超聲波聯(lián)合殺菌劑殺菌的研究進展

李銀匯，王文駿,2,3，呂瑞玲,2，劉東紅,2,3,*

（1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058；2.浙江大學(xué)寧波研究院，浙江 寧波 315100；3.浙江大學(xué)馥莉食品研究院，浙江 杭州 310058）

食品安全問題關(guān)系人類生命健康，對于如何降低食品安全風(fēng)險，不同時期的研究人員有不同的研究策略。傳統(tǒng)的熱加工容易破壞食品原有風(fēng)味甚至產(chǎn)生苯并芘等致癌物質(zhì)，家禽等在養(yǎng)殖過程中使用的抗生素若造成殘留則會促進耐藥菌的產(chǎn)生，它們對傳統(tǒng)熱加工有更高的耐受性。現(xiàn)階段的食品加工處理傾向于最大限度保留食品的風(fēng)味、營養(yǎng)、色澤，并保證食品微生物安全達標(biāo)，因此非熱加工技術(shù)受到了越來越多的關(guān)注。

超聲波是一種超出人耳聽覺范圍、頻率高于20 kHz的機械波。目前研究中常用超聲波可以按頻率高低分為：低頻超聲（也稱功率超聲，20～100 kHz）、高頻超聲（100 kHz～10 MHz），其中高頻超聲包含診斷超聲（5～10 MHz）。作為一種新興的非熱加工技術(shù)，超聲波因其無殘留、可自動化、設(shè)備相對簡單等特點被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、距離測量、食品加工、材料切割等領(lǐng)域。

研究發(fā)現(xiàn)超聲波具有一定的殺菌效果，但單獨使用的效果有限。而超聲波與其他殺菌技術(shù)聯(lián)用的柵欄技術(shù)在提高殺菌效果方面有顯著的積極作用。殺菌劑具有殺菌譜廣、價格低廉等優(yōu)勢，有最廣泛的工業(yè)應(yīng)用基礎(chǔ)，但殺菌劑也存在易產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物、滲透性差等問題。實際上，超聲波和殺菌劑的聯(lián)用具有良好的協(xié)同殺菌效果，不僅可以減少殺菌劑的用量從而減少化學(xué)殘留和有毒有害物質(zhì)的生成，還可以縮短殺菌處理時間，在實際生產(chǎn)中具有巨大的應(yīng)用潛力。本文綜述超聲波空化效應(yīng)、超聲波與殺菌劑聯(lián)用的殺菌機理和影響因素，以及它們在食品領(lǐng)域的應(yīng)用，旨在為進一步研究基于超聲波與殺菌劑的聯(lián)用技術(shù)提供參考。

1 超聲波空化效應(yīng)

空化閾值即發(fā)生超聲空化需要的最小聲壓，當(dāng)超聲波在液體介質(zhì)中傳播時，由于周期性的正負壓交替，施加的聲壓超過空化閾值，液體介質(zhì)內(nèi)分子間的吸引力不足以維持分子間距，導(dǎo)致分子之間產(chǎn)生空隙而形成空腔，當(dāng)空腔中氣體足夠多時便形成了空化泡，空化泡在振蕩過程中經(jīng)整流擴散逐漸長大，直至臨界尺寸時迅速崩潰，該過程即超聲空化?？栈莸谋罎⒂袃煞N類型，即穩(wěn)態(tài)空化和瞬時空化。穩(wěn)態(tài)空化發(fā)生在較小的聲壓條件下，空化泡一般不發(fā)生激烈的崩潰，當(dāng)其非線性振蕩較為強烈時，穩(wěn)態(tài)空化泡周圍的液體隨之運動，伴有強剪切力。瞬時空化一般發(fā)生在聲壓足夠大時，瞬時空化泡被壓縮至極致，在反彈的過程中發(fā)生內(nèi)爆，形成許多小空化泡，伴有剪切力、沖擊波、微射流等物理效應(yīng)，并產(chǎn)生局部高溫（約5 000 K）和高壓，生成自由基等高氧化活性物質(zhì)，引發(fā)隨后的一系列化學(xué)反應(yīng)，這些作用最終導(dǎo)致細菌失活。

空化效應(yīng)即氣泡成核作用，在聲壓幅值的負壓相超過空化閾值時發(fā)生。由于氣體溶解度與壓力成正比，負壓下溶解在液體中的氣體達到過飽和狀態(tài)，不能再溶解，就會產(chǎn)生許多氣泡。成核后，空化泡開始生長直至破裂（圖1），頻率在很大程度上決定了該過程的長短，研究表明空化泡的壽命會隨著頻率的增加而降低，由213 kHz時的0.35 ms降低到1 062 kHz時的0.10 ms?？栈?yīng)作為超聲的反應(yīng)核心，會引起一系列物理化學(xué)現(xiàn)象，本文著重介紹超聲穿孔、聲化學(xué)、聲致發(fā)光現(xiàn)象。

