果酒中香氣化合物的生物轉(zhuǎn)化與調(diào)控機制研究進展

田懷香，熊娟涓，于海燕，陳 臣，婁新曼

（上海應用技術大學香料香精技術與工程學院，上海 201418）

未來食品發(fā)展兼具“健康”與“美味”雙導向，果酒風味誘人、低酒精度（乙醇體積分數(shù)0.5%～15%）和高營養(yǎng)價值（如維生素、多酚、低聚糖等）等優(yōu)點符合消費者口味與健康需求，因此倍受喜愛。根據(jù)中國產(chǎn)業(yè)信息網(wǎng)報道，2021年我國果酒產(chǎn)量約為205.3萬 kL，市場規(guī)模突破千億元。發(fā)展果酒產(chǎn)業(yè)不僅有利于豐富水果的精深加工產(chǎn)品，還能提高水果資源的高值化利用，具有廣闊的市場前景，而發(fā)酵原料及發(fā)酵工藝的不同也使得果酒中香氣化合物各具特點。

不同微生物在果酒發(fā)酵的各個階段扮演著相應角色，其生長代謝、產(chǎn)酶能力和酶活力及菌種間相互作用都對果酒風味形成具有重要意義。水果中存在大量香氣前體物質(zhì)（如糖、糖苷、氨基酸等），這些物質(zhì)通常不具有香氣屬性，經(jīng)微生物、酶的作用發(fā)生一系列生化反應，進而轉(zhuǎn)化為香氣化合物。如香葉醇、香茅醇等萜烯類化合物，通常以無味的糖苷結合態(tài)形式存在，利用微生物發(fā)酵過程分泌的糖苷酶催化糖苷鍵水解，釋放具有香氣的游離糖苷配體，從而對果酒起到增香作用。生物調(diào)控是形成果酒最佳或理想風味的關鍵手段，深入了解微生物、酶與香氣間的關系，對于控制果酒發(fā)酵，提高果酒風味品質(zhì)具有重要意義。

本文綜述不同果酒中主要香氣化合物及其生物轉(zhuǎn)化途徑，闡明香氣前體物質(zhì)對果酒香氣的貢獻；探討微生物和酶對果酒香氣化合物的生物調(diào)控機制，并展望未來果酒的研究熱點，為建立以風味導向為基礎的果酒定向調(diào)控方法提供技術參考。

1 果酒中主要的香氣化合物

香氣是衡量果酒風味品質(zhì)的關鍵指標，按香氣化合物結構的不同可分為酯類、醇類、萜烯類等，正是各種香氣成分的協(xié)同相互作用形成了果酒的特征香氣，并隨著發(fā)酵工藝（圖1）的不同而有所差異。

圖1 果酒的發(fā)酵工藝Fig. 1 Fermentation process of fruit wine

酯類物質(zhì)被視為果酒香氣的主體成分，可賦予果酒果香和花香屬性，它們主要來源于酵母的生物合成或在脂肪酶作用下催化酸和醇發(fā)生酯化反應生成。高甜甜等發(fā)現(xiàn)辛酸乙酯、庚酸乙酯、乙酸乙酯和月桂酸乙酯為楊梅果酒的主要酯類，且辛酸乙酯和庚酸乙酯為新增發(fā)酵香氣，含量在發(fā)酵過程呈現(xiàn)上升趨勢。果酒香氣的形成除了香氣化合物自身閾上濃度貢獻，還存在閾下濃度的協(xié)同增效作用。櫻桃酒中癸酸乙酯和水楊酸甲酯含量雖低于閾值濃度，但在重組模型中二者可以明顯提高果酒的甜香和果香屬性，并降低嗅覺閾值。與25 ℃相比，低溫條件（15 ℃）下發(fā)酵的葡萄酒中檢測到更多的丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯等。這主要與?；D(zhuǎn)移酶有關，低溫條件下該酶活力更強，更有利于酯類物質(zhì)積累。

高級醇是具有3 個及以上碳原子的一元醇總稱，在發(fā)酵過程主要通過降解代謝和合成代謝兩種途徑生成。其中，合成途徑是通過丙酮酸脫羧酶、脫氫酶將葡萄糖代謝產(chǎn)生的酮酸經(jīng)脫羧、脫氫還原成高級醇；而降解代謝是氨基酸通過轉(zhuǎn)氨作用生成的酮酸，在轉(zhuǎn)氨酶和脫羧酶作用下形成醛，最終轉(zhuǎn)變?yōu)楦呒壌迹▓D2）。隨著李子果酒發(fā)酵的進行，異戊醇含量先升高后下降，隨后趨于穩(wěn)定，而苯乙醇含量呈明顯上升趨勢。適量的高級醇可以增強果酒的果香和花香特征，但濃度過高會造成口感粗糙苦澀并具有較強的致醉性，因此，果酒發(fā)酵過程應嚴格控制高級醇的產(chǎn)生。

