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    全乙?;頉]食子兒茶素沒食子酸酯的合成純化及生物活性研究進展

    2022-10-28 07:18:18劉苗苗黃峻榕曹云剛
    食品科學 2022年19期
    關鍵詞:乙?;?/a>小鼠生物

    劉苗苗,潘 越,范 鑫,黃峻榕,曹云剛

    (陜西科技大學食品科學與工程學院,陜西 西安 710021)

    表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)是未發(fā)酵茶葉中的主要活性成分,約占茶葉中兒茶素總量的50%~80%。諸多研究證實,EGCG富含酚羥基結構,具有抗氧化、抗紫外線、抑菌、抗動脈粥樣硬化、降血糖血脂、抗癌等廣泛的生物活性。但EGCG的多羥基結構使其存在化學性質不穩(wěn)定、極易氧化變質、脂溶性差、生物利用度低等問題,且其在體內易發(fā)生生物轉化或者被腸道菌群降解,因而限制了EGCG的深度開發(fā)利用。

    結構修飾是改善EGCG理化特性的有效手段,其中乙?;揎検墙鼇韨涫荜P注的修飾方法之一。研究表明,EGCG經(jīng)小分子乙?;–H—CO—或Ac—)酯化后,脂溶性、穩(wěn)定性及生物利用度均得到改善;同時相比其他修飾基團,乙酰基空間位陰效應較小,不會影響周圍酚羥基參與反應,因而生物活性得以有效發(fā)揮。全乙?;頉]食子兒茶素沒食子酸酯(total acetylated epigallocatechin gallate,AcEGCG)是在EGCG的8 個芳環(huán)氧原子上均引入乙?;纬傻孽ヮ惢衔?。由于EGCG的酚羥基最大程度地受到乙酰基的保護,因而AcEGCG的脂溶性和穩(wěn)定性顯著提高,其生物利用度更高,且在細胞內有效成分的濃度和半衰期也相對較高和較長。就生物活性而言,AcEGCG的抗紫外線、抗癌以及細胞損傷修復等功能均優(yōu)于EGCG。因此,AcEGCG在保健食品、抗癌藥物、化妝品等方面較EGCG更具應用潛力和開發(fā)前景。目前,AcEGCG的來源主要依靠化學手段合成,但受到工藝、成本及安全性多因素的制約,尚無較為成熟、綠色的制備方法。AcEGCG的生物活性已得到廣泛證實,進一步探究和明確其內在作用機制對于AcEGCG的科學應用至關重要。本文調研了大量文獻,對現(xiàn)有AcEGCG的合成純化方法進行綜述,論述其優(yōu)勢和不足;同時介紹AcEGCG的理化性質以及抗紫外線、細胞損傷修復、抗炎癥、抗癌等生物活性的研究進展,并對今后AcEGCG的研究及開發(fā)利用提出建議,以期為相關研究提供參考。

    1 AcEGCG的合成純化

    1.1 AcEGCG的合成純化機理

    EGCG分子結構中有多個反應活性基團和活性部位,其中酚羥基是最具特征性的活性基團。乙?;磻窃贓GCG芳環(huán)酚羥基的氧原子上引入乙?;?,即羥基氫原子被?;〈甚ヮ惢衔锏倪^程,因此也稱為酯化反應,屬于-?;?。該反應通常以乙酸酐((CHCO)O)為?;噭?,反應時必須加入路易斯酸或者質子酸等催化劑以增強酰化試劑的親電能力,使反應得以順利進行。通過控制反應物濃度比、催化劑、反應溶劑、反應時間等反應條件可以調控EGCG乙?;潭取.擡GCG芳環(huán)的8 個酚羥基被完全?;螅纯缮葾cEGCG。目前,AcEGCG的合成主要利用化學合成法,酶法合成尚處于部分乙?;A段。