圖1 超聲空化泡生長周期示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the growth cycle of ultrasonic cavitation bubbles

1.1 超聲穿孔

超聲穿孔現(xiàn)象，即超聲波產(chǎn)生的機械應(yīng)力使細胞膜滲透性瞬時可逆地增加形成孔穴的現(xiàn)象。超聲穿孔主要與空化泡崩潰前的周期性振蕩、崩潰后產(chǎn)生的剪切應(yīng)力有關(guān)（圖2）。這些孔的直徑從幾十納米到幾百納米不等，小分子可以通過這些瞬時孔被動擴散進出細胞?？茖W(xué)研究已經(jīng)在形態(tài)學(xué)上觀察到高強度低頻的超聲波處理細菌會導(dǎo)致孔的形成，低強度高頻超聲波則沒有明顯損傷。聲穿孔現(xiàn)象在藥物遞送、食品微生物殺菌等領(lǐng)域研究較多。例如，陳麗娟等利用超聲（1 MHz）結(jié)合微泡可逆地有限開放腦膠質(zhì)瘤血腦屏障，對腦組織無明顯損傷。楊梅利用高強度聚焦超聲誘導(dǎo)小鼠皮膚形成微孔，實現(xiàn)了經(jīng)皮遞送乙肝疫苗。Khadhraoui等研究了超聲波提取迷迭香葉片中迷迭香酸的機理，結(jié)果表明超聲波可能通過包括超聲穿孔在內(nèi)的6 個鏈解構(gòu)機制中發(fā)揮作用。

圖2 超聲穿孔示意圖Fig. 2 Schematic diagram of sonoporation

1.2 聲化學(xué)

聲化學(xué)即由聲空化產(chǎn)生自由基并引發(fā)一系列次級化學(xué)反應(yīng)的效應(yīng)。Suslick將聲化學(xué)廣義地分為同質(zhì)、異質(zhì)兩類，前者涉及鍵斷裂或自由基形成導(dǎo)致的化學(xué)反應(yīng)，后者代表由增強的傳質(zhì)作用而提高化學(xué)反應(yīng)性的聲化學(xué)效應(yīng)。自由基產(chǎn)率是聲化學(xué)效應(yīng)中的重要部分，盡管單個空化泡中產(chǎn)生的自由基數(shù)量與頻率呈負相關(guān)趨勢，但在整個反應(yīng)體系內(nèi)的自由基產(chǎn)率是先隨頻率升高而后再下降的，因為在反應(yīng)體系內(nèi)，當(dāng)頻率升高時，空化泡的壽命變短，其內(nèi)的自由基將遷移至氣泡外從而引發(fā)產(chǎn)生更多的自由基。除自由基的含量外，過氧化氫、氧氣的含量等都會影響聲化學(xué)效應(yīng)的強弱，故常用反應(yīng)分子物質(zhì)的量與超聲波能量的比值來反映聲化學(xué)效應(yīng)的強弱，單位為mol/J。

大量研究表明聲化學(xué)效應(yīng)在200～300 kHz最強。另外，聲化學(xué)效應(yīng)的強弱還取決于空化泡內(nèi)部溫度、空化閾值、空化泡數(shù)量、空化泡壽命等因素。一方面，根據(jù)氣泡動力學(xué)，隨著聲波頻率的增加，空化泡崩潰時達到的最高溫度下降；空化閾值隨頻率的增大而增大，使得非均勻聲場中產(chǎn)生空化泡的活躍區(qū)域變窄，這兩個因素導(dǎo)致聲化學(xué)效應(yīng)變?nèi)?；另一方面，隨著超聲波頻率的增加，波長變短，對應(yīng)的活躍區(qū)間隔也變短，駐波場中的空化泡密度增加；空化泡的壽命在高頻率聲場中變短，更多自由基可以從空化泡中逸出，與介質(zhì)中的其他物料發(fā)生反應(yīng)，這兩個因素導(dǎo)致聲化學(xué)效應(yīng)增強。

1.3 聲致發(fā)光

聲致發(fā)光是指超聲過程中空化泡破裂瞬間產(chǎn)生高溫高壓導(dǎo)致的閃光現(xiàn)象。聲致發(fā)光可以分為單氣泡聲致發(fā)光和多氣泡聲致發(fā)光。前者是由單個穩(wěn)定振蕩的氣泡在駐波的波腹處發(fā)生的閃光，它源于空化泡坍塌時內(nèi)部的發(fā)射的等離子體；后者是是由液體中的許多空化泡共同產(chǎn)生的閃光，它不僅源于內(nèi)部等離子體發(fā)射，還包括空化泡坍塌時發(fā)生的化學(xué)發(fā)光，但仍存在爭議。