圖2 香氣化合物代謝的一般途徑Fig. 2 General pathways for the synthesis of aroma compounds

酸類化合物主要來源于果實本身，適量的酸類物質(zhì)可以為果酒帶來清爽口感，使酒體更加圓潤，也有助于陳釀過程香氣的進一步演變。榴蓮果實中的丙酸、戊酸、庚酸和壬酸在發(fā)酵過程被代謝，含量到微量水平，并生成相應的酯類物質(zhì)，如丙酸乙酯和己酸乙酯，而辛酸和癸酸隨著發(fā)酵過程的推進含量增加至適當水平，從而賦予果酒奶香風味。于海燕等通過計算香氣活力值，確定癸酸、月桂酸等為黃桃果酒的主要酸類物質(zhì)，在發(fā)酵后期酸類化合物含量增長了5～8 倍，賦予果酒溫和的椰子香及果香屬性。

醛酮類化合物是果酒香氣的重要協(xié)調(diào)成分，雖然在果酒中含量低，但其閾值較低，對果酒香氣具有不可忽視的作用。Dellacassa等發(fā)現(xiàn)菠蘿酒中存在3-羥基-2-丁酮、2-戊酮、苯甲醛等醛酮類化合物，賦予果酒奶香、苦杏仁和香蕉等香氣屬性，這也是醛酮類化合物首次在菠蘿酒中被報道。在柚子酒發(fā)酵過程中醛、酮類物質(zhì)含量先下降后上升，而檸檬醛等物質(zhì)僅存在于發(fā)酵早期和中期，因此，可根據(jù)其含量判斷果酒的發(fā)酵程度。此外，醛酮類化合物間也可通過協(xié)同作用提高風味感知。當酸奶中2,3-丁二酮、乙醛和3-羥基-2-丁酮質(zhì)量濃度比為4∶16∶32時，可以顯著降低各化合物在酸奶中的香氣閾值，使整體香氣強度達到最佳。

萜烯類化合物主要由香氣前體物質(zhì)經(jīng)水解或酵母發(fā)酵代謝產(chǎn)生，萜烯類糖苷也是最早鑒定出的香氣糖苷。大多數(shù)萜烯類物質(zhì)的形成與非釀酒酵母（如、、sp.等）和釀酒酵母（）的混合發(fā)酵及其分泌的糖苷酶活力有關。高產(chǎn)葡萄糖苷酶的酵母菌種發(fā)酵的桑葚果酒中香茅醇、香葉醇和橙花醇等萜烯類含量較高，可賦予果酒更多的果香、甜香、青香、鈴蘭和柑橘香氣。研究表明，香葉醇與香茅醇以非競爭方式與人嗅覺受體上足夠多的活性位點作用，隨著二者含量增加，香葉醇與香茅醇與更多的活性位點結合，香氣強度增大；而當二者含量增加到一定水平后，香茅醇會搶占原本與香葉醇作用的活性位點，使整體香氣強度逐漸減弱。

2 果酒中香氣化合物的生物轉(zhuǎn)化

按照不同工藝階段，果酒香氣可分為品種香、發(fā)酵香和陳釀香，本文主要對品種香和發(fā)酵香進行介紹。品種香直接來源于果實的香氣物質(zhì)，主要由果實自身含有的可溶性糖、氨基酸和脂肪酸等香氣前體物質(zhì)水解形成。而果酒的發(fā)酵香則是微生物通過乙醇發(fā)酵或蘋果酸-乳酸發(fā)酵（malolactic fermentation，MLF）將果實中的香氣前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為高級醇、乙酯類等物質(zhì)（圖2）。