    化學合成AcEGCG的反應體系中常包含吡啶、乙酸酐以及目標產(chǎn)物AcEGCG等物質,其組成復雜,因而需要經(jīng)過系列純化步驟(圖1)。在純化過程中,通常需要依次使用水、碳酸鈉/碳酸氫鈉溶液、飽和氯化鈉溶液、無水硫酸鈉等試劑。水可以終止反應,因為酸酐遇水生成對應的酸,且水也可以洗去催化劑吡啶。碳酸鈉/碳酸氫鈉溶液的主要目的是中和反應液中的酸類物質;飽和氯化鈉溶液可以吸收反應液中的水,使有機層澄明;無水硫酸鈉可吸收溶液中多余的水分,再經(jīng)濃縮、干燥得到初產(chǎn)物。初產(chǎn)物經(jīng)柱層析純化后,即可得到純度較高的AcEGCG。

    圖1 化學合成法制備AcEGCG的主要過程[8,13-14]Fig. 1 Preparation of AcEGCG by chemical synthesis method[8,13-14]

    1.2 化學合成法

    AcEGCG的合成主要采用化學合成法,現(xiàn)有研究大多利用乙酸酐為EGCG的?;噭?,在吡啶催化下直接合成(圖1)。Kohri等于2001年報道了利用吡啶和乙酸酐合成AcEGCG的具體方法:向1 g EGCG(2.18 mmol)中加入14 mL吡啶和16 mL乙酸酐(157 mmol),45 ℃攪拌反應20 h。反應液經(jīng)預冷、攪拌、靜置、抽濾后得到白色沉淀,再經(jīng)洗滌、減壓干燥、硅膠柱層析后,獲得1.7 g AcEGCG(2.14 mmol),產(chǎn)物得率為98%。經(jīng)高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)檢測,樣品純度為99%。Lam等在此基礎上,以吡啶為催化劑,將EGCG和乙酸酐在室溫下攪拌過夜后得到AcEGCG,產(chǎn)物得率為82%。隨后Utenova等以N為保護劑,以30 mL二氯乙烷作為溶劑,向70 mg EGCG(0.15 mmol)中加入186 mg,-二甲氨基吡啶(1.52 mmol)和0.14 mL乙酸酐(1.52 mmol),于0 ℃和室溫下分別攪拌1 h和4 h。反應液經(jīng)50 mL三氯甲烷稀釋后,用30 mL硫酸銅洗滌4 次,30 mL飽和碳酸氫鈉溶洗滌2 次,濃鹽水洗滌1 次。經(jīng)無水硫酸鎂干燥后減壓蒸干,最后使用HPLC進行純化,共得到66 mg產(chǎn)物,產(chǎn)物得率為55%。

    近年來,國內學者也對AcEGCG的化學合成方法進行了系統(tǒng)研究,酸酐用量、催化劑用量、反應時間、反應溫度等對AcEGCG的合成和純度均具有重要影響。劉曉輝在乙酸乙酯溶液(200 mL)中依次加入0.920 g質量分數(shù)98% ECCG、20 mL乙酸酐和2 mL吡啶,室溫下300 r/min攪拌反應5 h,經(jīng)稀酸、飽和碳酸氫鈉溶液洗滌后,產(chǎn)物純度為89.53%,經(jīng)柱層析再純化后,得到純度為96.04%的AcEGCG。王金妮等在500 mL乙酸乙酯中加入3.7 g EGCG、20 mL乙酸酐、20 mL吡啶,于30 ℃下反應12 h,經(jīng)體積分數(shù)0.5% HCl溶液、質量分數(shù)4%碳酸氫鈉溶液及蒸餾水洗滌,減壓蒸干溶劑后得到AcEGCG產(chǎn)物,經(jīng)HPLC檢測其純度為99%。葉敏通過研究發(fā)現(xiàn)合成AcEGCG的最適條件:184 mg EGCG溶于20 mL乙酸乙酯,酸酐用量是EGCG物質的量的80 倍,催化劑用量為100 μL,反應時間為5 h。反應液經(jīng)水、0.5 mol/L碳酸鈉溶液、飽和氯化鈉溶液反復洗滌,無水硫酸鈉過濾,真空濃縮及干燥處理后,得到AcEGCG。該條件下AcEGCG純度為98.42%。張建勇等也發(fā)現(xiàn)乙酸酐用量0.4~0.8 mL、吡啶用量0.1~0.2 mL、乙酸乙酯用量5~10 mL、反應溫度25~40 ℃、反應時間5~9 h的條件有利于取代度7~8的乙?;疎GCG生成。

