補腎化瘀祛濕法對兔膝骨關節(jié)炎beclin1、LC3調(diào)節(jié)作用的研究

★ 黃鑫 熊輝湧 徐睿琛 盛建洋 鮑杰偉 劉翔 陳虞文 曹奇圣 夏自成 王力

（1.江西中醫(yī)藥大學研究生院 南昌 330004；2.江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 南昌 330006）

膝骨關節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種與膝關節(jié)疼痛和膝關節(jié)功能喪失相關的慢性退行性疾病，相關流行病學調(diào)查表明，在中國60歲以上人群中，KOA的發(fā)病率可達19.4%［1］，且女性患病率大于男性［2-3］；同時隨著人口老齡化和肥胖癥比例增加，KOA的患病率將持續(xù)增加，因為KOA直接對患者的行走功能產(chǎn)生影響，從而引起患者及其家庭生活質(zhì)量降低和經(jīng)濟負擔增重［4］。目前,臨床上不斷探索KOA的治療方式，西醫(yī)治療KOA常用的非手術治療方案為外用和口服非甾體類抗炎藥，2019年OARSI指南［5］將外用非甾體類消炎藥和口服非甾體類消炎藥分別為1A級強推薦和1B級弱推薦。但同時指南中指出口服非甾體類消炎藥會增加心血管和胃腸道疾病的風險。近年研究表明KOA病程進展和膝關節(jié)軟骨細胞自噬兩者之間有著緊密的聯(lián)系，軟骨細胞自噬水平的降低可導致軟骨退變的加劇，自噬成為了治療KOA的靶點熱門方向。傳統(tǒng)中醫(yī)藥在臨床上治療該病具有毒副作用小和療效可靠的特點，前期相關文獻［6-9］研究可知，補腎活血類中藥內(nèi)服與丁蘇桂熱敷劑單獨治療KOA有很好的臨床療效，但補腎活血湯內(nèi)服聯(lián)合丁蘇桂熱敷劑綜合中醫(yī)療法對兔KOA的軟骨組織病理學變化、自噬相關蛋白表達的影響無相關報道。故本研究通過觀察補腎活血湯聯(lián)合丁蘇桂熱敷劑對兔KOA模型的軟骨組織自噬相關蛋白beclin 1、LC3表達的影響，探究補腎活血湯內(nèi)服聯(lián)合丁蘇桂熱敷劑療法對KOA相關自噬機制，為其治療KOA提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

普通級6月齡新西蘭實驗兔36只，雌雄各半，體重1.8～2.4 kg，購于長沙天勤生物技術有限公司,許可證號：SCXK（湘）2019-0015。實驗動物環(huán)境：江西中醫(yī)藥大學動物實驗大樓，許可證號：SYXK（贛）2017-004。

1.2 試藥和儀器

中藥（由江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥房提供）、雙氯芬酸二乙胺乳膠劑（中美天津史克制藥有限公司，批號：H20181225）、青霉素（華北制藥，批號：（2015）030202659）、烏拉坦（合肥巴斯夫生物科技有限公司；批號：201711072）。兔自噬微管相關蛋白輕鏈3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）ELISA試劑盒、兔自噬效應蛋白-1（beclin-1）ELISA試劑盒（江蘇酶免實業(yè)有限公司）；LC3抗體（proteintech公司）；beclin-1抗體（BIOSS公司）；GAPDH抗體（abcam公司）；羊抗兔HRP標記二抗（碧云天公司）。電泳儀（BIO-RAD公司，型號：mini protean 3 cell）；電轉(zhuǎn)儀（HOEFER，型號：TE77XP）；酶標儀（芬蘭雷勃酶標儀，型號：MK3）。

2 方法

2.1 分組及造模方法

將36只新西蘭實驗兔按隨機數(shù)字表法分成6組，分別為空白組、模型組、陽性藥對照組、丁蘇桂熱敷劑組、補腎活血湯內(nèi)服組、聯(lián)合組，每組6只，雌雄各半。除空白組外，其余5組均參照改良Hulth法建立兔KOA動物模型，20%烏拉坦耳緣靜脈麻醉，取兔右后肢膝關節(jié)內(nèi)側(cè)入路，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶，摘除內(nèi)側(cè)半月板，切斷前交叉韌帶，術后予青霉素肌注7 d，每天每只20萬U，每日2次，強迫運動4周，每日30 min，通過制作光鏡觀察標本，檢測造模是否成功。