2.1 香氣前體物質(zhì)對果酒香氣的貢獻

2.1.1 糖及糖苷

碳水化合物不僅為酵母菌代謝提供主要能量來源，而且果酒的品種香也主要來自于碳水化合物的次生代謝產(chǎn)物。首先，葡萄糖代謝生成丙酮酸，然后經(jīng)脫羧、脫氫作用轉(zhuǎn)化為乙醇，并在脂肪酸?；o酶A和?；D(zhuǎn)移酶的催化作用下生成酯類化合物，而脂肪酸?；o酶A在磷酸轉(zhuǎn)移酶的催化作用下生成酸類化合物。發(fā)酵體系中糖的種類、含量以及揮發(fā)性化合物極性和疏水作用均會影響香氣釋放。葡萄糖的添加會提高葡萄酒植物香和花香屬性，果糖和蔗糖會極大改善青草味，而麥芽糖則有助于花香、酯香、果香和甜香的形成。與蔗糖作為碳源進行發(fā)酵相比，將糯米作為青梅酒碳源，可提高酒中酯類和醇類含量，且1-己醇和苯甲醛為糯米發(fā)酵特有的代謝產(chǎn)物。Pan Xin等發(fā)現(xiàn)添加5%（質(zhì)量分數(shù)）的葡萄糖或果糖后，由于鹽析效應，芒果汁中丁酸乙酯濃度顯著增加，而15%（質(zhì)量分數(shù)）的添加量分別導致月桂烯含量顯著降低55%和48%（＜0.05），這可能是由于高質(zhì)量分數(shù)蔗糖增加了果汁黏度，或增強了香氣化合物與糖的疏水作用，進而陰止香氣成分的釋放。

香氣糖苷是以非揮發(fā)性鍵合態(tài)形式存在，香氣物質(zhì)以苷元形式與糖基通過糖苷鍵結合，可在糖苷酶作用下釋放出游離芳香物質(zhì)。彭邦遠等采用杏仁葡萄糖苷酶對刺梨汁中鍵合態(tài)萜烯進行酶解，26 種新增香氣成分被釋放。采用葡萄糖苷酶水解‘媚麗’葡萄和葡萄酒中的萜烯類化合物后，芳樟醇含量明顯增多，提高了葡萄酒花香和柑橘香氣屬性，而同時接種酵母和糖苷酶水解更有利于苯乙基類和酯類物質(zhì)的產(chǎn)生，發(fā)酵香與品種香相互作用，豐富了葡萄酒香氣。一些揮發(fā)性酚也以糖苷形式存在，如丁香酚。在藍莓酒發(fā)酵過程中釀酒酵母和非釀酒酵母產(chǎn)生的葡萄糖苷酶可選擇性水解酚類糖苷，使丁香酚含量顯著升高。由于酶具有反應溫和、專一、高效等特點，可最大限度地提高香氣化合物產(chǎn)量，在改善果酒風味方面具有廣泛的應用前景。

2.1.2 氨基酸

氨基酸代謝過程主要是支鏈酮酸在脫羧酶的催化下生產(chǎn)醛，然后通過乙醇脫氫酶轉(zhuǎn)化為醇，進而與脂肪酸?；o酶A在?；D(zhuǎn)移酶的作用下生成酯類物質(zhì)，或是在磷酸轉(zhuǎn)移酶的催化作用下生成酸類物質(zhì)（圖2）。與銨鹽相比，氨基酸作為營養(yǎng)補充劑更有利于乙醇發(fā)酵，如精氨酸、纈氨酸對的生長和發(fā)酵速率均具有積極作用，并能促進異丁醇、苯乙醇和異戊醇的產(chǎn)生。氨基酸的濃度與其衍生的芳香化合物濃度之間存在線性關系，可通過添加氨基酸的種類來預測果酒中香氣化合物組成。Liu Dan等發(fā)現(xiàn)亮氨酸、組氨酸、甘氨酸分別與獼猴桃果酒中醇類、萜烯類和酯類含量呈正相關，而在發(fā)酵時添加苯丙氨酸可增加荔枝酒中苯乙醇及酯類化合物含量。以上研究均表明氨基酸對果酒發(fā)酵香的產(chǎn)生具有重要貢獻。

2.1.3 脂肪酸

脂肪酸主要通過α-/β-氧化和酶促氧化途徑代謝產(chǎn)生直鏈脂肪族酯類、醇類、內(nèi)酯類等香氣化合物，飽和脂肪酸可通過β-氧化進行循環(huán)代謝，脂肪酸被氧化成脂肪族乙酰輔酶A后，再與乙酰輔酶A氧化酶反應，形成內(nèi)酯類化合物。C～C內(nèi)酯化合物通常具有椰子香和蜜桃香，可利用脂肪酸通過脂氧合酶途徑經(jīng)氧化、裂解、脫氫生成。許多中鏈脂肪酸，如辛酸、癸酸、月桂酸通常在發(fā)酵后期生成，當其濃度過高時往往會產(chǎn)生不愉快的感官屬性，但它們所對應的乙酯類化合物則為果酒提供宜人的果味、花香和白蘭地香氣。通過模擬葡萄酒發(fā)酵體系發(fā)現(xiàn)辛酸與辛酸乙酯的形成具有顯著相關性，推測辛酸可能是合成辛酸乙酯的前體物質(zhì)之一。添加不飽和脂肪酸可以促進葡萄酒中揮發(fā)性硫醇和酯類化合物的生成，而飽和脂肪酸的添加使得酒中氨基酸和有機酸含量提高。此外，在果酒發(fā)酵和陳釀過程中，有機酸也可與醇類物質(zhì)發(fā)生酯化反應生成乙酸乙酯、月桂酸乙酯、乙酸異戊酯等，對果酒的香氣具有不可忽略的貢獻。