    除以EGCG為反應底物與酸酐反應直接合成AcEGCG外,也可利用EGCG結構類似物來間接合成AcEGCG。Kuhn等以全芐基化保護的表沒食子兒茶素為原料,通過加入二氯甲烷、甲基化沒食子酰氯、二甲氨基吡啶、氫氧化鉛、甲醇、四氫呋喃、乙酸酐、吡啶等系列試劑,經(jīng)過3 步反應后最終生成AcEGCG。

    相比直接合成法,間接合成AcEGCG所用化學試劑較多,步驟繁瑣,不適宜工業(yè)化應用。直接化學合成AcEGCG的體系相對簡單,但也存在一定問題。直接化學合成法的合成路線較為單一、反應耗時長,且酰化位點不明確,導致反應所得到的產(chǎn)物多為不同酰化程度的EGCG衍生物的混合物,副產(chǎn)物較多,對產(chǎn)物的純化等后期處理要求較高;另外,酰化所用的吡啶等有毒化學試劑也給AcEGCG在食品和藥品領域的應用帶來不利影響。因此,探究AcEGCG的可控、定向、綠色的合成方法及酰化規(guī)律是具有潛力的研究方向。

    1.3 酶法合成法

    EGCG的酶法乙酰化修飾通常采用脂肪酶。朱松確立了以乙烯酯作為?;w的AcEGCG酶法合成路線,最優(yōu)反應條件如下:脂肪酶RM IM的添加量為2.1%(以底物質量計),反應溶劑體系為乙腈和異丙醇(質量比1∶1),EGCG與乙酸乙烯酯物質的量比為1∶1,40 ℃反應12 h。在該條件下,EGCG乙酰化轉化率為90.32%。經(jīng)高速逆流色譜純化,液相色譜-質譜聯(lián)用鑒定,乙?;疎GCG的反應產(chǎn)物為單-(5’’--乙?;鵈GCG)、二-(3’,5’-2--乙酰基EGCG)和三-(5’,3’,5’-3--乙?;?EGCG)取代乙酰化EGCG的混合物(圖2)。可見,目前利用脂肪酶進行EGCG乙?;瘍H能得到部分乙?;a(chǎn)物,鮮見利用酶法制備得到AcEGCG的研究報道。同時,酶法分子修飾EGCG的成本較高,產(chǎn)物的轉化率不高,后期分離純化困難,且對于?;稽c的確定也無規(guī)律性的結論。因此,酶法合成AcEGCG尚需系統(tǒng)深入研究。

    圖2 EGCG酶法乙?;a(chǎn)物[19]Fig. 2 Enzymatic acetylation products of EGCG[19]

    2 AcEGCG的理化性質

    2.1 基本理化性質

    固體AcEGCG為白色粉末狀物質。相比EGCG,AcEGCG的水溶性降低,幾乎不溶于水,油-水分配系數(shù)增大,脂溶性增強,易溶于有機溶劑,但溶解度與溶劑極性并不完全一致,由高到低為甲醚>二乙氧基乙醇>丙氧基乙醇>丁氧基乙醇>乙醇>丙醇>仲丁醇>甲醇>異丙醇>正丁醇>正戊醇>正己醇。在生物活性分析研究中,AcEGCG的常用溶劑為聚乙二醇300/乙醇/吐溫-80/水(2∶1∶0.98∶0.02,/)、二甲基亞砜/氫化蓖麻油/乙醇(60∶20∶20,/)等。另外,AcEGCG的光譜吸收特性較EGCG也發(fā)生顯著變化。紫外光譜全波長掃描結果顯示,EGCG在210 nm和280 nm波長處有較大吸收,而AcEGCG的最大吸收波長為250 nm。

