補(bǔ)腎化瘀祛濕法對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎beclin1、LC3調(diào)節(jié)作用的研究

★ 黃鑫 熊輝湧 徐睿琛 盛建洋 鮑杰偉 劉翔 陳虞文 曹奇圣 夏自成 王力

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 南昌 330004；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 南昌 330006）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種與膝關(guān)節(jié)疼痛和膝關(guān)節(jié)功能喪失相關(guān)的慢性退行性疾病，相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查表明，在中國60歲以上人群中，KOA的發(fā)病率可達(dá)19.4%［1］，且女性患病率大于男性［2-3］；同時(shí)隨著人口老齡化和肥胖癥比例增加，KOA的患病率將持續(xù)增加，因?yàn)镵OA直接對(duì)患者的行走功能產(chǎn)生影響，從而引起患者及其家庭生活質(zhì)量降低和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)增重［4］。目前,臨床上不斷探索KOA的治療方式，西醫(yī)治療KOA常用的非手術(shù)治療方案為外用和口服非甾體類抗炎藥，2019年OARSI指南［5］將外用非甾體類消炎藥和口服非甾體類消炎藥分別為1A級(jí)強(qiáng)推薦和1B級(jí)弱推薦。但同時(shí)指南中指出口服非甾體類消炎藥會(huì)增加心血管和胃腸道疾病的風(fēng)險(xiǎn)。近年研究表明KOA病程進(jìn)展和膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬兩者之間有著緊密的聯(lián)系，軟骨細(xì)胞自噬水平的降低可導(dǎo)致軟骨退變的加劇，自噬成為了治療KOA的靶點(diǎn)熱門方向。傳統(tǒng)中醫(yī)藥在臨床上治療該病具有毒副作用小和療效可靠的特點(diǎn)，前期相關(guān)文獻(xiàn)［6-9］研究可知，補(bǔ)腎活血類中藥內(nèi)服與丁蘇桂熱敷劑單獨(dú)治療KOA有很好的臨床療效，但補(bǔ)腎活血湯內(nèi)服聯(lián)合丁蘇桂熱敷劑綜合中醫(yī)療法對(duì)兔KOA的軟骨組織病理學(xué)變化、自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響無相關(guān)報(bào)道。故本研究通過觀察補(bǔ)腎活血湯聯(lián)合丁蘇桂熱敷劑對(duì)兔KOA模型的軟骨組織自噬相關(guān)蛋白beclin 1、LC3表達(dá)的影響，探究補(bǔ)腎活血湯內(nèi)服聯(lián)合丁蘇桂熱敷劑療法對(duì)KOA相關(guān)自噬機(jī)制，為其治療KOA提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

普通級(jí)6月齡新西蘭實(shí)驗(yàn)兔36只，雌雄各半，體重1.8～2.4 kg，購于長沙天勤生物技術(shù)有限公司,許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0015。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境：江西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)大樓，許可證號(hào)：SYXK（贛）2017-004。

1.2 試藥和儀器

中藥（由江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供）、雙氯芬酸二乙胺乳膠劑（中美天津史克制藥有限公司，批號(hào)：H20181225）、青霉素（華北制藥，批號(hào)：（2015）030202659）、烏拉坦（合肥巴斯夫生物科技有限公司；批號(hào)：201711072）。兔自噬微管相關(guān)蛋白輕鏈3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）ELISA試劑盒、兔自噬效應(yīng)蛋白-1（beclin-1）ELISA試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司）；LC3抗體（proteintech公司）；beclin-1抗體（BIOSS公司）；GAPDH抗體（abcam公司）；羊抗兔HRP標(biāo)記二抗（碧云天公司）。電泳儀（BIO-RAD公司，型號(hào)：mini protean 3 cell）；電轉(zhuǎn)儀（HOEFER，型號(hào)：TE77XP）；酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃酶標(biāo)儀，型號(hào)：MK3）。