2.2 發(fā)酵過程果酒香氣化合物的形成

在發(fā)酵過程中果酒香氣特征呈現(xiàn)動態(tài)變化（圖3）。發(fā)酵初始的石榴汁中共檢測出25 種香氣化合物，在發(fā)酵第8天香氣化合物種類增至67 種，其中，萜烯類化合物種類增加最為顯著。這也與葡萄酒、藍莓酒及桑葚酒發(fā)酵過程中萜烯類物質(zhì)的變化趨勢一致。在發(fā)酵初期，丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯和3-羥基丁酸乙酯為梨酒的關鍵香氣成分，而乙酸乙酯、松油醇、檸檬烯在發(fā)酵后期的貢獻更大。通過發(fā)酵作用，越桔果酒中乙酸乙酯、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丙醇含量急劇上升，且超過了它們的感官閾值。隨著發(fā)酵過程的推進，最初存在于榴蓮中的酯類化合物，如2-甲基丁酸甲酯、2-丁烯酸乙酯和2-甲基丁酸丙酯逐漸被降解，而乙酸乙酯、乙酸異戊酯和琥珀酸二乙酯含量升高，這些酯類化合物的產(chǎn)生與它們的酸類前體物質(zhì)代謝有關。Wattanakul等在芒果酒中檢測到7 種萜烯類物質(zhì)，但各物質(zhì)在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)不同的變化趨勢：香葉醇含量逐漸下降，可能被轉(zhuǎn)化為香茅醇等其他萜醇類化合物，而香茅醇、反紫羅蘭酮等化合物含量顯著增加，這可能是由于酵母分泌的乙酰輔酶A促進了相關前體物質(zhì)合成。由于微生物發(fā)酵誘導游離萜烯苷元釋放，藍莓果酒在發(fā)酵第6天后萜烯總含量迅速積累。由此可見，發(fā)酵階段是果汁到果酒香氣變化的主要階段，而微生物在這個階段中扮演著關鍵角色。隨著全基因組測序技術的迅猛發(fā)展，包括基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、代謝組學在內(nèi)的食品組學技術被廣泛應用于果酒風味的改善。通過基因工程手段將非釀酒酵母中具有編碼香葉醇合成酶的基因?qū)胫羞M行表達，發(fā)現(xiàn)其用于發(fā)酵時更有利于白葡萄酒中萜烯類化合物的生成。釀酒酵母中和是影響橙花叔醇和苯乙醇合成的關鍵基因，而乙酸乙酯的合成主要涉及和基因的表達，基因在釀酒酵母中過度表達后使得葡萄酒中4-巰基-4-甲基-2-戊酮的釋放增加。揭示香氣化合物與微生物代謝的關系有助于進一步靶向篩選發(fā)酵菌株及優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)促進香氣化合物的定向內(nèi)源積累。

圖3 果酒發(fā)酵前后香氣化合物變化Fig. 3 Change of aroma compounds before and after the fermentation of fruit wine

不同菌種和發(fā)酵工藝下各種果酒的主要香氣化合物組成如表1所示。

表1 不同果酒中主要香氣化合物組成Table 1 Major aroma compounds in various fruit wine

3 果酒香氣化合物的生物調(diào)控機制

3.1 發(fā)酵菌種相互作用對果酒香氣的影響

果酒特色香氣與微生物之間存在必然聯(lián)系，菌種間的相互作用對果酒香氣化合物的形成以及最終產(chǎn)品的風味品質(zhì)具有決定性作用。研究表明，自然發(fā)酵更有利于果酒中菌群多樣性的形成，包括短乳桿菌（）、明串珠菌（）、有孢漢遜酵母（）、膠紅酵母（）等。但自然發(fā)酵耗時較長，且整個發(fā)酵過程的調(diào)控度低，合成的特征香氣強度弱，因此，通過人工調(diào)控方式將關鍵菌株進行混合接種，調(diào)節(jié)釀造微生態(tài)，以實現(xiàn)香氣化合物的內(nèi)源積累（圖4）。

圖4 香氣與微生物發(fā)酵間的關系Fig. 4 between aroma compounds and microorganisms during wine fermentation

