中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)慢性心力衰竭大鼠AMPK/PPARα信號(hào)通路的影響

★ 舒華 宋釗銳 郭磊磊 付蓉 許滔 余銀翎 金愛(ài)林 楊煉 孫安會(huì)（.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 貴陽(yáng) 550000；.遵義市第一人民醫(yī)院 貴州 遵義 56000；.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 貴陽(yáng) 550000；.開(kāi)陽(yáng)縣中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 貴州 開(kāi)陽(yáng) 55000）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是心臟疾病的終末階段，已成為一個(gè)主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。以運(yùn)動(dòng)為主的心臟康復(fù)是心血管疾病二級(jí)預(yù)防的重要組成部分，目前指南［1-3］推薦心臟康復(fù)可在穩(wěn)定期慢性心衰的患者中使用，其益處已經(jīng)得到大量研究支持。心肌能量代謝障礙是CHF重要的機(jī)制之一，臨床上改善心肌能量代謝的藥物及手段越來(lái)越受到臨床醫(yī)生的關(guān)注。AMP激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）信號(hào)通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)的重要通路之一，通過(guò)激活A(yù)MPK及其下游信號(hào)通路，調(diào)節(jié)能量代謝信號(hào)因子，可有效改善心肌能量代謝，從而延緩心衰進(jìn)展，達(dá)到治療疾病的目的。本文通過(guò)建立阿霉素誘導(dǎo)的慢性心衰大鼠模型，檢測(cè)各組大鼠心功能及AMPK/PPARα通路相關(guān)蛋白及mRNA，以期證實(shí)運(yùn)動(dòng)對(duì)AMPK/PPARα信號(hào)通路及心肌能量代謝的影響，為心臟康復(fù)治療慢性心衰提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用健康雄性SD大鼠50只，2個(gè)月齡，體重（110±10）g，由湖南省長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（湘）2014-0011。實(shí)驗(yàn)期間將動(dòng)物分籠飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，常規(guī)飼養(yǎng)。飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 試藥

鹽酸阿霉素（北京索萊寶公司，貨號(hào)：D8740）；AMPK抑制劑Compound C（MCE，貨號(hào)：HY-13418A）；鹽酸曲美他嗪片（施維雅＜天津＞制藥有限公司）。

1.3 主要儀器

動(dòng)物跑臺(tái)（江蘇賽昂斯，型號(hào)：SA101B）；超聲儀（日本Fuji film ，型號(hào)：Visual Sonics Vevo 2100）；熒光定量RCP儀（Thermo公司，型號(hào)：PIKO REAL 96）；熒光PCR板（Thermo公司，型號(hào)：SPL0960）；水平瓊脂糖電泳槽（北京六一生物科技有限公司，型號(hào)：DYCP-31DN）。

1.4 主要抗體

AMPK（美國(guó)CST），P-AMPK（Santa Cruz），PPARα（Novus），以上抗體來(lái)源為 Rabbit；β-actin（美國(guó)proteintech），抗體來(lái)源為Mouse。

1.5 分組、造模及干預(yù)

50只SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法選取10只大鼠設(shè)為正常對(duì)照組，其余40只大鼠參考文獻(xiàn)［4］腹腔注射鹽酸阿霉素造模。將阿霉素配成2 mg/mL溶液，經(jīng)腹腔注射建模，劑量1.5 mg/kg，共注射6周，每周2次。將存活且建模成功的36只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：CHF模型對(duì)照組9只、曲美他嗪組9只、運(yùn)動(dòng)組9只和運(yùn)動(dòng)+AMPK抑制劑組9只。

1.6 干預(yù)方案

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練于第7周開(kāi)始進(jìn)行，運(yùn)動(dòng)組、運(yùn)動(dòng)+AMPK抑制劑組大鼠每天在跑臺(tái)上進(jìn)行5 min的適應(yīng)性訓(xùn)練（坡度為0°，速度為5 m/min），隨后采用中強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，即將跑臺(tái)調(diào)整為5°，20 m/min（根據(jù) Bedford經(jīng)驗(yàn)公式［5］，相當(dāng)于60%最大攝氧量）。運(yùn)動(dòng)各組大鼠第1天運(yùn)動(dòng)20 min，第2天運(yùn)動(dòng)30 min，第3天運(yùn)動(dòng)40 min，此后運(yùn)動(dòng)量保持坡度5°，速度20 m/min，時(shí)間40 min，每周5 d，連續(xù)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練8周。各組干預(yù)方式見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)干預(yù)方案