聲致發(fā)光產(chǎn)生的閃光可以催化金屬氧化物等聲敏劑產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）從而發(fā)揮抗菌作用。Zhang Lingling等利用ZnO納米流體與超聲波聯(lián)用處理大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)超聲波的存在誘導(dǎo)了更多ROS的產(chǎn)生，同時還可以分散聚集的ZnO，促進ZnO粒子產(chǎn)生自由基。較低的頻率和較高的功率密度下抑菌效果更好，這可能是由于在這些情況下坍塌的空化泡有更多的勢能，而這些勢能將促進化學(xué)反應(yīng)的進行以及轉(zhuǎn)化為熱、光和聲能，進一步催化聲敏劑來起到殺菌效果。但若聲敏劑的吸收光譜范圍與超聲波產(chǎn)生的瞬時閃光的光譜范圍沒有較好重疊，則有可能削弱兩者聯(lián)用的效果，這還有待進一步的研究證明。

2 殺菌劑及其與超聲波聯(lián)用的殺菌機理

超聲波與殺菌劑聯(lián)用時，主要通過以下途徑起殺菌作用：一是超聲波可以將團聚的細菌細胞簇打散，有助于殺菌劑接近細胞表面而提高殺菌效率，同時，超聲波本身的機械剪切、熱效應(yīng)和聲化學(xué)效應(yīng)也可以破壞細菌；二是超聲波可以提高化學(xué)試劑的滲透效率，使化學(xué)試劑更易滲透到細胞內(nèi)部而提高殺菌效率；三是超聲波可以通過誘導(dǎo)部分殺菌劑生產(chǎn)更多具有殺菌活性的物質(zhì)來提升殺菌效率。常見的殺菌劑主要有含氯試劑、過氧化物、季銨化合物（quaternary ammonium compounds，QACs）等，各項聯(lián)用技術(shù)的殺菌機理總結(jié)如圖3所示，下面具體分小節(jié)展開討論。

圖3 超聲波聯(lián)合殺菌劑的殺菌機理Fig. 3 Mechanism of microbial killing by combined treatment of ultrasound with bactericides

2.1 含氯試劑

含氯試劑具有殺菌譜廣、生產(chǎn)成本低、應(yīng)用范圍廣等特點，常見的含氯試劑有氯氣、次氯酸鈉、次氯酸鈣、二氧化氯、次氯酸以及微酸性電解水等含氯混合物。含氯殺菌劑能穿過細胞壁進入細胞內(nèi)，同時釋放ROS，導(dǎo)致蛋白質(zhì)側(cè)鏈氧化和去折疊化，并與核酸發(fā)生反應(yīng)導(dǎo)致氧化損傷。超聲波單獨使用時，其振動過程產(chǎn)生的機械作用可以促進細菌、生物被膜從果蔬等產(chǎn)品表面脫離，減少產(chǎn)品表面的微生物負載。Tan等使用20 kHz的超聲波處理鼠傷寒沙門氏菌60 s，發(fā)現(xiàn)在保持細胞活性的前提下，菌體的鞭毛量顯著下降至55%，該菌的附著量減少了10%～15%，這可能是因為細菌的鞭毛被破壞后，細菌不足以運動到與基質(zhì)表面足夠近的距離來完成附著。這一發(fā)現(xiàn)為超聲波聯(lián)合殺菌劑提升殺菌效果提供了一種潛在可能性，即超聲處理可以通過將細菌從待潔凈表面轉(zhuǎn)移至含有殺菌劑的液體環(huán)境中的方式來提升殺菌效果。

已有研究發(fā)現(xiàn)，超聲波和含氯試劑聯(lián)用時存在協(xié)同效應(yīng)。一方面，由于超聲波的機械作用和聲化學(xué)效應(yīng)，細胞膜的選擇透過性被破壞，可能會增強殺菌劑對細菌的滲透作用；另一方面，空化效應(yīng)也能促進溶液中微生物團簇的分解，增加殺菌劑與微生物的接觸。而在這些外界的強刺激下，細胞也可能為“自保”而作出一些積極響應(yīng)。Yu Hang等研究發(fā)現(xiàn)，超聲波與二氧化氯聯(lián)合處理金黃葡萄球菌時，超聲波破壞了細胞膜結(jié)構(gòu)，同時也激活了細胞內(nèi)機械敏感通道（如MscS和MscL），進而促進了二氧化氯進入細胞內(nèi)，二者共同脅迫引起細胞的輔助基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)（accessory gene regulator，Agr）上調(diào)基因，這可能導(dǎo)致金黃色葡萄球菌間的黏連性下降，使得生物被膜更松散；另外，和基因的下調(diào)抑制了生物被膜的形成；和基因與細胞裂解的能力密切相關(guān)，相比于二氧化氯單獨處理，聯(lián)用處理使基因上調(diào)1.82 倍，基因下調(diào)1.52 倍，使得金黃色葡萄球菌細胞更容易被裂解。這說明聯(lián)合處理對細菌細胞結(jié)構(gòu)的影響是多方面的，且對細菌有較好的致死作用。