2.2 干預方案

5組造模成功后，陽性藥對照組右膝關節(jié)均勻涂雙氯芬酸二乙胺乳膠劑，每日2次；丁蘇桂熱敷劑組右膝關節(jié)外敷丁蘇桂熱敷劑，藥物組成：蘇木10 g，艾葉10 g，白芥子10 g，麻黃5 g，大血藤10 g，公丁香5 g，腫節(jié)風10 g，千年健10 g，制川烏5 g，肉桂5 g，細辛3 g，絡石藤5 g，防己5 g，全蝎3 g。用法：藥物混合均勻碾成粉末狀，加熱30 min，布包外敷，每次30 min，每日2次。補腎活血湯內(nèi)服組口服補腎活血湯，藥物組成：熟地10 g，獨活10 g，秦艽10 g，赤芍10 g，當歸10 g，川芎6 g，杜仲15 g，川牛膝15 g，補骨脂10 g，骨碎補10 g，狗脊10 g，續(xù)斷10 g，炙甘草6 g。用法：中藥先水浸30 min，再文火煎1 h后濾出藥液，然后加入水進行二煎0.5 h后濾出藥液，最后將兩次煎出的藥液混合后加熱成濃縮藥液；經(jīng)Meeh—Rubner氏公式計算給藥量，每只每日給藥量6.17 g/kg，水煎濃縮5 mL灌胃，每日2次；聯(lián)合組行丁蘇桂熱敷劑聯(lián)合補腎活血湯內(nèi)服干預，以上藥物干預時間共6周，6周后耳緣靜脈空氣栓塞處死6組實驗兔，取右膝關節(jié)軟骨組織。

2.3 觀察指標

2.3.1 病理觀察 對右膝關節(jié)軟骨組織行脫水浸蠟及包埋，切片、展片、烤片后行HE 染色，以Mankin's評分進行評估。

2.3.2 Elisa試劑盒檢測 選用Elisa試劑盒檢測膝軟骨組織中相關自噬蛋白beclin1、LC3-Ⅱ濃度。將軟骨組織標本勻漿、離心后收集上清液，依次經(jīng)稀釋、加樣、溫育、稀釋配液、洗滌、加酶、再溫育、再洗滌、加顯色劑、終止反應后測定OD值。

2.3.3 Western Blot法檢測 選用Western Blot法檢測膝軟骨組織中相關自噬蛋白beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的表達。將軟骨組織標本勻漿、離心后收集上清液，依次經(jīng)蛋白定量、制備PAGE膠、上樣及電泳、轉(zhuǎn)膜、檢測膜上蛋白、膜封閉和孵育抗體、顯色后讀取灰度值。

2.4 統(tǒng)計學方法

各項數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析前先行方差齊性與正態(tài)性檢驗，計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，單因素方差分析用于多組間比較，差異具有統(tǒng)計學意義以P＜0.05或P＜0.01表示，統(tǒng)計數(shù)據(jù)選用軟件SPSS 25.0進行統(tǒng)計分析，所有實驗數(shù)據(jù)均取重復3次以上實驗結果的均值。

3 結果

3.1 各組兔膝關節(jié)軟骨組織光鏡下觀察結果比較

空白組：軟骨細胞形態(tài)正常，細胞核形態(tài)未見異常，整齊有序排列，均勻分布，無簇集軟骨細胞。模型組：軟骨細胞可見大量變形凋亡細胞，排列混亂，不規(guī)則分布，可見多處細胞簇集。陽性藥對照組：軟骨細胞排列散亂，分布雜亂，可見一定數(shù)量細胞簇集。丁蘇桂熱敷劑組：軟骨細胞排列分布不均勻，可見少許細胞簇集。補腎活血湯組：軟骨細胞相對正常，排列分布稍有不均，可見少量細胞簇集，但比前3組數(shù)量減少。聯(lián)合組：軟骨細胞大致正常，排列分布略不均，未見細胞簇集細胞。見圖1。

圖1 各組兔膝關節(jié)軟骨組織光鏡下觀察結果（HE染色×200）

3.2 各組實驗兔膝關節(jié)軟骨組織病理Mankin's評分比較

與空白組比較，模型組Mankin's 評分顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥對照組、丁蘇桂熱敷劑組、補腎活血湯組和聯(lián)合組Mankin’s評分均顯著降低（P＜0.01）；與陽性藥對照組比較，丁蘇桂熱敷劑組、補腎活血湯組和聯(lián)合組均明顯降低Mankin's 評分（P＜0.01）；聯(lián)合組與陽性藥對照組、丁蘇桂熱敷劑組、補腎活血湯組相比較，Mankin’s 評分顯著降低（P＜0.01）。見表 1。