3.1.1 釀酒酵母與非釀酒酵母

目前果酒的工業(yè)生產(chǎn)通常采用商業(yè)釀酒酵母，以單菌發(fā)酵為主。雖然單菌發(fā)酵可以使酵母菌充分利用原料的營養(yǎng)物質(zhì)，提高乙醇生產(chǎn)率，但生產(chǎn)出的果酒往往口感單一，揮發(fā)性香氣化合物種類和含量較少。乙醇含量過高會抑制果酒中其他香氣成分的揮發(fā)特性，10%左右乙醇更有利于香氣的釋放與積累，而非釀酒酵母的乙醇生產(chǎn)率低，且可以代謝多種風味酶，促進香氣成分的釋放。基于此，釀酒酵母與非釀酒酵母的混合發(fā)酵方式，已逐漸應用于低酒精度、高風味品質(zhì)的果酒生產(chǎn)。

常見的非釀酒酵母菌株包括、、、畢赤酵母（sp.）、假絲酵母屬（sp.）、克勒克酵母（）、、德巴利漢生酵母（）、美極梅奇酵母（）、耐熱克魯維酵母（）等。將4 種不同的非釀酒酵母分別與混合發(fā)酵黃桃果酒，混合組中乙酸乙酯含量最高，和分別有利于苯乙醇和山梨醇的生成，則有利于高級醇和脂肪酸的代謝合成。在葡萄酒、火龍果酒和越桔果酒中均有類似結論，更有利于葡萄酒和火龍果酒中乙酸苯乙酯、乙酸異戊酯和萜烯類化合物的生成，而可以使越桔果酒產(chǎn)生更多的乙醛、丙酮酸和2,3-丁二醇。蘋果酒混合發(fā)酵過程中，3-甲基丁醇和3-甲基乙酸丁酯的高效合成主要源于克魯維畢赤酵母（）基因組重復編碼的高水平表達，提高對香氣底物亮氨酸的利用。與非釀酒酵母的接種比例及接種方式均對果酒香氣有顯著影響。高比例的發(fā)酵畢赤酵母（）會對的生長產(chǎn)生抑制作用，當二者以1∶1的比例接種會促進果酒中乙酸異戊酯、C～C脂肪酸、異戊醇及苯乙醇等香氣物質(zhì)的形成。Li Yueqi等發(fā)現(xiàn)順序接種與可提高葡萄酒中乙酸乙酯含量，而同時接種更有利于中鏈脂肪酸乙酯生成。此外，不同類型的非釀酒酵母的發(fā)酵特性也存在差異。在混合發(fā)酵中，對乙醇的耐受性較弱，而卻具有較高的存活率。因此，利用混合發(fā)酵改善果酒香氣時也應對非釀酒酵母的特性進行考察，進而篩選出高穩(wěn)定性、高產(chǎn)香能力菌株。

3.1.2 酵母與乳酸菌

乙醇發(fā)酵結束后，往往采用MLF降低果酒酸度，豐富果酒香氣。但乙醇發(fā)酵后，果酒pH值較低、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，且果酒中存在的SO、乙醇等均對乳酸菌活性具有抑制作用。因此，通常采用酵母菌和乳酸菌同時接種來提高乳酸菌的存活率及產(chǎn)香能力。常用于果酒發(fā)酵的乳酸菌主要有、、和片球菌屬（）等，這些乳酸菌具有應激反應基因，如、、和，可以克服相對惡劣的發(fā)酵環(huán)境。Chen Dai等發(fā)現(xiàn)與同時接種發(fā)酵的荔枝果酒中乳酸乙酯、乙酸異戊酯、中鏈脂肪酸等化合物增多，高級醇含量降低，且同時發(fā)酵提高了果酒pH值，使得乳酸菌代謝的糖苷酶活力增強。26、和同時接種發(fā)酵葡萄酒時，更有利于乙酸酯和脂肪酸乙酯的產(chǎn)生，且可以提高26細胞的存活率，進而增強葡萄糖苷酶活力，使芳樟醇、香茅醇等萜烯類化合物的含量增加。Hsp20蛋白是應激狀態(tài)的標志物，轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學結果表明，非釀酒酵母（和）可降低中Hsp20蛋白的水平，從而表明非釀酒酵母對其具有保護作用。Markkinen等利用核磁共振研究MLF對沙棘汁代謝譜的影響發(fā)現(xiàn)，蘋果酸、必需氨基酸和核苷在發(fā)酵早期被代謝，而糖類物質(zhì)的消耗一般發(fā)生在發(fā)酵中后期。綜上，在果酒釀造過程中同時接種和乳酸菌誘導乙醇發(fā)酵和MLF同時進行，可以克服順序發(fā)酵缺點，縮短整體發(fā)酵時間，提升果酒風味。