但是，含氯試劑易與水中雜質(zhì)反應(yīng)生成DBPs并危害公共健康，如與水中的含氮化合物（包括氨）反應(yīng)，生成三鹵甲烷等致癌物。另外，超聲波有一定的脫氣和降解作用，這會導(dǎo)致聯(lián)用時有效氯含量降低。故現(xiàn)有研究嘗試使用其他更安全的殺菌劑來替代含氯化合物。

2.2 過氧化物

過氧化物是一類化學(xué)分子結(jié)構(gòu)中包含有過氧基（—O—O—）的強氧化劑，因其強氧化性且殺菌范圍廣而廣泛用于醫(yī)療、食品、水處理、水產(chǎn)養(yǎng)殖、家庭防護等。常見的過氧化物殺菌劑有過氧化氫、過氧乙酸、無機過氧酸鹽、過碳酰胺、單過氧鄰苯二甲酸鎂等。過氧化物的氧化作用可以造成細菌膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等的氧化損傷。另外，其強氧化性的另一部分還可能來自于分解過程中產(chǎn)生的活性衍生物，如自由基。以過氧乙酸為例，其可通過3 種途徑產(chǎn)生自由基：一是在酸性環(huán)境中過氧乙酸的末端氧發(fā)生質(zhì)子化，脫去一分子水，最終形成帶有多余電子的乙酸根離子；二是給出一個電子后形成過氧?；杂苫?；三是由外加能量破壞過氧化物或O—H后解離產(chǎn)生自由基。另一種重要的過氧化物，即HO，其與過渡金屬鐵離子共同參與Fenton反應(yīng)也可以產(chǎn)生大量自由基。這些自由基可以對蛋白質(zhì)和酶的巰基（—SH）以及二硫鍵（—S—S—）起到極強的破壞性作用，從而影響了由激酶、磷酸酶和轉(zhuǎn)錄因子控制的細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)環(huán)境。

通常，細菌的抗氧化性由強到弱為細菌芽孢＞革蘭氏陽性菌＞革蘭氏陰性菌，且細菌存活率隨氧化劑濃度或用量的增加而下降。另外，在氧化水平較低的情況下，細菌胞內(nèi)的過氧化氫酶或其他過氧化物酶的存在會增加細菌對氧化的耐受性。但與超聲波聯(lián)用后，即使氧化劑濃度較低，也可以達到較好的殺菌效果，特別是聯(lián)用后自由基水平的增加大大提高了殺菌效率。Rubio-Clemente等采用高級氧化工藝（advanced oxidation processes，AOPs），對飲用水中的病原體大腸桿菌進行紫外/HO、紫外/超聲和紫外/超聲/HO處理，發(fā)現(xiàn)紫外/超聲/HO體系處理5 min即可使大腸桿菌完全失活（檢測限為1 CFU/100 mL）。該研究還發(fā)現(xiàn)，超聲波聯(lián)合HO處理的細菌去除率相比于單獨超聲作用時增加了62.16%，這是因為超聲波的空化效應(yīng)促進了HO熱分解產(chǎn)生更多的羥自由基。Giannakis等利用超聲波和Fenton反應(yīng)聯(lián)合處理廢水，單獨超聲波或Fenton反應(yīng)處理時細菌數(shù)量分別可減少27.9%和24.4%，聯(lián)合處理使細菌數(shù)量減少82.1%，達到兩種單獨處理下細菌減少量之和的1.57 倍，Giannakis等認為其協(xié)同效應(yīng)是因為HO重組并不斷引發(fā)新的Fenton反應(yīng)，同時，超聲波使細胞膜的滲透性暫時性地提高，F(xiàn)e更易進入細菌細胞內(nèi)，促進Fenton反應(yīng)產(chǎn)生更多自由基，造成活性物質(zhì)的氧化損傷，最終導(dǎo)致細菌失活。

2.3 無機金屬氧化物

無機金屬氧化物因其良好的抗菌性、化學(xué)穩(wěn)定性、低毒性、不使細菌產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢而被廣泛研究。無機金屬氧化物的殺菌機理研究較多的主要有3 種：一是因靜電作用聚集在細胞表面，影響物質(zhì)交換；二是滲透入細胞內(nèi)，與胞內(nèi)含硫蛋白質(zhì)以及DNA等含磷化合物相互作用，影響細菌的呼吸鏈、分裂等過程，最終導(dǎo)致死亡；三是通過形成高氧化活性的自由基氧化細菌細胞。在實際研究中，這3 種機理往往同時存在。

近年來，金屬氧化物納米顆粒（nanoparticles，NPs）優(yōu)良的光催化活性是研究的熱點。在光催化下，NPs吸收能量，在導(dǎo)帶產(chǎn)生負電子，在價帶產(chǎn)生帶正電的空穴，自由電子可以攻擊周圍的氧和水分子，形成ROS，介導(dǎo)細菌死亡。而超聲波的聲致發(fā)光效應(yīng)可以為NPs提供光催化環(huán)境。Zhang Lingling等利用聲光催化ZnO納米流體，發(fā)現(xiàn)聲光催化可以提高ROS水平，而上清液中鋅離子的濃度卻沒有增加，與此同時，聲光催化下大腸桿菌的失活效率提高了約20%，Zhang Lingling等指出聲光催化下大腸桿菌失活效率的提高主要是因為ROS水平提高而不是鋅離子。Rahman等開發(fā)了一種使用Fe/ZnO NPs的可見光輔助聲光催化方法對志賀氏菌進行處理，也得到了類似的結(jié)論，他們還發(fā)現(xiàn)該方法會影響細菌細胞的脂肪酸組成，并減弱細菌形成生物被膜的能力。