表1 各組兔膝關節(jié)軟骨組織病理Mankin's評分比較（，n=6） 分

表1 各組兔膝關節(jié)軟骨組織病理Mankin's評分比較（，n=6） 分

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；與陽性藥對照組比較，☆P＜0.01；與聯(lián)合組比較，▲P＜0.01。

組別 Mankin's評分空白組 0.67±0.52模型組 10.33±1.37*陽性藥對照組 6.83±0.75△▲丁蘇桂熱敷劑組 5.00±0.63△☆▲補腎活血湯組 4.50±1.05△☆▲聯(lián)合組 3.33±1.03△☆

3.3 各組兔膝關節(jié)軟骨組織中LC3-Ⅱ、beclin1濃度比較

與空白組比較，模型組LC3-Ⅱ、beclin 1濃度顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥對照組、丁蘇桂熱敷劑組、補腎活血湯組和聯(lián)合組LC3-Ⅱ、beclin 1濃度均顯著升高（P＜0.01）；與陽性藥對照組比較，丁蘇桂熱敷劑組、補腎活血湯組和聯(lián)合組LC3-Ⅱ、beclin 1濃度均明顯升高（P＜0.01）；聯(lián)合組與陽性藥對照組、丁蘇桂熱敷劑組、補腎活血湯組相比較，LC3-Ⅱ、beclin 1濃度顯著降低（P＜0.01）。見表 2。

表2 各組兔膝關節(jié)軟骨組織中LC3-Ⅱ、beclin1濃度含量比較（，n=6）

表2 各組兔膝關節(jié)軟骨組織中LC3-Ⅱ、beclin1濃度含量比較（，n=6）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；與陽性藥對照組比較，☆P＜0.01；與聯(lián)合組比較，▲P＜0.01。

組別 LC3- Ⅱ /（pg·mL-1） beclin1 /（ng·mL-1）空白組 199.03±7.79 26.90±0.68模型組 64.73±7.51* 12.86±0.52*陽性藥對照組 92.53±5.44△▲ 16.83±0.46△▲丁蘇桂熱敷劑組 113.15±5.33△☆▲ 18.45±0.33△☆▲補腎活血湯組 125.96±9.69△☆▲ 21.07±0.80△☆▲聯(lián)合組 152.07±9.60△☆ 24.21±0.54△☆

3.4 各組兔膝關節(jié)軟骨組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、beclin 1/GAPDH蛋白相對表達量比較

與空白組比較，模型組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、beclin 1/GAPDH蛋白相對表達量顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥對照組、丁蘇桂熱敷劑組、補腎活血湯組和聯(lián)合組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、beclin 1/GAPDH蛋白相對表達量均顯著升高（P＜0.01）；與陽性藥對照組比較，丁蘇桂熱敷劑組、補腎活血湯組和聯(lián)合組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、beclin 1蛋白相對表達量均升高（P＜0.05）；聯(lián)合組與陽性藥對照組、丁蘇桂熱敷劑組、補腎活血湯組相比較，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、beclin 1蛋白相對表達量顯著降低（P＜0.05）。見圖2、表3。

圖2 各組兔膝關節(jié)軟骨組織中beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白免疫印跡結果

表3 各組兔膝關節(jié)軟骨組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、beclin 1/GAPDH蛋白相對表達量比較（，n=6）

表3 各組兔膝關節(jié)軟骨組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、beclin 1/GAPDH蛋白相對表達量比較（，n=6）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；與陽性藥對照組比較，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01；與聯(lián)合組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組別 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ beclin 1/GAPDH空白組 1.63±0.02 1.07±0.05模型組 0.91±0.03* 0.59±0.05*陽性藥對照組 0.99±0.01△▲▲ 0.75±0.04△▲▲丁蘇桂熱敷劑組 1.02±0.00△☆▲▲ 0.83±0.03△☆☆▲▲補腎活血湯組 1.10±0.02△☆☆▲▲ 0.87±0.01△☆☆▲聯(lián)合組 1.19±0.01△☆☆ 0.97±0.05△☆☆

4 討論

中醫(yī)學上將KOA歸于“膝痹”范疇，病因多為外邪內(nèi)虛所致，KOA初發(fā)多因外感風寒濕邪或跌打外傷所致，寒邪阻滯經(jīng)脈氣血運行；百病之長為風邪，具有輕揚開泄的特性；濕邪具有重著的特性，使關節(jié)黏滯疼痛；跌打外傷所致瘀血，阻滯氣血運行，初期階段若治療不當致余邪殘留，氣血與余邪相互搏結，導致病情遷延難愈。內(nèi)虛為久病未愈，致肝腎損傷或年老體衰，肝腎虧虛。腎主骨藏精，為髓之海，腎虛則髓海失養(yǎng)、骨弱，肝主筋藏血，肝腎虧虛則筋病骨痹。故本實驗組提出了KOA“肝腎虧虛，血瘀夾濕”的基本病機。