目前，果酒發(fā)酵香氣的形成主要集中在與非釀酒酵母、與乳酸菌間的相互作用，關于與霉菌的相互作用主要用于白酒和黃酒發(fā)酵，今后關于霉菌對果酒風味的提高作用也應進一步探索。

3.2 工藝參數(shù)對果酒發(fā)酵菌株產(chǎn)香能力的影響

發(fā)酵工藝會影響菌株的代謝活性，進而導致菌株的初級和次級代謝有所區(qū)別，除了原料、發(fā)酵菌種外，預處理方式、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度等參數(shù)均對果酒的風味品質(zhì)產(chǎn)生重要影響。與25 ℃相比，在13 ℃發(fā)酵時，基因表達較低，更有利于葡萄酒中乙醇的積累。不飽和脂肪酸的添加使過表達基因酵母（T73::）發(fā)酵葡萄酒中乙酸乙酯、乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯等物質(zhì)含量顯著增加，并且影響了葡萄酒中高級醇、中鏈脂肪酸水平及其相關基因（、、、、和）表達，而低添加量的不飽和脂肪酸促進了過表達基因酵母（T73::）對辛酸乙酯和癸酸乙酯的合成，且和基因的表達與發(fā)酵溫度呈正相關。以纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸作為氮源，可以增加葡萄酒中揮發(fā)性香氣化合物含量，且與未添加上述3 種氨基酸的對照組相比，發(fā)酵過程25 個基因的表達存在差異，其中參與香氣化合物生物合成的、、、和基因的表達顯著上調(diào)，改善了酵母的發(fā)酵活性，增加了高級醇（82%）、中鏈脂肪酸（34%）及相應酯類的含量（49%）。Heit等觀察到利用葡萄原汁發(fā)酵的葡萄酒其乙酸含量高于稀釋后發(fā)酵的6 倍，而稀釋處理使乙酸乙酯含量增加2.4 倍，且與稀釋處理相比，原汁發(fā)酵過程中和基因表達水平分別下調(diào)至原來的1/19和1/11.2，而基因上調(diào)了14.6 倍，因此，、和的差異表達是導致不同滲透壓條件下乙酸和乙酸乙酯含量不同的原因。綜上，合理添加香氣前體物質(zhì)，并優(yōu)化發(fā)酵工藝是調(diào)控果酒風味品質(zhì)的重要手段。

目前，關于果酒發(fā)酵條件的優(yōu)化已積累了大量研究，為果酒工業(yè)化生產(chǎn)提供了充分的技術保障。通過優(yōu)化發(fā)酵工藝可以豐富果酒中香氣化合物種類和含量。Yuan Lu等利用響應面分析對青棗酒發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，當SO質(zhì)量濃度80 mg/L、還原糖質(zhì)量分數(shù)24%、酵母添加量0.3%、發(fā)酵時間8 d時，更有利于苯乙醇、4-羥基苯乙醇、3-甲基-1-丁醇、異戊醇和琥珀酸二乙酯的合成。當發(fā)酵溫度為20 ℃、料液比1∶2（/）、還原糖質(zhì)量濃度180 g/L時所發(fā)酵的青梅酒中揮發(fā)性香氣物質(zhì)種類（53 種）顯著高于市售樣品（30 種）。當初始糖度為20 °Brix、pH 4.0、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時間96 h，柚子酒中香氣物質(zhì)種類最豐富，柚子的特征香氣化合物檸檬烯含量最高。由于發(fā)酵溫度過高會導致發(fā)酵菌種活力下降、參與生物轉(zhuǎn)化反應的酶失活，導致發(fā)酵不完全、乙醇產(chǎn)量不足，嚴重影響果酒風味，目前低溫發(fā)酵成為果酒生產(chǎn)的趨勢。在低溫條件下，發(fā)酵菌種的代謝和酶活力較低使發(fā)酵時間延長，更多的小分子香氣化合物得以保留。在20 ℃發(fā)酵的葡萄酒中香氣化合物總含量最高，主要為辛酸乙酯和癸酸乙酯，而10 ℃發(fā)酵更利于石竹烯的生成。這說明低溫發(fā)酵對葡萄糖苷酶釋放萜烯苷元和發(fā)酵菌株代謝合成萜烯物質(zhì)能力均有積極作用。