    2.2 穩(wěn)定性

    表1 AcEGCG和EGCG的穩(wěn)定性Table 1 Stability of AcEGCG and EGCG

    在模擬人體環(huán)境的培養(yǎng)基質(pH 8、溫度37 ℃)中,EGCG在20 min內很快降解消失,而AcEGCG在2 h內才完全降解,穩(wěn)定性較EGCG提高約5 倍。在人工模擬胃液中,AcEGCG和EGCG均能保持一定的穩(wěn)定性,處理2 h后二者的降解率均維持在10%左右;在人工模擬腸液中,EGCG則迅速發(fā)生變化,處理1 h后在設定的HPLC檢測條件下幾乎檢測不到,而AcEGCG在處理2 h后,剩余含量仍在50%以上。相比EGCG,AcEGCG的穩(wěn)定性明顯提高,可抵抗光照、溫度、pH值、氧氣等體外環(huán)境以及體內腸道環(huán)境的破壞作用,從而有利于機體吸收。

    2.3 生物利用度

    “利平斯基規(guī)則”指出,一個化合物違背以下任意兩條就很難被生物體吸收:相對分子質量在500以下;油-水分配系數(shù)小于5;氫鍵供體不超過5 個;氫鍵受體不超過10 個。EGCG分子結構中含氫鍵供體8 個,氫鍵受體11 個,且其極性分子表面區(qū)域較大,因而很難被生物體吸收利用。Nakagawa等研究證實,EGCG的生物利用度極低,小鼠口服EGCG 56 mg 30 min、人口服EGCG 97 mg 1 h后,吸收率僅分別為0.012%和0.32%。除分子結構原因導致的生物利用度低外,EGCG在體內(如肝臟、結腸等)還會受到葡萄糖醛酸化、甲基化和硫酸化以及微生物降解等作用,進一步導致有效含量的降低。Lu Hong等發(fā)現(xiàn),在人尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶(uridine diphosphate-glucuronosyltransferase,UDPGT或UGT)作用下,EGCG在體內可轉化為EGCG-4’--葡糖苷酸、EGCG-3’--葡糖苷酸、EGCG-7--葡糖苷酸等物質;且3 種人UGT同工酶(UGT 1A1、1A8、1A9)的催化活性均較高。陳欣發(fā)現(xiàn),EGCG在腸道菌群作用下含量迅速下降,代謝轉化為沒食子酸、3--甲基沒食子酸或4--甲基沒食子酸、對羥基苯丙酸及表兒茶素沒食子酸酯等物質。因此,通過改善EGCG的理化性質或減少其生物轉化的化學修飾可能有助于提高其生物利用度。

    AcEGCG的脂溶性較好,能夠透過雙脂層細胞膜,在靶向作用點大量聚集,因而生物利用度高于EGCG。Lambert等研究發(fā)現(xiàn),AcEGCG在KYSE150人食管癌細胞和HCT116結腸癌細胞內的濃度是相同處理下EGCG的2.8~30.0 倍,可見其體內生物利用度大幅提高。同時,AcEGCG可以抑制脂多糖刺激引起的小鼠RAW264.7巨噬細胞一氧化氮的產(chǎn)生及花生四烯酸的釋放,抑制能力分別是EGCG的4.4 倍和2.0 倍。對小鼠進行灌胃實驗發(fā)現(xiàn),AcEGCG組小鼠血漿中血藥質量濃度-時間曲線下面積(area under concentration-time curve,AUC)(反映藥物在體內的暴露特性)(AUC=465.0 μg/(mL·min)顯著高于EGCG組(AUC=194.6 μg/(mL·min);小腸和結腸組織中AcEGCG組AUC分別是EGCG組的2.8 倍和2.4 倍。這充分說明AcEGCG在小鼠體內的生物利用度高于EGCG。綜上,乙?;梢栽鰪奅GCG的生物效價及生物利用度。

    3 AcEGCG的生物活性

    3.1 生物安全性

    EGCG在低濃度時具有較好的生物活性,但濃度過高則表現(xiàn)出一定生理毒性。王東旭研究發(fā)現(xiàn),小鼠多次腹水注射55 mg/kg和75 mg/kgEGCG(亞急性模型)以及單次腹水注射200 mg/kgEGCG(急性毒性模型)后,出現(xiàn)昏睡、立毛、弓背和活動減少等毒癥現(xiàn)象;解剖發(fā)現(xiàn)肝臟出現(xiàn)白斑、淤血等損傷變化,且高劑量下更加明顯,表明高濃度EGCG可以引起小鼠肝毒性。雖然按照GB 15193.3—2014《食品安全國家標準 急性經(jīng)口毒性試驗》規(guī)定,EGCG屬于低毒范圍,但其生理毒性在一定程度上影響其開發(fā)應用。