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1 各組大鼠的死亡率及一般情況 觀察各組大鼠死亡率及一般情況，一般情況包括精神狀態(tài)、活動(dòng)、反應(yīng)、皮毛、水腫、大便、進(jìn)食、運(yùn)動(dòng)等。

1.7.2 心臟超聲檢查 于第6周末行心臟超聲檢查，按大鼠體重3 mg/kg劑量腹腔注10%水合氯醛溶液麻醉大鼠后由專(zhuān)業(yè)超聲科醫(yī)師操作。測(cè)量指標(biāo)：左室射血分?jǐn)?shù)（Left ventricular ejection fraction，LVEF）、左室短軸縮短分?jǐn)?shù)（Left ventricular fractional shortening，LVFS）。于14周末，再次行心臟超聲檢查，檢測(cè)指標(biāo)：LVEF、LVFS、左室收縮末期內(nèi)徑（Left ventricular end-systolic dimension，LVDs）、左室舒張末期內(nèi)徑（Left ventricular enddiastolic dimension，LVDd）。

1.7.3 Western Blot檢 測(cè) 心 肌 AMPK、P-AMPK、PPARα蛋白表達(dá)水平 取出大鼠心臟，取心肌組織，加裂解液，裂解細(xì)胞后提取細(xì)胞總蛋白，剪取0.025 g心肌組織后用預(yù)冷的PBS沖洗，勻漿器中加入250 μL RIPA裂解液后反復(fù)研磨組織。研磨好的組織置于冰上10 min后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，離心后取上清。上清液按BCA蛋白定量試劑盒（Wellbio）的指示測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，作為WB檢測(cè)的參考。經(jīng)電泳→轉(zhuǎn)膜→封閉→一抗孵育→二抗孵育→顯色曝光后，得出結(jié)果。

1.7.4 Real-time PCR法檢測(cè)心肌AMPK mRNA、PPARα mRNA表達(dá)水平 每只大鼠取0.2 g心肌組織研磨混勻，Trizol法提取組織總RNA，經(jīng)離心、沉淀、電泳后，以細(xì)胞總mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄cDNA。擴(kuò)增體系為30 μL，擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性10 min、95 ℃變性15 min、60 ℃退火60 s，40個(gè)循環(huán)。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，AMPK引物序列為上游GACCTCGGTCAAGTGTCG，下游TGGGTTATCAACGGGCTA，引物長(zhǎng)度為177 bp；PPARα引物序列 為上游ATCCACGAAGCCTACCTGA，下游CCTTGGCAAATTCCGTGAGC，引物長(zhǎng)度為250 bp；GAPDH引物序列為上游 CAGCAACAGGGTGGTGGAC，下游TTTGAGGGTGCAGCGAACTT，引物長(zhǎng)度為252 bp。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，采用SYBR法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較符合正態(tài)分布及方差齊性時(shí)采用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布時(shí)采用多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠死亡率及一般情況

正常對(duì)照組無(wú)大鼠死亡，建模組大鼠死亡13只，死亡率26%，36只建模成功，1只未成功。在后期干預(yù)過(guò)程中，正常對(duì)照組、曲美他嗪組大鼠無(wú)死亡，其余3組大鼠各死亡1只。正常對(duì)照組大鼠實(shí)驗(yàn)過(guò)程中精神、健康狀況良好，反應(yīng)敏捷。各實(shí)驗(yàn)組大鼠在建模開(kāi)始后陸續(xù)出現(xiàn)精神差，反應(yīng)遲鈍，進(jìn)食減少，體重下降，四肢和或陰部和或腹部出現(xiàn)不同程度的水腫。至14周末模型對(duì)照組大鼠上述癥狀明顯加重，曲美他嗪組及運(yùn)動(dòng)干預(yù)各組癥狀均較前減輕。

