D101大孔樹脂純化山銀花總皂苷的工藝研究

★ 郭慧玲 羅江南 胡律江 趙曉娟（江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004）

山銀花（Lonicerae flos）又名大銀花，是忍冬科植物灰氈毛忍冬Lonicera macranthoidesHand-azz.、紅腺忍冬Lonicera hypoglaucaMiq.、華南忍冬LoniceraconfuseDC.或黃褐毛忍冬Lonicera fulvotomentosaHsu et S.C.Cheng的干燥花蕾或帶初開的花，要分布于湖南、廣東、四川等南方多省。具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效,主要用于溫病發(fā)熱、喉痹、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒等病癥［1］。山銀花中主要含有機酸類、黃酮類、三萜皂苷類、揮發(fā)油類等化學(xué)成分。山銀花所含皂苷類成分較金銀花高［2］，且關(guān)于山銀花皂苷類成分的藥效研究還不完善，為研究山銀花總皂苷成分的藥效作用，故使用大孔樹脂對山銀花中總皂苷成分進行分離純化，對其工藝及其含量測定方法進行研究。

大孔吸附樹脂為皂苷類成分常用的分離純化方法，其吸附原理為范德華引力或生成氫鍵而產(chǎn)生的一種表面吸附現(xiàn)象［3］；同時由于大孔吸附樹脂的多孔結(jié)構(gòu)使其具有分子篩作用［4］。通過吸附和分子篩原理，有機化合物根據(jù)吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附樹脂上經(jīng)一定溶劑洗脫而達到分離、純化、除雜、濃縮等不同目的，且具有選擇性高、干擾因素少、可重復(fù)循環(huán)利用等特點［5］，廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域［6］。

本實驗采用比色法測定山銀花提取物和各個洗脫物中總皂苷的含量，并以此為指標，探究山銀花總皂苷最佳的上樣濃度，洗脫流速，動態(tài)吸附泄露曲線等分離純化工藝，為山銀花藥材進一步開發(fā)利用提供有力依據(jù)。

1 材料

HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；DHG-9023A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（蘇州江東精密儀器有限公司）；KQ5200DA型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水多用真空泵（鄭州杜甫儀器廠）；Q/TBCR1型752-紫外可見分光光度計（上海欣茂儀器有限公司）；山銀花藥材（產(chǎn)自湖南，購于樟樹市慶仁中藥飲片有限公司，批號：190428 經(jīng)由江西中醫(yī)藥大學(xué)鄧可眾副教授鑒定為忍冬科植物灰氈毛忍冬的花蕾）；灰氈毛忍冬皂甘乙標準品（批號：111814-201604，純度為94.4% 中國食品藥品檢查研究院）；D101大孔樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；冰醋酸 （分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）；香草醛（型號：V8080，索萊寶生物科技有限公司）；高氯酸（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；層析柱（規(guī)格：2 cm×23 cm，江蘇漢邦科技）；乙醇（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 供試品和對照品的制備

2.1.1 山銀花水提液的制備 稱取山銀花藥材適量，液料比為15∶1，加熱回流2 h，提取2次，過濾，合并濾液，將濾液濃縮，獲得不同濃度的山銀花水提液。

2.1.2 對照品溶液的配制 精密稱取灰氈毛忍冬皂苷乙對照品10 mg，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，獲得1 mg/mL對照品溶液。

2.2 山銀花水提液總皂苷含量測定方法

參照文獻精密吸取山銀花水提液適量，水浴揮干溶劑后依次精密加入新配的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.6 mL，加塞混勻后于70 ℃水浴鍋中恒溫加熱30 min，加熱后取出水浴冷卻，再加入5 mL冰醋酸，搖勻，利用紫外分光光度法于477 nm處測定吸光度［7］。

2.3 D101大孔樹脂對山銀花總皂苷的吸附及解吸附性能考察

2.3.1 樹脂預(yù)處理 取大孔吸附樹脂于適當(dāng)?shù)腻F形瓶中，加入無水乙醇浸泡24 h后，用無水乙醇沖洗大孔樹脂至醇與水混合（1∶5）不產(chǎn)生白色混濁，在用大量蒸餾水沖洗至無醇味，備用。