    AcEGCG的生物安全性也受到關注。王金妮等對小鼠連續(xù)灌胃AcEGCG和EGCG 14 d,結果發(fā)現(xiàn)AcEGCG組小鼠無死亡,病理檢查結果與正常對照組無差異,最大耐受量為8 300 mg/kg,而EGCG組小鼠給藥后第1~5天出現(xiàn)死亡,半數(shù)致死量為761.5 mg/kg。Ou Bingning等在細胞水平探究了AcEGCG的生理毒性,結果表明AcEGCG對BEL-7402/5-FU的細胞毒低于EGCG??梢姡珹cEGCG的生物安全性高于EGCG,因此更具開發(fā)應用潛力。

    3.2 抗紫外線

    紫外線對機體的損傷主要體現(xiàn)在:一方面,紫外線作為光能量易被DNA、蛋白質等直接吸收,造成DNA鏈的損傷及蛋白質空間結構的破壞;另一方面,機體在紫外線誘導下會產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS),ROS積累可直接攻擊DNA、蛋白質、脂質等生物大分子,造成氧化損傷,進而引起一些氧化應激類疾病。研究表明,AcEGCG能夠預防和修復紫外線造成的機體損傷。在修復模式中,AcEGCG可抑制因紫外線照射引起的HaCaT細胞存活率下降,且10 μmol/L AcEGCG修復效果顯著優(yōu)于同濃度EGCG。在預防模式中,紫外線輻射前施加EGCG和AcEGCG均可有效抑制因紫外線照射導致的細胞存活率下降,顯著提高細胞內的抗氧化酶活性,抑制脂質過氧化產(chǎn)物丙二醛的產(chǎn)生,且一定濃度下,AcEGCG的保護效果顯著優(yōu)于同濃度EGCG。因此,AcEGCG在紫外線損傷預防及修復方面具有應用潛力。

    3.3 保護黑色素細胞

    黑色素細胞損傷、功能消退或數(shù)量減少在白癜風的發(fā)生發(fā)展中占據(jù)重要地位。研究表明,在氧化應激條件下,人表皮黑色素細胞的存活率降低,胞內乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)泄漏量增加,胞內ROS水平明顯升高,Caspase-9和Caspase-3表達量升高。目前認為ROS引起的氧化應激參與了白癜風的發(fā)病,而抗氧化治療是防治白癜風的有效途徑之一。Wang Siyu等研究發(fā)現(xiàn),40 μmol/L AcEGCG可以提高HO處理下黑色素細胞存活率(91%),顯著高于同濃度EGCG(黑色素細胞存活率67.6%)、全丙?;疎GCG及全丁?;疎GCG。Ning Weixuan等研究發(fā)現(xiàn),AcEGCG對HO誘導的黑色素細胞氧化應激損傷有顯著的保護作用。AcEGCG能夠提高細胞存活率,降低LDH泄漏量、細胞內ROS產(chǎn)生量以及Caspase-9和Caspase-3表達量,且其活性顯著高于EGCG,提示AcEGCG能夠通過抗氧化應激和抗凋亡作用保護人黑素細胞。同時,初步臨床觀察顯示,AcEGCG和EGCG治療白癜風療效與商用藥物愛寧達相當,但AcEGCG起效快、作用濃度低、安全性更佳。因此,AcEGCG可能成為治療白癜風的新藥。