2 方法

2.1 分組及造模方法

將36只新西蘭實(shí)驗(yàn)兔按隨機(jī)數(shù)字表法分成6組，分別為空白組、模型組、陽性藥對(duì)照組、丁蘇桂熱敷劑組、補(bǔ)腎活血湯內(nèi)服組、聯(lián)合組，每組6只，雌雄各半。除空白組外，其余5組均參照改良Hulth法建立兔KOA動(dòng)物模型，20%烏拉坦耳緣靜脈麻醉，取兔右后肢膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)入路，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶，摘除內(nèi)側(cè)半月板，切斷前交叉韌帶，術(shù)后予青霉素肌注7 d，每天每只20萬U，每日2次，強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)4周，每日30 min，通過制作光鏡觀察標(biāo)本，檢測造模是否成功。

2.2 干預(yù)方案

5組造模成功后，陽性藥對(duì)照組右膝關(guān)節(jié)均勻涂雙氯芬酸二乙胺乳膠劑，每日2次；丁蘇桂熱敷劑組右膝關(guān)節(jié)外敷丁蘇桂熱敷劑，藥物組成：蘇木10 g，艾葉10 g，白芥子10 g，麻黃5 g，大血藤10 g，公丁香5 g，腫節(jié)風(fēng)10 g，千年健10 g，制川烏5 g，肉桂5 g，細(xì)辛3 g，絡(luò)石藤5 g，防己5 g，全蝎3 g。用法：藥物混合均勻碾成粉末狀，加熱30 min，布包外敷，每次30 min，每日2次。補(bǔ)腎活血湯內(nèi)服組口服補(bǔ)腎活血湯，藥物組成：熟地10 g，獨(dú)活10 g，秦艽10 g，赤芍10 g，當(dāng)歸10 g，川芎6 g，杜仲15 g，川牛膝15 g，補(bǔ)骨脂10 g，骨碎補(bǔ)10 g，狗脊10 g，續(xù)斷10 g，炙甘草6 g。用法：中藥先水浸30 min，再文火煎1 h后濾出藥液，然后加入水進(jìn)行二煎0.5 h后濾出藥液，最后將兩次煎出的藥液混合后加熱成濃縮藥液；經(jīng)Meeh—Rubner氏公式計(jì)算給藥量，每只每日給藥量6.17 g/kg，水煎濃縮5 mL灌胃，每日2次；聯(lián)合組行丁蘇桂熱敷劑聯(lián)合補(bǔ)腎活血湯內(nèi)服干預(yù)，以上藥物干預(yù)時(shí)間共6周，6周后耳緣靜脈空氣栓塞處死6組實(shí)驗(yàn)兔，取右膝關(guān)節(jié)軟骨組織。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 病理觀察 對(duì)右膝關(guān)節(jié)軟骨組織行脫水浸蠟及包埋，切片、展片、烤片后行HE 染色，以Mankin's評(píng)分進(jìn)行評(píng)估。

2.3.2 Elisa試劑盒檢測 選用Elisa試劑盒檢測膝軟骨組織中相關(guān)自噬蛋白beclin1、LC3-Ⅱ濃度。將軟骨組織標(biāo)本勻漿、離心后收集上清液，依次經(jīng)稀釋、加樣、溫育、稀釋配液、洗滌、加酶、再溫育、再洗滌、加顯色劑、終止反應(yīng)后測定OD值。

2.3.3 Western Blot法檢測 選用Western Blot法檢測膝軟骨組織中相關(guān)自噬蛋白beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的表達(dá)。將軟骨組織標(biāo)本勻漿、離心后收集上清液，依次經(jīng)蛋白定量、制備PAGE膠、上樣及電泳、轉(zhuǎn)膜、檢測膜上蛋白、膜封閉和孵育抗體、顯色后讀取灰度值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

各項(xiàng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析前先行方差齊性與正態(tài)性檢驗(yàn)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，單因素方差分析用于多組間比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義以P＜0.05或P＜0.01表示，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)選用軟件SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均取重復(fù)3次以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果的均值。