目前對NPs和超聲波聯(lián)用的研究處于起步階段，其殺菌機理研究并不深入，還需進一步研究。

2.4 季銨化合物

QACs，即一個帶正電的氮原子與4 個相同或不相同的脂烴基或芳烴基共價連接的化合物，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有殺菌效果，能抑制細菌芽孢的生長但不能抑制其萌發(fā)。帶正電的氮使QACs容易與細菌表面產(chǎn)生靜電吸引而吸附到細胞膜上破壞其電荷分布，同時QACs的長烷基鏈能滲透細胞膜，與DNA結(jié)合，其鏈長在C～C范圍內(nèi)可達到最佳殺菌效果。但是細菌自身編碼的多種外排泵、細胞膜成分的改變等會提高細菌對QACs的耐受性。

超聲波與QACs聯(lián)用常被用于去除生物被膜，聯(lián)用后既能減少Q(mào)ACs用量，又能保持一定的生物被膜清除能力。單核細胞增生李斯特氏菌（以下簡稱單增李斯特菌）是一種易在與食品接觸的塑料、鋼材等表面形成生物被膜的常見菌。Torlak等聯(lián)合超聲波與苯扎氯銨處理聚苯乙烯表面的單增李斯特菌生物被膜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合處理1 min的殺菌效果優(yōu)于相同濃度下苯扎氯銨單獨處理5 min的效果，說明聯(lián)合處理可以減少殺菌所需時間；同時，Torlak等還發(fā)現(xiàn)在處理5 min條件下，聯(lián)合超聲波與100 mg/L苯扎氯銨的殺菌效果優(yōu)于單獨使用400 mg/L苯扎氯銨的殺菌效果，說明聯(lián)合處理可以降低苯扎氯銨的使用量。Torlak等推測兩者的協(xié)同效應(yīng)可能是超聲波提高了傳質(zhì)效率，促進了苯扎氯銨向生物被膜的傳輸，破壞了細菌細胞膜脂質(zhì)雙層，通過解離導(dǎo)致細胞質(zhì)泄漏，最終清除生物被膜。Berrang等也得到了相似的結(jié)果。

2.5 酸

酸作為廣譜殺菌劑在生產(chǎn)生活中應(yīng)用廣泛，其中大多為有機酸。有機酸以非解離的形式進入細菌細胞內(nèi)并解離，產(chǎn)生的陰離子和質(zhì)子促使細胞排出過多的質(zhì)子，該過程消耗了維持胞內(nèi)pH值穩(wěn)態(tài)的能量，最終導(dǎo)致細胞死亡。當(dāng)pH值相同時，無機酸的解離常數(shù)高于有機酸，無機酸完全解離，在胞外對細菌影響相對較小，而有機酸未解離，可以進入細胞內(nèi)發(fā)揮作用，因此pH值越低，未解離形式的酸所占比例越高，抗菌效果也就越好。

據(jù)報道，超聲波聯(lián)合乳酸、檸檬酸或蘋果酸處理生菜葉片，可使單增李斯特菌和大腸桿菌對數(shù)值減少約2.5（lg（CFU/g）），比單一有機酸處理額外減少0.8～1.0（lg（CFU/g））。聯(lián)合處理提升殺菌效果的原因可能是超聲空化效應(yīng)將細菌從生菜葉上剝離下來，增加了有機酸與生菜葉褶皺內(nèi)細菌的接觸，提升了酸的作用效率。

2.6 精油

精油作為從芳香植物中提取的天然抗菌劑，具有顯著的抗菌、抗病毒、抗氧化、抗寄生蟲活性。精油可以抑制細菌胞外多糖和蛋白的分泌、調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄水平來抑制生物被膜的形成、干擾膜電位、陰礙DNA合成，抑制多種酶系統(tǒng)，影響細菌糖代謝途徑。

超聲波處理可減小精油液滴尺寸，增大液滴的比表面積，增加液滴與微生物的接觸面積，從而達到協(xié)同殺菌效果。精油也可在細菌細胞的磷脂雙分子層中堆積，使其對超聲波更敏感。另外，為了改善精油的水不溶性、提高化學(xué)穩(wěn)定性和生物利用度，研究人員常將其制成乳液。He Qiao等聯(lián)合超聲波（3.33 W/mL）與百里香精油納米乳液處理金黃色葡萄球菌3 min，與兩者單獨處理的加和相比，殺菌量對數(shù)值顯著增加了1.44（lg（CFU/mL）），He Qiao等認為協(xié)同效應(yīng)產(chǎn)生的原因可能是超聲波處理使細菌細胞膜損傷導(dǎo)致表面疏水性降低，進一步提高了精油乳液與細菌的互作機率，兩者的聯(lián)用使得胞內(nèi)物質(zhì)大量流失、細胞膜失去膜電位、膜成分變性最終導(dǎo)致細菌死亡。