    3.4 抗炎癥、抗癌活性

    AcEGCG的抗癌活性已得到廣泛證實,其對人子宮內膜癌、食管癌、結腸癌、乳腺癌、宮頸癌、肺癌、肝癌等均展示出較好的抑制活性,且活性均高于EGCG(表2)。AcEGCG的抗癌機制涉及多個方面,包括抑制蛋白酶體、誘導癌細胞凋亡、影響癌癥相關基因的表達、抑制血管生成等:1)泛素-蛋白酶體通路是蛋白質降解的重要途徑,該通路的陰斷可以影響細胞內多個短周期蛋白的降解,進而誘導癌細胞凋亡。Lam等研究發(fā)現(xiàn),AcEGCG抑制蛋白酶體和誘導MCF7乳腺癌細胞凋亡的活性強于EGCG,是一種潛在的EGCG蛋白酶體抑制劑和抗癌的藥物前體。Landis-Piwowar等也發(fā)現(xiàn),相比EGCG,AcEGCG對人乳腺細胞MDA-MB-231蛋白酶體抑制活性、生長抑制活性及凋亡誘導活性大幅提高。2)在皮膚腫瘤形成的過程中,腫瘤干細胞標記物CD34的表達是干細胞激活和腫瘤形成所必需的,同時蛋白激酶D1(protein kinase D1,PKD1)對于角質細胞的增殖和分化過程均具有重要的調節(jié)作用。Chiou等研究發(fā)現(xiàn),在多期小鼠皮膚癌變模型中,AcEGCG能夠通過抑制CD34的表達和PKD1的激活有效預防皮膚癌變。3)血管生成對惡性腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉移產(chǎn)生重要作用,因此,抑制腫瘤血管生成是治療腫瘤的重要策略之一。血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)能夠促進血管內皮細胞進行有絲分裂,從而刺激血管的形成。而絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)/細胞外調節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)信號通路中磷酸化蛋白p-ERK1/2、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3 kinase,PI3K)/絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase,AKT)信號通路中磷酸化蛋白p-AKT的激活以及缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor,HIF)-1α的高水平表達均可引起mRNA的過度表達。陳潤麗研究發(fā)現(xiàn),AcEGCG通過降低p-ERK1/2、p-AKT以及缺氧條件下HIF-1α的高表達,減少VEGF的分泌,進而抑制人臍靜脈內皮細胞的生成,最終抑制人肝癌血管的生成,其抑制作用強于EGCG(表2)。Wang Jianzhang等發(fā)現(xiàn),AcEGCG一方面通過抑制PI3K/AKT/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)/HIF-1α通路,減少VEGFA的分泌;另一方面通過下調細胞和趨化因子配體12的表達,限制巨噬細胞的遷移和分化,進而抑制腫瘤相關巨噬細胞分泌VEGFA,通過雙重作用抑制人子宮內膜癌血管的生成。

    表2 AcEGCG和EGCG的抗癌活性Table 2 Anti-cancer activity of AcEGCG and EGCG

    除抗癌活性外,AcEGCG還可通過抗炎作用實現(xiàn)對癌癥的預防。諸多研究證實,體內炎癥是癌變的重要誘因之一,因此炎癥的防控治療是預防癌癥發(fā)生的重要途徑。Chiou等研究發(fā)現(xiàn),AcEGCG對炎癥性腸病和可能與結腸炎相關的結腸癌具有潛在的預防效果。相比EGCG,AcEGCG對右旋糖酐硫酸鹽鈉刺激引起的小鼠結腸縮短、異常隱窩灶和淋巴樣結節(jié)的形成具有更好的預防作用。從分子水平看,AcEGCG可以通過抑制組蛋白3賴氨酸殘基9位乙?;?、下調PI3K/Akt/NF-κB磷酸化和p65乙酰化、激活ERK1/2信號通路和乙?;艘蜃覧2相關因子2、上調血紅素加氧酶-1的表達量,最終降低促炎介質水平及抑制結腸炎的發(fā)生。進一步的研究也證實,飼喂AcEGCG可以顯著降低小鼠結腸炎驅動的結腸癌。

    在癌癥治療中,AcEGCG能夠增強癌細胞的藥物敏感性、逆轉癌癥多藥耐藥性。Heyza等在H460肺癌腫瘤移植小鼠模型中發(fā)現(xiàn),60 mg/kgAcEGCG可以顯著增強順鉑的抗癌活性,在研究周期內(24 d)小鼠體內的腫瘤幾乎未生長。葉敏發(fā)現(xiàn),AcEGCG可以顯著提高阿霉素對癌細胞的抑制作用。Ou Bingning等研究發(fā)現(xiàn),AcEGCG聯(lián)合5-氟脲嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)的抑瘤率為40.53%,與EGCG聯(lián)合5-FU(30.87%)相比具有顯著性差異;在一定劑量范圍內,AcEGCG聯(lián)合柔紅霉素對人肝癌細胞SMMC-7721的增敏作用較EGCG強。因此AcEGCG在與抗癌藥物協(xié)同作用方面較EGCG更具潛力。