3 結(jié)果

3.1 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織光鏡下觀察結(jié)果比較

空白組：軟骨細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞核形態(tài)未見異常，整齊有序排列，均勻分布，無簇集軟骨細(xì)胞。模型組：軟骨細(xì)胞可見大量變形凋亡細(xì)胞，排列混亂，不規(guī)則分布，可見多處細(xì)胞簇集。陽性藥對(duì)照組：軟骨細(xì)胞排列散亂，分布雜亂，可見一定數(shù)量細(xì)胞簇集。丁蘇桂熱敷劑組：軟骨細(xì)胞排列分布不均勻，可見少許細(xì)胞簇集。補(bǔ)腎活血湯組：軟骨細(xì)胞相對(duì)正常，排列分布稍有不均，可見少量細(xì)胞簇集，但比前3組數(shù)量減少。聯(lián)合組：軟骨細(xì)胞大致正常，排列分布略不均，未見細(xì)胞簇集細(xì)胞。見圖1。

圖1 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織光鏡下觀察結(jié)果（HE染色×200）

3.2 各組實(shí)驗(yàn)兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理Mankin's評(píng)分比較

與空白組比較，模型組Mankin's 評(píng)分顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥對(duì)照組、丁蘇桂熱敷劑組、補(bǔ)腎活血湯組和聯(lián)合組Mankin’s評(píng)分均顯著降低（P＜0.01）；與陽性藥對(duì)照組比較，丁蘇桂熱敷劑組、補(bǔ)腎活血湯組和聯(lián)合組均明顯降低Mankin's 評(píng)分（P＜0.01）；聯(lián)合組與陽性藥對(duì)照組、丁蘇桂熱敷劑組、補(bǔ)腎活血湯組相比較，Mankin’s 評(píng)分顯著降低（P＜0.01）。見表 1。

表1 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理Mankin's評(píng)分比較（，n=6） 分

表1 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理Mankin's評(píng)分比較（，n=6） 分

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；與陽性藥對(duì)照組比較，☆P＜0.01；與聯(lián)合組比較，▲P＜0.01。

組別 Mankin's評(píng)分空白組 0.67±0.52模型組 10.33±1.37*陽性藥對(duì)照組 6.83±0.75△▲丁蘇桂熱敷劑組 5.00±0.63△☆▲補(bǔ)腎活血湯組 4.50±1.05△☆▲聯(lián)合組 3.33±1.03△☆

3.3 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織中LC3-Ⅱ、beclin1濃度比較

與空白組比較，模型組LC3-Ⅱ、beclin 1濃度顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥對(duì)照組、丁蘇桂熱敷劑組、補(bǔ)腎活血湯組和聯(lián)合組LC3-Ⅱ、beclin 1濃度均顯著升高（P＜0.01）；與陽性藥對(duì)照組比較，丁蘇桂熱敷劑組、補(bǔ)腎活血湯組和聯(lián)合組LC3-Ⅱ、beclin 1濃度均明顯升高（P＜0.01）；聯(lián)合組與陽性藥對(duì)照組、丁蘇桂熱敷劑組、補(bǔ)腎活血湯組相比較，LC3-Ⅱ、beclin 1濃度顯著降低（P＜0.01）。見表 2。

表2 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織中LC3-Ⅱ、beclin1濃度含量比較（，n=6）

表2 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織中LC3-Ⅱ、beclin1濃度含量比較（，n=6）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；與陽性藥對(duì)照組比較，☆P＜0.01；與聯(lián)合組比較，▲P＜0.01。

組別 LC3- Ⅱ /（pg·mL-1） beclin1 /（ng·mL-1）空白組 199.03±7.79 26.90±0.68模型組 64.73±7.51* 12.86±0.52*陽性藥對(duì)照組 92.53±5.44△▲ 16.83±0.46△▲丁蘇桂熱敷劑組 113.15±5.33△☆▲ 18.45±0.33△☆▲補(bǔ)腎活血湯組 125.96±9.69△☆▲ 21.07±0.80△☆▲聯(lián)合組 152.07±9.60△☆ 24.21±0.54△☆