2.2 6周后各組大鼠LVEF和LVFS變化

建模6周后，與正常對(duì)照組比較，模型組LVEF和LVFS下降（P＜0.05），說(shuō)明造模成功。見(jiàn)表2。

表2 6 周后各組大鼠LVEF和LVFS變化（） %

表2 6 周后各組大鼠LVEF和LVFS變化（） %

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別 n LVEF LVFS正常對(duì)照組 10 93.57±2.25 68.68±2.25模型組 36 73.09±2.06* 44.44±2.29*

2.3 14周后各組大鼠心臟功能變化

與正常對(duì)照組比較，造模各組LVEF和LVFS均下降，LVDd、LVDs均升高（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，干預(yù)各組LVEF、LVFS均升高（P＜0.05），運(yùn)動(dòng)組 LVDd、LVDs下降（P＜0.05），曲美他嗪組、運(yùn)動(dòng)+AMPK抑制劑組LVDs下降（P＜0.05），LVDd比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與曲美他嗪組比較，運(yùn)動(dòng)組LVEF、LVFS升高（P＜0.05）、LVDd、LVDs比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），運(yùn)動(dòng)+AMPK抑制劑組LVEF、LVFS下降、LVDs升高（P＜0.05），LVDd比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與運(yùn)動(dòng)組比較，運(yùn)動(dòng)+AMPK抑制劑組LVEF、LVFS下降（P＜0.05），LVDs升高（P＜0.05），LVDd比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 14周后各組大鼠心臟功能變化（）

表3 14周后各組大鼠心臟功能變化（）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型對(duì)照組比較，△P＜0.05；與曲美他嗪組比較，#P＜0.05；與運(yùn)動(dòng)組比較，&P＜0.05。

組別 n LVEF/% LVFS/% LVDd/mm LVDs/mm正常對(duì)照組 10 91.37±0.35 60.15±1.46 5.16±0.18 2.38±0.27模型對(duì)照組 8 66.89±1.00* 40.74±0.14* 6.86±0.88* 4.07±0.18*曲美他嗪組 9 75.21±0.30*△ 48.73±2.25*△ 6.26±0.49* 2.98±0.12*△運(yùn)動(dòng)組 8 82.89±0.39*△# 51.76±1.10*△# 6.03±0.07*△ 2.84±0.10*△運(yùn)動(dòng) +AMPK 組 8 72.64±2.02*△#& 42.50±0.86*#& 6.48±0.51* 3.51±0.12*△#&

2.4 各組大鼠心肌AMPK、P-AMPK、PPARα蛋白表達(dá)水平

與正常對(duì)照組比較，各組間AMPK蛋白表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），各組P-AMPK均升高（P＜0.05）、運(yùn)動(dòng)組PPARα蛋白表達(dá)下降無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余各組PPARα下降（P＜0.05）；與模型組比較，曲美他嗪組P-AMPK下降（P＜0.05），PPARα蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），運(yùn)動(dòng)組 P-AMPK、PPARα 蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）、運(yùn)動(dòng)+AMPK抑制劑組P-AMPK、PPARα蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與曲美他嗪組比較，運(yùn)動(dòng)各組P-AMPK蛋白表達(dá)升高P＜0.05），PPARα蛋白表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與運(yùn)動(dòng)組比較，運(yùn)動(dòng)+AMPK抑制劑組P-AMPK蛋白表達(dá)下降（P＜0.05），PPARα蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表 4、圖 1。

表4 各組大鼠AMPK、P-AMPK、PPARα蛋白表達(dá)（）

表4 各組大鼠AMPK、P-AMPK、PPARα蛋白表達(dá)（）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型對(duì)照組比較，△P＜0.05；與曲美他嗪組比較，#P＜0.05；與運(yùn)動(dòng)組比較，&P＜0.05。