    同時,AcEGCG還可緩解抗癌藥物的毒性,減輕臟器損傷。柔紅霉素常用于治療抗腫瘤藥耐藥的急性淋巴細胞或粒細胞白血病,但其心臟毒性可以導致機體心律失常,使血清心肌酶譜和高敏肌鈣蛋白T水平明顯升高,血清和心肌超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性降低,丙二醛含量增多,并造成心肌超微結構損傷。在小鼠模型中,AcEGCG可拮抗上述變化,對柔紅霉素所致的心臟毒性具有保護作用,其作用機制可能與增強SOD活力和抗脂質過氧化有關。環(huán)磷酰胺對惡性腫瘤具有較好的療效,但其毒副作用常導致骨髓抑制、出血性膀胱炎、生殖毒性、心臟毒性和肝毒性等。杜亞俊研究發(fā)現(xiàn),AcEGCG和EGCG對環(huán)磷酰胺引起的肝臟組織損傷有一定的保護作用,且在低劑量時AcEGCG比EGCG的作用更明顯。

    3.5 降糖、保護視力、抗氧化(體外)、抑菌等活性

    -葡萄糖苷酶和-淀粉酶可以將食物中的糖類化合物降解為單糖,促進其吸收利用。但糖尿病患者則需要適當抑制該類酶的活性,減緩糖類代謝,維持血糖平衡。葉敏研究發(fā)現(xiàn),AcEGCG對-葡萄糖苷酶和-淀粉酶具有較高的抑制活性,IC分別為58.73、101.4 μg/mL,高于EGCG(IC分別為291.3、125.0 μg/mL)。脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)由脈絡膜毛細血管過度生長以及視網(wǎng)膜色素上皮向Bruch膜擴散形成,常見于許多眼部疾病,與視力下降密切相關?;贏cEGCG高效的血管生成抑制作用,其對于CNV引起的眼部疾?。ㄈ缋夏晷渣S斑變性)也具有較好的緩解作用。Xu Jiaowen等研究發(fā)現(xiàn),AcEGCG通過抑制HIF-1α/VEGF/VEGFR2途徑和M1型巨噬細胞/小膠質細胞極化,減少血管內皮細胞增殖、遷移和血管的形成,最終減緩小鼠眼部CNV的形成。因此,AcEGCG在糖尿病、眼部疾病的預防及治療中具有一定應用潛力。

    EGCG含有酚羥基結構,能夠為氧化過程中的自由基R·提供H·,結束自由基的傳播而終止氧化反應,因而具有較強的抗氧化性。而AcEGCG的酚羥基被酰化,從結構分析看,其抗氧化活性應該低于EGCG。王偉偉等研究發(fā)現(xiàn),AcEGCG清除自由基活性與其取代度有一定關系,總抗氧化活性、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除活性和羥自由基清除活性隨著取代度增加而逐漸減弱,超氧陰離子自由基清除活性隨著取代度的增加呈先升高后降低趨勢。Utenova等發(fā)現(xiàn),AcEGCG的DPPH自由基清除活性顯著低于EGCG。因此,從結構-活性的角度,特別是從自由基清除活性方面考慮,AcEGCG是否存在修飾過當?shù)膯栴}仍有待探究。但值得注意的是,AcEGCG的脂溶性高于EGCG,因而對其抗氧化能力的評價還需考慮所用的溶劑體系及評價方法。朱松利用過氧化值法和Rancimat儀法探究了部分乙?;疎GCG在油脂中的抗氧化活性,結果發(fā)現(xiàn)在相同添加量(200 mg/kg)下,部分乙酰化EGCG在油脂中的抗氧化活性高于EGCG以及二丁基羥基甲苯,證實乙?;疎GCG在油脂類食品中的抗氧化潛力。因此,可以推測AcEGCG在油脂(非水相)體系中具有潛在抗氧化活性,但還需進一步研究證實。