3.4 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、beclin 1/GAPDH蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

與空白組比較，模型組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、beclin 1/GAPDH蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥對(duì)照組、丁蘇桂熱敷劑組、補(bǔ)腎活血湯組和聯(lián)合組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、beclin 1/GAPDH蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P＜0.01）；與陽性藥對(duì)照組比較，丁蘇桂熱敷劑組、補(bǔ)腎活血湯組和聯(lián)合組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、beclin 1蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高（P＜0.05）；聯(lián)合組與陽性藥對(duì)照組、丁蘇桂熱敷劑組、補(bǔ)腎活血湯組相比較，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、beclin 1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。見圖2、表3。

圖2 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織中beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白免疫印跡結(jié)果

表3 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、beclin 1/GAPDH蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（，n=6）

表3 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、beclin 1/GAPDH蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（，n=6）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；與陽性藥對(duì)照組比較，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01；與聯(lián)合組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組別 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ beclin 1/GAPDH空白組 1.63±0.02 1.07±0.05模型組 0.91±0.03* 0.59±0.05*陽性藥對(duì)照組 0.99±0.01△▲▲ 0.75±0.04△▲▲丁蘇桂熱敷劑組 1.02±0.00△☆▲▲ 0.83±0.03△☆☆▲▲補(bǔ)腎活血湯組 1.10±0.02△☆☆▲▲ 0.87±0.01△☆☆▲聯(lián)合組 1.19±0.01△☆☆ 0.97±0.05△☆☆

4 討論

中醫(yī)學(xué)上將KOA歸于“膝痹”范疇，病因多為外邪內(nèi)虛所致，KOA初發(fā)多因外感風(fēng)寒濕邪或跌打外傷所致，寒邪阻滯經(jīng)脈氣血運(yùn)行；百病之長為風(fēng)邪，具有輕揚(yáng)開泄的特性；濕邪具有重著的特性，使關(guān)節(jié)黏滯疼痛；跌打外傷所致瘀血，阻滯氣血運(yùn)行，初期階段若治療不當(dāng)致余邪殘留，氣血與余邪相互搏結(jié)，導(dǎo)致病情遷延難愈。內(nèi)虛為久病未愈，致肝腎損傷或年老體衰，肝腎虧虛。腎主骨藏精，為髓之海，腎虛則髓海失養(yǎng)、骨弱，肝主筋藏血，肝腎虧虛則筋病骨痹。故本實(shí)驗(yàn)組提出了KOA“肝腎虧虛，血瘀夾濕”的基本病機(jī)。

針對(duì)KOA病情反復(fù)發(fā)作致使關(guān)節(jié)畸形者，單一的治療方法常難獲效。此時(shí)，除應(yīng)用化瘀祛濕法祛除病邪外，尚應(yīng)重視補(bǔ)益肝腎，預(yù)防反復(fù)發(fā)作。本項(xiàng)目據(jù)此以補(bǔ)腎化瘀祛濕立法，形成內(nèi)外合用、多途徑給藥、防治并重的中醫(yī)綜合方案。補(bǔ)腎活血湯由熟地、獨(dú)活、秦艽、赤芍、當(dāng)歸、川芎、杜仲、川牛膝、補(bǔ)骨脂、骨碎補(bǔ)、狗脊、續(xù)斷、炙甘草組成。方中以熟地、杜仲、川牛膝、補(bǔ)骨脂、骨碎補(bǔ)、狗脊、續(xù)斷，補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨；赤芍、當(dāng)歸、川芎活血化瘀，獨(dú)活、秦艽祛風(fēng)除濕，甘草調(diào)和諸藥。全方共奏補(bǔ)益肝腎，化瘀祛濕之功。丁蘇桂熱敷劑則重在祛邪，選用本院名方丁蘇桂熱敷劑（蘇木、艾葉、白芥子、麻黃、大血藤、公丁香、腫節(jié)風(fēng)、千年健、制川烏、肉桂、細(xì)辛、絡(luò)石藤、防己、全蝎），有化瘀祛濕、活血止痛之功，該方在臨床運(yùn)用20余年，療效確切。丁蘇桂熱敷劑可直達(dá)病所，作用時(shí)間長。綜上所述，該綜合療法（內(nèi)服聯(lián)合外敷多途徑治療），由于各種療法的協(xié)同作用增強(qiáng)了治療效果，有助于明顯提高臨床療效，減少KOA反復(fù)發(fā)作。