2.3.2 靜態(tài)吸附時間考察 稱取2 g干樹脂于錐形瓶中，預(yù)處理后，加入0.2 g/mL的藥液20 mL，置于25 ℃恒溫搖床中振蕩，分別于0，1，5，8，11，13，24 h取樣測定藥液中總皂苷濃度，得到總皂苷濃度與時間關(guān)系。見圖1。

圖1 靜態(tài)比吸附量與時間關(guān)系圖

靜態(tài)比吸附量=（樣品總皂苷質(zhì)量-吸附后總皂苷質(zhì)量）/樹脂質(zhì)量

當(dāng)樹脂吸附藥液5 h后，藥液中的總皂苷濃度變化不大，可在藥液上樣后吸附5 h再進行洗脫。

2.3.3 上樣濃度的考察

稱取5 g已完成預(yù)處理的干樹脂5份，裝柱，以1 mL/min的上樣速度，分別向樹脂中加入0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 g/mL的藥液30 mL，吸附5 h后，用5 BV的水（水洗量）和5 BV的70%乙醇（洗脫量）進行洗脫，測定比吸附量和解吸率。見圖2。

圖2 不同上樣溶度對比吸附量和解吸量的影響

由圖可知，隨著上樣溶度的增大，比吸附量逐漸增大，解吸率隨著上樣溶度的增大而降低，綜合考慮，選擇0.2 g/mL為最佳上樣濃度。

比吸附量（mg/g）=（上樣量-流出量-水洗量）/樹脂質(zhì)量

解吸率（%）=洗脫量/吸附量

2.3.4 洗脫流速的影響 稱取5 g已完成預(yù)處理的干樹脂5份，裝柱，以1 mL/min的上樣速度，向?qū)游鲋屑尤?.2 g/mL山銀花藥液30 mL，吸附5 h后，分別以1，2，3，4 mL/min的流速用5 BV的水和5 BV的70%乙醇進行洗脫，測定比吸附量和解吸率。見圖3。

圖3 不同洗脫流速對比吸附量和解吸量的影響

由圖可知，隨著洗脫流速的增加，比吸附量逐漸降低，而解吸率在洗脫流速為3 mL/min時最大，不同洗脫流速對比吸附量的影響差異不大，綜合考慮，選擇3 mL/min為最佳洗脫流速。

2.3.5 洗脫溶媒的考察 稱取10 g已完成預(yù)處理的干樹脂，濕法裝柱，向樹脂中加入0.2 g/mL的藥液60 mL，反復(fù)上樣多次，靜置吸附12 h，先用蒸餾水沖洗5 BV，依次用10%，20%，30%，50%，70%，95%乙醇洗脫5 BV,收集每個柱體積為1個流份，測定總皂苷含量。見圖4。

圖4 乙醇體積分數(shù)對總皂苷洗脫效果的影響

由圖可知，10%，20%，30%，95%乙醇洗脫液中都含有少量總皂苷成分，總皂苷主要集中于50%和70%乙醇洗脫液中，70%乙醇能洗脫能力較強，20%和30%乙醇除雜能力相近，故需要對20%，30%乙醇除雜試劑進行篩選。綜合考慮，以20%或30%乙醇溶液進行除雜，再使用70%乙醇洗脫。

2.3.6 動態(tài)吸附泄露曲線的測定 稱取10 g已完成處理的干樹脂，濕法裝柱，向樹脂中緩緩加入0.2 g/mL的藥液125 mL，控制藥液流出速度1 mL/min，每5 mL收集流出液作為1個流份，對收集的所有流份進行總皂苷測定。見圖5。

圖5 山銀花總皂苷動態(tài)吸附泄露曲線

由圖可知，第3個流份中含有少量總皂苷成分，但濃度不超過上樣也濃度的10%，第4個流份中的總皂苷含量突然增加，說明皂苷大量流出，為樹脂的泄露點；第15個流份以后總皂苷濃度基本不改變，說明樹脂吸附達到了飽和，為樹脂飽和點。

