞菌和熱殺索絲菌都具有較強(qiáng)的蛋白分解能力，所引起的TVB-N值、pH值的變化相比對(duì)照組會(huì)更明顯，與冷藏時(shí)間相關(guān)性也更強(qiáng)。因此，在不知道具體微生物污染情況下，利用微生物指標(biāo)建立貨架期預(yù)測(cè)模型更為合理準(zhǔn)確。但在能明確豬肉污染特定某些菌，如假單胞菌屬、熱殺索絲菌、變形桿菌屬等蛋白質(zhì)分解菌的情況下，利用TVB-N值、pH值等指標(biāo)建立豬肉貨架期模型也是合理的。此外，豬肉在冷藏期間腐敗變質(zhì)會(huì)引起不同化學(xué)指標(biāo)和物理指標(biāo)的變化，綜合考慮菌落數(shù)、pH值、色澤和脂肪氧化等多指標(biāo)可以更為準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)預(yù)測(cè)冷藏過(guò)程中豬肉的貨架期。

圖8 冷藏期間豬肉各品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果Fig. 8 Correlation analysis amongquality indicators of chilled pork during storage

冷藏時(shí)間與豬肉物理品質(zhì)的相關(guān)性較差，這表明僅從質(zhì)構(gòu)特性和色澤（*、*、*）等方面不能較好地評(píng)價(jià)豬肉的新鮮度、貨架期等指標(biāo)。在3 個(gè)處理組中，冷藏時(shí)間與*、*、*值相關(guān)性較低，即色澤無(wú)法很好地表現(xiàn)肉品的冷藏時(shí)間；各組冷藏時(shí)間與彈性相關(guān)性均較低，與硬度、黏附性、咀嚼性的相關(guān)性不同處理組之間存在差異，這可能與不同微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物等有關(guān)。

3 個(gè)處理組中菌落數(shù)與豬肉中的TVB-N值、TBARS值、pH值呈現(xiàn)較強(qiáng)的正相關(guān)，而與總糖含量、硬度以及咀嚼性的負(fù)相關(guān)性較強(qiáng)，其中菌落數(shù)與總糖含量間相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值均高于0.95。這與大量已報(bào)道的結(jié)果一致，菌落數(shù)變化確實(shí)可以通過(guò)總糖含量反映。3 個(gè)處理組中菌落數(shù)與其他指標(biāo)的相關(guān)性存在差異。熱殺索絲菌組菌落數(shù)與pH值、總糖含量、TVB-N值、TBARS值的相關(guān)性都呈現(xiàn)極顯著相關(guān)（＜0.01），分別為0.98、-0.95、0.93、0.97。在4 ℃下熱殺索絲菌相比其他腐敗菌，生長(zhǎng)繁殖速率快，菌體數(shù)量多，對(duì)豬肉中葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗大。而熒光假單胞菌組菌落數(shù)與pH值、總糖含量、TVB-N值、TBARS值的相關(guān)性分別為0.91、-0.98、0.96、0.84。對(duì)于其他物理指標(biāo)，*值、*值、硬度、咀嚼性均分別與菌落數(shù)、pH值、總糖含量、TVB-N值、TBARS值有較強(qiáng)的相關(guān)性，說(shuō)明豬肉的物理指標(biāo)是多種因素綜合作用的結(jié)果，尤其是蛋白質(zhì)、脂肪和總糖含量的變化對(duì)豬肉物理品質(zhì)變化影響更大，由熱殺索絲菌和假單胞菌導(dǎo)致的豬肉品質(zhì)變化雖有差異但相近，都是通過(guò)糖代謝、氨基酸代謝、脂肪代謝途徑導(dǎo)致豬肉品質(zhì)快速發(fā)生變化。

此外，總糖含量、TVB-N值、TBARS值之間的相關(guān)性也較強(qiáng)，表明豬肉腐敗變質(zhì)過(guò)程中的糖分降解、脂肪氧化以及蛋白質(zhì)氧化是相互影響的。吳寶森等研究認(rèn)為，氨基酸、蛋白質(zhì)的代謝與葡萄糖和脂肪酸的代謝密切相關(guān)，微生物會(huì)作用于豬肉中各組分，產(chǎn)生短鏈脂肪酸、羰基化合物、生物胺等物質(zhì)，影響肉制品品質(zhì)。

3 結(jié) 論

豬肉冷藏過(guò)程中菌落數(shù)、pH值、TVB-N值、TBARS值等隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)而上升，而總糖含量、*值、*值、硬度、咀嚼性等整體呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，微生物菌落數(shù)與冷藏時(shí)間呈極顯著相關(guān)（＜0.01），相關(guān)系數(shù)均大于0.98，是影響豬肉品質(zhì)的重要因素?？偺呛?、TVB-N值、TBARS值、pH值與菌落數(shù)之間具有良好的相關(guān)性，即微生物生長(zhǎng)會(huì)伴隨著豬肉中蛋白質(zhì)、脂肪、糖類化合物等物質(zhì)的變化。不同微生物之間的腐敗能力會(huì)有所差異，其中熱殺索絲菌對(duì)豬肉的致腐能力高于假單胞菌，可導(dǎo)致肌纖維發(fā)生斷裂和崩解，肌原纖維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。綜上所述，相比其他理化指標(biāo)，菌落數(shù)更適合作為構(gòu)建豬肉貨架期預(yù)測(cè)模型的指標(biāo)。