KOA發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，軟骨細(xì)胞自噬是KOA發(fā)病和病程進(jìn)展的重要環(huán)節(jié)，軟骨基質(zhì)的持續(xù)降解和軟骨細(xì)胞總量的不斷降低是KOA主要的病理學(xué)特點(diǎn)［10-12］，軟骨內(nèi)唯一的細(xì)胞即為軟骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞的功能狀況直接決定著軟骨“健康”情況［13］。自噬是細(xì)胞經(jīng)溶酶體自身吞噬、消化再循環(huán)細(xì)胞組分的一種細(xì)胞自我代謝平衡的過程，對(duì)調(diào)控細(xì)胞活性具有重要作用。Paloma L D F等［14］的研究發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞自噬功能降低可引起線粒體功能障礙，進(jìn)一步出現(xiàn)能量代謝障礙和氧化應(yīng)激導(dǎo)致軟骨細(xì)胞損傷。自噬水平的提高能促進(jìn)軟骨細(xì)胞功能進(jìn)而延緩KOA病程的進(jìn)展［15］。

自噬相關(guān)基因LC3與beclin 1在自噬過程中分別充當(dāng)著執(zhí)行者和調(diào)控者的角色［16-17］。LC3存在形式可分為兩種，一種為細(xì)胞質(zhì)中的LC3-Ⅰ（水溶形式），另一種為形成自噬體過程中由LC3-Ⅰ經(jīng)泛素化系統(tǒng)脂化而來結(jié)合在自噬體膜上的LC3-Ⅱ（脂溶形式），LC3-Ⅱ的數(shù)量和自噬體形成程度有關(guān)；隨著自噬水平的提高，LC3-Ⅰ表達(dá)降低，但LC3-Ⅱ表達(dá)提高，因此，LC3-Ⅱ是一種自噬標(biāo)記物，LC3-Ⅱ和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的數(shù)值高低與自噬水平的強(qiáng)弱呈正相關(guān)關(guān)系［18-19］。Beclin 1也是一種參與了自噬體形成的自噬標(biāo)志物［20］，自噬水平的升降與beclin 1表達(dá)的強(qiáng)弱同樣呈正相關(guān)關(guān)系。故可通過將LC3與beclin 1來作為衡量KOA自噬水平的參考指標(biāo)［21］。

本次實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過藥物干預(yù)后，陽性藥對(duì)照組、丁蘇桂熱敷劑組、補(bǔ)腎活血湯組和聯(lián)合組ELISA檢測beclin1、LC3-Ⅱ濃度含量和WB檢測LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、beclin 1/GAPDH蛋白表達(dá)水平均有提高，且聯(lián)合組提高水平優(yōu)于陽性藥對(duì)照組、丁蘇桂熱敷劑、補(bǔ)腎活血湯組。說明聯(lián)合組能夠增強(qiáng)軟骨細(xì)胞自噬，使軟骨細(xì)胞能夠祛除多余氧化自由基和功能障礙（受損）的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，改善軟骨細(xì)胞應(yīng)對(duì)機(jī)械壓力等各類外界環(huán)境的變化適應(yīng)力，調(diào)控膝關(guān)節(jié)部位的新陳代謝穩(wěn)態(tài)來防治KOA。