2.7 氣體

一些氣體如臭氧、二氧化碳、二氧化氯等溶于液體介質(zhì)中可用于殺菌，它們都作用于細胞膜和細胞質(zhì)，但在具體作用機理上有所差別。臭氧具有較高的氧化電位（2.07 eV），經(jīng)鏈衰減可以產(chǎn)生羥自由基和ROS，主要攻擊細胞壁上的脂質(zhì)、蛋白、酶以及胞內(nèi)的酶和核酸，但關(guān)于臭氧分子與自由基在殺菌機制中哪一種為主要途徑并不明確。高壓二氧化碳作為“一般認為安全”、環(huán)境友好的新型殺菌技術(shù)，具有無毒、價格低廉、易于獲取的優(yōu)點。二氧化碳可以通過降低胞內(nèi)外pH值、改變細胞膜流動性、影響酶促反應(yīng)等方式提高殺菌效率。二氧化氯也是一種強氧化性氣體，作為氯氣的有效替代物，其活性為氯氣的2.5 倍，可通過改變細胞膜透性造成胞內(nèi)物質(zhì)外流導(dǎo)致細菌死亡，且不產(chǎn)生致癌物。

超聲波與氣體殺菌劑聯(lián)用產(chǎn)生協(xié)同效果的原因主要為超聲波促進了氣體與細菌的接觸或?qū)毦毎臐B透。Yu Hang等采用超聲波（20 kHz、60 W）和質(zhì)量濃度1、4 mg/L的二氧化氯聯(lián)合處理金黃色葡萄球菌生物被膜時均產(chǎn)生了明顯的協(xié)同效果，Yu Hang等認為一方面超聲波促進了二氧化氯對細菌的滲透作用；另一方面超聲波促進了二氧化氯氣體的均勻分布，為空化泡提供了更多成核位點，有利于局部升壓和熱點的產(chǎn)生。而超臨界二氧化碳與超聲波聯(lián)用時，超聲波的機械攪拌作用提高了二氧化碳的溶解度，導(dǎo)致細胞內(nèi)pH值下降加快，從而加速細菌失活最終導(dǎo)致死亡。

3 超聲波聯(lián)合殺菌劑對殺菌效果的影響因素

3.1 殺菌劑的種類

殺菌劑種類不同，其殺菌機理也存在差異，故在超聲波與不同種類殺菌劑聯(lián)用時效果也有差異。?ístková等發(fā)現(xiàn)在5 種化學(xué)試劑和低頻超聲波處理朝井桿菌屬（）生物被膜的過程中，以過氧乙酸為主要成分的復(fù)配試劑單獨使用時效果最好，而聯(lián)用時，以二氧化氯為主要成分的復(fù)配試劑和超聲波顯示出更好的清除效果。Palanisamy等發(fā)現(xiàn)過氧化氫與超聲波的聯(lián)用效果優(yōu)于氫氧化鈉與超聲波的聯(lián)用效果。

3.2 超聲參數(shù)

超聲參數(shù)主要包括超聲頻率、超聲功率（或振幅）、作用時長。目前應(yīng)用最多的超聲頻率為20 kHz，因為研究發(fā)現(xiàn)，在功率超聲條件下（頻率20～100 kHz、功率10～1000 W/cm），超聲波產(chǎn)生的剪切力等機械作用對細菌細胞有很強的破壞效果。一方面，功率超聲在傳播過程中會引起液體介質(zhì)激烈振蕩；另一方面，功率超聲的空化效應(yīng)會產(chǎn)生剪切力、沖擊波、微射流、湍流等機械作用，都會破壞細菌細胞。當(dāng)超聲頻率一定時，超聲波對細菌的破壞效果隨功率增加、作用時間延長呈現(xiàn)增強的趨勢。如遲媛等聯(lián)合超聲波和次氯酸鈉處理腐敗菌，致死率隨著超聲功率、處理時長的增加而提高，且高功率下的聯(lián)合處理有顯著的協(xié)同殺菌效果，這可能是由于在一定范圍內(nèi)超聲強度的增加增強了空化效應(yīng)，提高了對細菌外層結(jié)構(gòu)的破壞強度，促進次氯酸鈉直接作用于細菌而加速細菌死亡?？梢?，空化效應(yīng)強度受超聲參數(shù)調(diào)節(jié)，對殺菌效率有重要影響，較好的殺菌效果需在施加聲壓高于空化閾值且空化效應(yīng)較強時實現(xiàn)。許多研究表明，低頻超聲發(fā)生空化效應(yīng)所需的空化閾值低于高頻超聲，低頻超聲條件下的殺菌效果也往往優(yōu)于高頻超聲。