2.3.7 除雜試劑的考察 稱取10 g已完成處理的干樹脂2份，濕法裝柱，向樹脂中加入0.2 g/mL的藥液15 mL，反復(fù)上樣多次，靜置吸附5 h，先用蒸餾水沖洗5 BV，再分別用5 BV的20%乙醇和30%乙醇洗脫，最后用5 BV的70%乙醇洗脫,洗脫流速為3 mL/min，收集每個濃度的洗脫液，測定總皂苷含量及除雜后70%乙醇總皂苷純度。見表1。

表1 除雜試劑總皂苷含量及純度表

由表可知，20%乙醇和30%乙醇都能洗脫出一定量的總皂苷成分，經(jīng)過除雜后，70%乙醇洗脫液中總皂苷純度分別為64.76%和78.93%，30%乙醇除雜后的純度較高，故選擇30%乙醇作為除雜試劑。

2.3.8 水、除雜試劑、洗脫劑用量的考察 稱取10 g已完成預(yù)處理的干樹脂，濕法裝柱，向樹脂中加入0.2 g/mL的藥液15 mL，反復(fù)上樣多次，靜置吸附5 h，先用蒸餾水沖洗5 BV，依次用5 BV的30%乙醇，5 BV的70%乙醇洗脫，洗脫流速為3 mL/min，每0.5 BV收集為1個流份，測定總皂苷含量。見圖6、圖7。

圖6 10個流份中總皂苷含量變化曲線圖

圖7 70% 乙醇洗脫液流份中總皂苷的含量變化曲線

水和除雜試劑的第4、第5個流份中的總皂苷含量很低，且經(jīng)過HPLC測定10個流份中的綠原酸含量，第5個流份中含有的綠原酸成分較高，第9個和第10個流份中的綠原酸含量極低。即確定水洗量為5 BV，30%乙醇用量為3 BV。

2.4 山銀花水提液中總皂苷的純化工藝驗證試驗

稱取預(yù)處理好的D101樹脂3份，每份10 g，濕法裝入玻璃層析柱中，用水洗滌平衡備用。取15 mL 0.2 g/min的山銀花提取物水溶液上大孔樹脂柱，以1 mL/min體積流量吸附，靜置5 h后，再用蒸餾水5 BV，30%乙醇3 BV，70%乙醇3 BV以3 mL/min的流速進行洗脫，收集洗脫液，比色法測定洗脫液中總皂苷的量并計算總皂苷純度。結(jié)果表明，總皂苷平均純度為79.01%，表明優(yōu)選的工藝穩(wěn)定，純化效果好。見表2。

表2 純化前后總皂苷純度比較 %

3 討論

本次實驗以D101大孔樹脂作為吸附劑對山銀花總皂苷分離純化最佳工藝進行探究，最后確定了分離純化的工藝為：最佳上樣濃度0.2 g/mL，最佳洗脫流速為3 mL/min，上樣后吸附時間為5 h，蒸餾水用量為5 BV，除雜試劑為30%乙醇3 BV，洗脫試劑為70%乙醇3 BV，在此條件下，能得到純度較高的總皂苷粉末。表明摸索的工藝較穩(wěn)定，純化效果較好。

對山銀花水提液總皂苷的純化工藝試驗的過程中，通過分析得到的各實驗數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)：（1）實驗過程中實驗室溫度對實驗的影響較大，溫度太低會使得藥液中一些成分溶解度下降，從而析出固體物質(zhì)，使溶液變?yōu)榛鞈覡顟B(tài)，影響藥液在樹脂中的分布情況，并且析出的固體物質(zhì)可能會對藥液的吸附產(chǎn)生干擾。（2）注意對提取液的處理，山銀花提取液提取濃縮后會形成混懸液，混懸液中的固體并不會被樹脂吸附，所有對上樣液的處理也同樣非常重要。（3）山銀花中含有黃酮類成分，而大孔樹脂對黃酮類物質(zhì)也具有特異性吸附，黃酮類成分和總皂苷成分的洗脫范圍相似，所以要分離出總皂苷成分，需要在洗脫前對黃酮類物質(zhì)進行除雜。

大孔樹脂吸附法純化山銀花中的總皂苷是一種比較高效率的純化方法，有操作簡單，條件溫和，節(jié)約成本，耗時較短等優(yōu)點，后期可針對影響大孔樹脂吸附的其他因素進行考察，進一步完善實驗。