組別 n AMPK P-AMPK PPARα正常對(duì)照組 10 0.59±0.03 0.10±0.02 0.49±0.14模型對(duì)照組 8 0.59±0.03 0.25±0.03* 0.15±0.04*曲美他嗪組 9 0.59±0.06 0.13±0.01△ 0.29±0.07*運(yùn)動(dòng)組 8 0.61±0.09 0.39±0.04*△# 0.38±0.12△運(yùn)動(dòng)+AMPK抑制劑組 8 0.65±0.08 0.28±0.04*#& 0.24±0.08*

圖1 各組大鼠心肌AMPK、P-AMPK、PPARα蛋白表達(dá)條帶情況

2.5 各組大鼠心肌AMPK mRNA、PPARαmRNA表達(dá)水平

與正常組比較，其余各組AMPK mRNA、PPARα mRNA均下降（P＜0.05）；與模型組比較，運(yùn)動(dòng)+MPK抑制劑組AMPK mRNA、PPARαmRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余各組AMPK mRNA、PPARαmRNA明顯升高（P＜0.05）；與曲美他嗪組比較，運(yùn)動(dòng)組AMPK mRNA升高但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），PPARαmRNA升高（P＜0.05），運(yùn)動(dòng)+AMPK抑制劑組AMPK mRNA下降（P＜0.05），PPARαmRNA表達(dá)下降但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與運(yùn)動(dòng)組比較，運(yùn)動(dòng)+AMPK抑制劑組AMPK mRNA、PPARαmRNA表達(dá)下降（P＜0.05）。見(jiàn)表 5。

表5 各組大鼠心肌細(xì)胞AMPK mRNA、PPARαmRNA的表達(dá)情況（）

表5 各組大鼠心肌細(xì)胞AMPK mRNA、PPARαmRNA的表達(dá)情況（）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型對(duì)照組比較，△P＜0.05；與曲美他嗪組比較，#P＜0.05；與運(yùn)動(dòng)組比較，&P＜0.05。

組別 n AMPK mRNA PPARαmRNA正常對(duì)照組 10 2.63±0.25 1.00±0.04模型對(duì)照組 8 0.96±0.08* 0.28±0.06*曲美他嗪組 9 1.87±0.20*△ 0.60±0.13*△運(yùn)動(dòng)組 8 2.03±0.26*△ 0.80±0.12*△#運(yùn)動(dòng)+AMPK抑制劑組 8 1.37±0.27*#& 0.44±0.10*&

3 結(jié)論

心肌能量代謝障礙是CHF的重要病理機(jī)制之一，AMPK信號(hào)通路在其中發(fā)揮重要作用。低血糖、劇烈運(yùn)動(dòng)、缺氧和缺血均可激活A(yù)MPK，從而調(diào)節(jié)糖脂代謝［6］。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）是AMPK的下游靶分子，二者形成AMPK/PPARα信號(hào)通路，在維持心肌能量代謝的穩(wěn)定性中起重要作用［7］。許多研究表明，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練是預(yù)防及延緩心衰進(jìn)程的重要方法，其機(jī)制可能是通過(guò)激活心肌AMPK來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)8周中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，運(yùn)動(dòng)組可明顯改善CHF模型大鼠心功能，且P-AMPK、PPARα蛋白表達(dá)明顯升高，證實(shí)了運(yùn)動(dòng)可激活A(yù)MPK/PPARα通路，并通過(guò)激活該通路改善CHF模型大鼠心功能；而運(yùn)動(dòng)+AMPK抑制劑組PPARα蛋白表達(dá)水平較運(yùn)動(dòng)前升高，這可能與PPARα蛋白存在多個(gè)上游因子有關(guān)；結(jié)果中存在蛋白及mRNA有表達(dá)不一致情況，考慮與mRNA翻譯受很多因素調(diào)控有關(guān)。綜上，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能夠通過(guò)激活A(yù)MPK/PPARα通路，從而調(diào)節(jié)心衰大鼠心肌能量代謝，改善心衰癥狀，延緩心衰進(jìn)展。但本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)AMPK/PPARα通路上兩個(gè)重要蛋白進(jìn)行檢測(cè)分析，后續(xù)將完善該通路其他蛋白的檢測(cè)，以期揭示運(yùn)動(dòng)調(diào)控AMPK/PPARα通路的更多機(jī)制，為運(yùn)動(dòng)防治心衰提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。