3.3 細菌的特性

殺菌效果不僅取決于外界脅迫，還取決于細菌的特性，包括細胞形態(tài)和大小、基因型、細胞濃度、生長周期、膜結(jié)構(gòu)等。研究發(fā)現(xiàn)，芽孢比營養(yǎng)細胞、革蘭氏陽性細菌比革蘭氏陰性細菌、球狀細菌比桿狀細菌對外界環(huán)境刺激有更高的抗性。其中，芽孢有多層致密結(jié)構(gòu)，具有較強的抗逆性，能在多種極端條件刺激下維持活性。革蘭氏陽性菌的細胞壁有一層較厚（20～80 nm）的肽聚糖層，不利于通過直接接觸方式起作用的殺菌技術(shù)發(fā)揮效果。革蘭氏陰性菌則有脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）和磷脂提供機械強度。不同大小的細菌對聯(lián)合處理有不同的耐受程度，如相比于常見的大腸桿菌，細胞更小的缺陷短波單胞菌（）對超聲波聯(lián)用超臨界二氧化碳處理的耐受性更低。通常不同尺寸的細菌耐受性也不同，尺寸大的細菌往往比尺寸小的細菌對超聲波更敏感，這可能是因為前者具有更大的表面積，因此受到更多的超聲作用。

殺菌效果還受細菌胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)響應(yīng)的影響。如在微氣泡存在下，低頻超聲與陽離子抗菌肽人β防御素聯(lián)用處理耐抗生素葡萄球菌，控制葡萄球菌生物被膜形成的基因表達提高，基因和基因表達被抑制，導(dǎo)致耐抗生素葡萄球菌生物被膜形成能力下降，抑菌效果提高。另外，細菌包膜應(yīng)激響應(yīng)（bacterial envelope stress responses，ESRs）系統(tǒng)也可影響殺菌效果。在革蘭氏陰性菌中定義了5 種ESRs，分別是（sigma factor）、Cpx（conjugative pilus expression）、Bae（bacterial adaptive respons）、Psp（phage shock protein）、Rcs（regulator of capsule synthesis）響應(yīng)系統(tǒng)。然而，關(guān)于聯(lián)用后細菌基因水平變化的研究較少，仍需進一步探索從分子水平揭示聯(lián)用技術(shù)具有協(xié)同效果、無明顯作用或?qū)е罗卓棺饔玫臋C理，以及細胞的響應(yīng)通路，為解決微生物安全問題提供更多參考。

3.4 介質(zhì)的特性

液體介質(zhì)通常為含水體系，超聲波的空化效應(yīng)可引起水分子裂解，并借由液體的振動傳播能量，該過程中介質(zhì)溫度上升，而溫度的變化可能會影響細菌細胞膜的狀態(tài)；殺菌劑則需以液體介質(zhì)作為媒介接觸細菌達到殺菌效果，故介質(zhì)的黏度、固形物含量、溫度等均會影響殺菌效果。介質(zhì)黏度是表示流體流動時陰力大小的指標(biāo)，當(dāng)液體黏度高時，其傳質(zhì)效率低，殺菌難度提高，效果變差。對于超聲空化而言，其強度受介質(zhì)黏度影響，產(chǎn)生空化泡需要克服介質(zhì)分子間力，若介質(zhì)黏性較大，則難以產(chǎn)生空化。介質(zhì)中含有的固形物除了有提高介質(zhì)黏度不利于超聲波傳播外的特性外，細菌也可附著在大而粗糙的固形物表面，如果蔬的表面縫隙、與食品直接接觸的粗糙鋼材表面，更“隱蔽”的同時還能形成生物膜，降低殺菌劑與細菌的接觸概率及超聲波的作用效果。另外，介質(zhì)中的固體微粒也可以為超聲波提供成核位點，提高空化活性，增強殺菌效果。研究發(fā)現(xiàn)，牛乳中含有的乳糖有助于細菌合成滲透保護劑或通過結(jié)合自身的游離羥基與細菌細胞磷脂層的極性頭部而提高抗性。介質(zhì)的酸堿性也會影響超聲波聯(lián)合殺菌劑的殺菌效果。當(dāng)介質(zhì)中酸性較強時，殺菌效率更高，如de Freitas等使用145.54 μmol/L乳酸鏈球菌素聯(lián)合超聲波處理志賀氏菌15 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在pH 4.5時的殺菌效率高于在pH 6.5時的殺菌效率，這可能是低pH值影響了細菌細胞的穩(wěn)定性。另外，介質(zhì)內(nèi)含物還可以作為細菌損傷后的修復(fù)材料，包括已經(jīng)死亡的個體也可以為活細胞提供養(yǎng)分，如Yamamoto等的研究表明在不添加營養(yǎng)物的條件下，大腸桿菌菌液（含10CFU/mL死菌和10CFU/mL活菌）25 ℃下1 d內(nèi)活菌數(shù)可恢復(fù)至10～10CFU/mL，Yamamoto等認為這是因為活細胞吸收了死細胞。