針對KOA病情反復發(fā)作致使關節(jié)畸形者，單一的治療方法常難獲效。此時，除應用化瘀祛濕法祛除病邪外，尚應重視補益肝腎，預防反復發(fā)作。本項目據(jù)此以補腎化瘀祛濕立法，形成內(nèi)外合用、多途徑給藥、防治并重的中醫(yī)綜合方案。補腎活血湯由熟地、獨活、秦艽、赤芍、當歸、川芎、杜仲、川牛膝、補骨脂、骨碎補、狗脊、續(xù)斷、炙甘草組成。方中以熟地、杜仲、川牛膝、補骨脂、骨碎補、狗脊、續(xù)斷，補肝腎，強筋骨；赤芍、當歸、川芎活血化瘀，獨活、秦艽祛風除濕，甘草調(diào)和諸藥。全方共奏補益肝腎，化瘀祛濕之功。丁蘇桂熱敷劑則重在祛邪，選用本院名方丁蘇桂熱敷劑（蘇木、艾葉、白芥子、麻黃、大血藤、公丁香、腫節(jié)風、千年健、制川烏、肉桂、細辛、絡石藤、防己、全蝎），有化瘀祛濕、活血止痛之功，該方在臨床運用20余年，療效確切。丁蘇桂熱敷劑可直達病所，作用時間長。綜上所述，該綜合療法（內(nèi)服聯(lián)合外敷多途徑治療），由于各種療法的協(xié)同作用增強了治療效果，有助于明顯提高臨床療效，減少KOA反復發(fā)作。

KOA發(fā)病機制復雜，軟骨細胞自噬是KOA發(fā)病和病程進展的重要環(huán)節(jié)，軟骨基質(zhì)的持續(xù)降解和軟骨細胞總量的不斷降低是KOA主要的病理學特點［10-12］，軟骨內(nèi)唯一的細胞即為軟骨細胞，軟骨細胞的功能狀況直接決定著軟骨“健康”情況［13］。自噬是細胞經(jīng)溶酶體自身吞噬、消化再循環(huán)細胞組分的一種細胞自我代謝平衡的過程，對調(diào)控細胞活性具有重要作用。Paloma L D F等［14］的研究發(fā)現(xiàn)軟骨細胞自噬功能降低可引起線粒體功能障礙，進一步出現(xiàn)能量代謝障礙和氧化應激導致軟骨細胞損傷。自噬水平的提高能促進軟骨細胞功能進而延緩KOA病程的進展［15］。

自噬相關基因LC3與beclin 1在自噬過程中分別充當著執(zhí)行者和調(diào)控者的角色［16-17］。LC3存在形式可分為兩種，一種為細胞質(zhì)中的LC3-Ⅰ（水溶形式），另一種為形成自噬體過程中由LC3-Ⅰ經(jīng)泛素化系統(tǒng)脂化而來結合在自噬體膜上的LC3-Ⅱ（脂溶形式），LC3-Ⅱ的數(shù)量和自噬體形成程度有關；隨著自噬水平的提高，LC3-Ⅰ表達降低，但LC3-Ⅱ表達提高，因此，LC3-Ⅱ是一種自噬標記物，LC3-Ⅱ和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的數(shù)值高低與自噬水平的強弱呈正相關關系［18-19］。Beclin 1也是一種參與了自噬體形成的自噬標志物［20］，自噬水平的升降與beclin 1表達的強弱同樣呈正相關關系。故可通過將LC3與beclin 1來作為衡量KOA自噬水平的參考指標［21］。

本次實驗，經(jīng)過藥物干預后，陽性藥對照組、丁蘇桂熱敷劑組、補腎活血湯組和聯(lián)合組ELISA檢測beclin1、LC3-Ⅱ濃度含量和WB檢測LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、beclin 1/GAPDH蛋白表達水平均有提高，且聯(lián)合組提高水平優(yōu)于陽性藥對照組、丁蘇桂熱敷劑、補腎活血湯組。說明聯(lián)合組能夠增強軟骨細胞自噬，使軟骨細胞能夠祛除多余氧化自由基和功能障礙（受損）的細胞結構，改善軟骨細胞應對機械壓力等各類外界環(huán)境的變化適應力，調(diào)控膝關節(jié)部位的新陳代謝穩(wěn)態(tài)來防治KOA。