3.3 微生物代謝酶對果酒香氣化合物的影響

果酒發(fā)酵過程涉及多種生化反應，在此過程微生物會代謝產(chǎn)生各種風味酶，如果膠酶、糖苷酶和酰基轉(zhuǎn)移酶等，這些酶可以破壞細胞壁結構、水解結合態(tài)香氣前體物質(zhì)，或參與香氣化合物的代謝合成，從而促進香氣化合物的釋放，增加果酒香氣的復雜度和豐富度。因此，對關鍵酶活力的監(jiān)測和調(diào)控也是提高果酒風味的關鍵步驟。

3.3.1 果膠酶

果膠是一類以半乳糖醛酸為主，由1,4-糖苷鍵連接組成的酸性雜多糖，是植物細胞壁的一部分，除了陰礙果汁提取和澄清，在果酒發(fā)酵過程中對芳香成分的釋放也具有一定的抑制作用。在原料浸漬過程添加果膠酶可促進葡萄酒發(fā)酵過程產(chǎn)生更多的苯乙醇和萜烯類化合物。同樣，經(jīng)果膠酶處理后的火龍果酒中乙酸乙酯、長葉烯等化合物含量顯著提高。研究發(fā)現(xiàn)，維克氏酵母（）、sp.等可通過自身產(chǎn)生的果膠酶、纖維素酶酶解葡萄果皮細胞壁，在提高果汁得率和澄清度的同時促進香氣化合物的釋放。Rollero等從葡萄汁中分離出一株具有分泌高活力果膠酶的，與對照組相比，此菌株釀造的葡萄酒中苯乙醇和苯乙酸乙酯的含量增加，果香屬性顯著提高。Maturano等發(fā)現(xiàn)，乙醇對果膠酶活力具有一定的抑制作用，隨著發(fā)酵時間的延長和乙醇濃度的升高，果膠酶活力逐漸降低，進而陰礙了胞內(nèi)香氣物質(zhì)的釋放。

3.3.2 糖苷酶

糖苷酶可以使糖苷鍵斷裂，釋放糖苷類香氣前體物質(zhì)，主要包括萜烯類和部分酚類糖苷化合物（圖5）。糖苷酶在酵母細胞中的存在方式包括胞內(nèi)、胞外和細胞壁3 種，以胞外酶最為常見，、、、sp.等非釀酒酵母均能分泌高活力胞外糖苷酶。不同酵母菌分泌的糖苷酶活力及其產(chǎn)香能力有所差別。胞外液中葡萄糖苷酶、鼠李糖苷酶、木糖苷酶活力更高，而胞外液中阿拉伯糖苷酶活力更高，前者促進了萜烯類和苯乙基類化合物積累，而后者更有利于脂肪酸乙酯合成。Ovalle等發(fā)現(xiàn)分泌的葡萄糖苷酶對C-降異戊二烯化合物的特異性較為突出，能夠提高果酒中4-氧代-7,8-二氫紫羅蘭醇、3-氧代紫羅蘭醇和吐葉醇等物質(zhì)的合成，豐富了果味、甜味、蜂蜜等香氣屬性。研究發(fā)現(xiàn)，酵母產(chǎn)生糖苷酶的能力和酶活力與和基因密切相關，相對于兩個基因都缺失或僅含有基因的酵母菌，含有基因的酵母菌能分泌高活力的葡萄糖苷酶，且在發(fā)酵過中酶活力也維持在較高的水平。此外，部分乳酸菌也會分泌高活力葡萄糖苷酶。Zhang Jie等從中提取了一種新型葡萄糖苷酶BGL0224用于赤霞珠葡萄酒的增香，結果發(fā)現(xiàn)新增了包括4-萜品醇、蒎烯和乳酸乙酯在內(nèi)的15 種以上香氣化合物，與對照組相比，癸酸乙酯、辛酸乙酯和棕櫚酸乙酯等中、長鏈脂肪酸乙酯含量顯著增加，萜烯類化合物含量提高了2 倍。不同微生物分泌的糖苷酶對果酒的增香效果也存在差異。與商業(yè)糖苷酶相比，從非釀酒酵母中提取的胞外糖苷酶更有助于葡萄酒香氣的形成，而分泌的糖苷酶活力是酵母菌的3.4 倍，提高了櫻桃酒中游離態(tài)萜烯和苯甲酸苷元含量。

圖5 β-葡萄糖苷酶催化釋放香氣物質(zhì)作用示意圖Fig. 5 Release of aroma compounds catalyzed by β-glucosidase