4 超聲波聯(lián)合殺菌劑在食品工業(yè)中的應(yīng)用

超聲波聯(lián)合殺菌劑在果蔬表面清洗、肉制品保鮮、乳制品殺菌等方面均有應(yīng)用，表1整理了部分研究。在果蔬加工中，兩者聯(lián)用可有效去除農(nóng)藥殘留，抑制多酚氧化酶、過氧化物酶和細胞壁降解酶的活性，穩(wěn)定細胞壁多糖，并除去表面微生物來減緩腐爛。Bal等用水楊酸（1 mmol/L）、超聲波（32 kHz）以及超聲波與水楊酸聯(lián)合處理甜櫻桃果實（10 min），貯藏40 d后腐爛率分別為13.5%、10.8%、3.8%，而對照組腐敗率高達24.4%。Mustapha等將超聲波分別與二氯異氰尿酸鈉、過氧乙酸、過氧乙酸、過氧化氫聯(lián)用，其中40 mg/L過氧乙酸、5%過氧化氫及超聲波聯(lián)用可使櫻桃番茄表面微生物對數(shù)值減少3.07～3.10（lg（CFU/g））。同樣地，超聲波與殺菌劑也可用于肉類表面除菌，同時，超聲波還可以起到肉嫩化的作用。乳制品中牛奶常被作為研究對象，微生物可以附著在脂肪球上而增加殺菌難度，聯(lián)合技術(shù)可以有效滅活牛奶中的微生物群。如Shamila-Syuhada等將5 種腐敗菌、致病菌接種至牛奶中（初始菌量約為8.1（lg（CFU/mL））），采用超聲波（24 kHz、125 μm振幅）和過氧化氫（質(zhì)量分數(shù)0.01%）聯(lián)用處理10 min即可殺滅接種菌，最大程度維持牛奶品質(zhì)。食品加工過程中涉及許多塑料管道、不銹鋼器材等，對這些表面的清潔也是食品質(zhì)量安全控制的重要一環(huán)。Yu Hang等聯(lián)合超聲波（20 kHz、60 W）和二氧化氯（4 mg/L）用于清除4 種與食品直接接觸材料表面的金黃色葡萄球菌生物被膜，處理10 min后金黃色葡萄球菌失活率為99.03%，體現(xiàn)出協(xié)同效果（單獨超聲波處理為15.86%，單獨二氧化氯處理為82.62%），Yu Hang等發(fā)現(xiàn)聯(lián)合處理通過介導(dǎo)群體感應(yīng)信號分子、細胞間黏附和多糖細胞間黏附素產(chǎn)生減少了生物被膜的形成，腸毒素的分泌也被抑制，且接觸材料表面越粗糙，聯(lián)合處理的生物被膜清除率越低。

表1 超聲波聯(lián)合殺菌劑殺菌的研究Table 1 Selected studies of microbial killing by combined treatment of ultrasound with bactericides

5 結(jié) 語

超聲波作為一項有潛力的非熱加工技術(shù)，具有綠色、無污染的特點，但在單獨使用時殺菌效果不理想，需要提高處理強度來彌補，高強度超聲下大量能量以熱能形式耗散造成浪費，也會縮短儀器壽命；殺菌劑應(yīng)用廣泛，但也存在單獨使用滲透性不高、濃度高易產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物等問題，而殺菌劑聯(lián)合超聲波進行殺菌處理，往往可以達到協(xié)同殺菌效果，既可以解決單獨超聲波殺菌效果不佳的問題，還可以彌補殺菌劑的不足。聯(lián)合殺菌技術(shù)目前雖已在果蔬表面清洗、肉制品保鮮、乳制品殺菌方面有一定的應(yīng)用，但是由于其提高了體系的復(fù)雜程度，目前對協(xié)同殺菌機理的研究并不深入，導(dǎo)致其應(yīng)用受限，在今后的研究中可以下列工作為重點：1）明確微生物的應(yīng)急響應(yīng)機制，結(jié)合基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)等多組學(xué)對聯(lián)合技術(shù)影響微生物的分子機制進行整合分析；2）明確超聲波空化效應(yīng)的動力學(xué)，優(yōu)化超聲波空化參數(shù)，實現(xiàn)空化程度精確調(diào)控，既可以明確在殺菌效果中空化效應(yīng)所占比重，又可以為實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參考；3）確定通用的基礎(chǔ)細菌模型、統(tǒng)一的關(guān)鍵殺菌技術(shù)參數(shù)，使各項研究結(jié)果之間能夠互相比較，并整合結(jié)果建立數(shù)據(jù)庫，為創(chuàng)建新的殺菌模型提供數(shù)據(jù)支持；4）開展在食品基質(zhì)中的實際應(yīng)用實驗，明確聯(lián)合技術(shù)與食品基質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，為工業(yè)化應(yīng)用提供依據(jù)。