    EGCG具有廣譜抑菌活性,可通過破壞細胞膜、干擾遺傳物質及蛋白質的合成、誘導胞內氧化應激等多層次作用抑制有害細菌的增殖。對EGCG進行乙?;揎棧湟志钚砸舶l(fā)生改變。Kalaiselvi等利用瓊脂稀釋法比較了EGCG和AcEGCG的抑菌活性,結果發(fā)現(xiàn),EGCG對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌的最小抑菌質量濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)分別為130、150、200、250 μg/mL,而AcEGCG對這4 種細菌的MIC為100、120、150、200 μg/mL,可見EGCG經(jīng)全乙?;揎椇笠志钚燥@著提高。朱媛等以乙酸酐為?;瘎?,乙酸乙酯為溶劑,吡啶為催化劑,利用回流加熱得到茶多酚乙?;揎棶a(chǎn)物,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)乙?;瓒喾訉Υ竽c桿菌的抑菌圈直徑為8.64 mm,MIC為0.1 mg/mL。抑菌活性顯著高于未改性的茶多酚(抑菌圈直徑小于6.5 mm,MIC=0.15 mg/mL)以及山梨酸鉀和苯甲酸鈉等防腐劑,進一步證實乙?;揎検翘岣叨喾右志ЯΦ挠行Х绞?。然而目前關于AcEGCG的抑菌作用及抑菌機制研究仍十分有限,其在食品體系中的實際應用也需系統(tǒng)探究。AcEGCG和EGCG的生物活性綜合比較分析見表3。

    表3 AcEGCG和EGCG的生物活性比較分析Table 3 Comparative analysis of AcEGCG and EGCG

    4 結 語

    EGCG廣泛的生物活性使其在食品加工與安全、人體疾病的預防與治療等方面意義顯著。隨著EGCG結構修飾研究的深入,乙?;疎GCG尤其是AcEGCG已經(jīng)引起研究者的關注。相比EGCG,AcEGCG的穩(wěn)定性、脂溶性及生物利用度顯著改善,且多種生物活性也得到顯著提升,因而是優(yōu)良的食品、化工原料及廣譜藥物。AcEGCG對機體細胞的保護作用使其在保健食品、白癜風類藥物、護眼藥物、修復類藥物、化妝品等的研發(fā)中具有良好的應用潛力。另外,AcEGCG顯著的抗炎癥、抗腫瘤、抗癌活性表明其對于癌癥的預防和治療有著積極的意義,是潛在的新型抗癌藥物。因此,不斷加大對AcEGCG合成技術的研究和改進力度,深化AcEGCG生物活性機制的探索,對于我國食品、醫(yī)藥及日用化工領域的發(fā)展均有著積極的促進作用。

    目前,AcEGCG的工業(yè)化生產(chǎn)及應用仍處于起步階段,建議對AcEGCG的后期研究從以下幾個方面開展:1)繼續(xù)開發(fā)綠色、可控、高效、可持續(xù)的AcEGCG合成方法,促使實驗研究向生產(chǎn)化的轉變,滿足規(guī)?;a(chǎn)的需要。2)進一步完善AcEGCG的生物活性,如探究AcEGCG在非水相體系、真實食品體系以及機體內的抗氧化、抑菌等作用,擴展其潛在的應用領域。3)AcEGCG的抗腫瘤、抗癌活性已得到大量證實,但其涉及的內在機制仍有待進一步研究,同時還須加強對臨床試驗的探索。4)AcEGCG為EGCG的乙?;苌铮錂C體內外的代謝和降解機制可能更為復雜,需要更深入系統(tǒng)的研究。5)更重要的是,需系統(tǒng)比較AcEGCG與部分乙?;蚱渌;?、其他修飾、或乙酰化與其他修飾聯(lián)合得到的EGCG衍生物特性與生物活性,以確證AcEGCG是否存在修飾過當?shù)膯栴},同時為EGCG衍生物的進一步研發(fā)、功效化和市場化提供科學依據(jù)。綜上,AcEGCG作為安全、有效的EGCG前體物質具有巨大的開發(fā)潛力。

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