3.3.3 其他風味相關酶

蛋白酶可以水解蛋白質(zhì)，不僅有利于果酒的穩(wěn)定性，更有利于果酒香氣提升。經(jīng)蛋白酶處理的棗酒，可同化氮含量增多，同時，香氣強度和復雜性顯著提高。在葡萄酒發(fā)酵過程添加IWBT Y1123菌株分泌的蛋白酶后，葡萄酒中異丁醇和異戊醇濃度顯著升高。曾朝珍等利用和單獨和混合發(fā)酵蘋果酒，發(fā)現(xiàn)前3 d蛋白酶活力較高，隨后呈現(xiàn)下降趨勢，在混合發(fā)酵中對酸性蛋白酶活力的貢獻多于。而微生物分泌蛋白酶的能力取決于溫度和培養(yǎng)基組成，當溫度處于20 ℃且培養(yǎng)基中含有20 g/L葡萄糖和10 g/L酪蛋白胨時，最適宜酵母生長，蛋白酶活力可達到最大。

微生物可以分泌具有催化酯類物質(zhì)合成的相關酶，以酯酶和脂肪酶為代表，為酯類化合物合成提供了綠色途徑。發(fā)酵過程中調(diào)節(jié)酯酶編碼基因的表達會影響酯類化合物含量，發(fā)酵第5天酒中乙酸乙酯、乙酸異戊酯和乙酸異丁酯的質(zhì)量濃度分別為468.94、99.86、7.69 mg/L，其中乙酸乙酯的質(zhì)量濃度高于對照組22 倍。酵母菌株CS31（CS31）經(jīng)誘變育種所分泌的酯酶整體活力升高，其中C2酯酶的活力較誘變前提升了24.64%，所釀造的菠蘿蜜果酒中酯類化合物提高了60.67%。通過優(yōu)化培養(yǎng)基成分，Y-1所產(chǎn)酯酶活力提高了4.3 倍。Bu?ková等發(fā)現(xiàn)、和等酵母菌株具有較高的產(chǎn)酯酶能力，可以嘗試利用這些微生物進行果酒發(fā)酵，提高酯類化合物含量。目前，有關菌株產(chǎn)酯酶的研究主要集中在白酒、黃酒、醬油等發(fā)酵食品，果酒領域還需繼續(xù)開展相關研究。

醇脫氫酶、丙酮酸脫羧酶等內(nèi)源酶參與了香氣前體物質(zhì)的代謝，與果酒風味形成息息相關。經(jīng)400 MPa處理后脂氧合酶、?；D(zhuǎn)移酶及磷脂酶A2被激活，哈密瓜汁中醛類、醇類物質(zhì)含量得到提升，其中庚醛、()-6-壬烯醛、丁酸乙酯等含量與脂肪酸代謝有關，而乙酸己酯、乙酸庚酯等與氨基酸含量變化密切相關。葡萄酒在發(fā)酵初期，酵母醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶的活力普遍較高，相對于e和球擬假絲酵母（）混合發(fā)酵，e單獨發(fā)酵更有利于維持丙酮酸脫羧酶活力，而醇脫氫酶活力不受發(fā)酵方式影響。因此，可通過控制發(fā)酵pH值、溫度等因素調(diào)節(jié)醇脫氫酶、丙酮酸脫羧酶等關鍵酶活力，獲得酶的最適反應條件，實現(xiàn)果酒發(fā)酵過程香氣化合物的靶向合成。

4 結 語

風味是決定果酒品質(zhì)的關鍵指標，也是影響消費者購買意向的重要屬性。但由于原料的多樣性和釀造工藝的復雜性，發(fā)酵過程往往會造成香氣損失，影響果酒風味品質(zhì)，因此，亟需建立以風味導向為基礎的果酒定向調(diào)控手段。本文從生物調(diào)控角度出發(fā)，綜述了常見果酒中香氣成分的種類、發(fā)酵過程中的香氣成分變化規(guī)律及形成機制；重點解析了近年來果酒釀造過程中發(fā)酵菌種的相互作用和微生物代謝酶等因素對果酒香氣化合物形成的影響。

目前對于果酒風味的研究主要集中于發(fā)酵菌種的篩選、工藝參數(shù)的優(yōu)化和香氣成分的鑒定，對于果酒香氣化合物間的協(xié)同相互作用及香氣與味覺特征的感知相互作用，果酒釀造微生態(tài)機理解析，香氣成分與微生物對應關系的建立等方面研究仍不完善。此外，果酒在發(fā)酵后期的催陳調(diào)控也是提高果酒風味的重要手段，對于新技術在果酒催陳方面的應用仍需不斷探索。因此，加強以上方面的研究更有助于果酒風味品質(zhì)的提升，對我國果酒市場的轉(zhuǎn)型升級具有重要意義。