★ 舒華 宋釗銳 郭磊磊 付蓉 許滔 余銀翎 金愛林 楊煉 孫安會(.貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院 貴陽 550000;.遵義市第一人民醫(yī)院 貴州 遵義 56000;.貴州中醫(yī)藥大學 貴陽 550000;.開陽縣中西醫(yī)結合醫(yī)院 貴州 開陽 55000)
慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)是心臟疾病的終末階段,已成為一個主要的公共衛(wèi)生問題。以運動為主的心臟康復是心血管疾病二級預防的重要組成部分,目前指南[1-3]推薦心臟康復可在穩(wěn)定期慢性心衰的患者中使用,其益處已經得到大量研究支持。心肌能量代謝障礙是CHF重要的機制之一,臨床上改善心肌能量代謝的藥物及手段越來越受到臨床醫(yī)生的關注。AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)信號通路是調節(jié)細胞能量穩(wěn)態(tài)的重要通路之一,通過激活AMPK及其下游信號通路,調節(jié)能量代謝信號因子,可有效改善心肌能量代謝,從而延緩心衰進展,達到治療疾病的目的。本文通過建立阿霉素誘導的慢性心衰大鼠模型,檢測各組大鼠心功能及AMPK/PPARα通路相關蛋白及mRNA,以期證實運動對AMPK/PPARα信號通路及心肌能量代謝的影響,為心臟康復治療慢性心衰提供實驗依據。
實驗動物選用健康雄性SD大鼠50只,2個月齡,體重(110±10)g,由湖南省長沙市天勤生物技術有限公司提供,實驗動物生產許可證編號:SCXK(湘)2014-0011。實驗期間將動物分籠飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學實驗中心,常規(guī)飼養(yǎng)。飼養(yǎng)1周后進行實驗。
鹽酸阿霉素(北京索萊寶公司,貨號:D8740);AMPK抑制劑Compound C(MCE,貨號:HY-13418A);鹽酸曲美他嗪片(施維雅<天津>制藥有限公司)。
動物跑臺(江蘇賽昂斯,型號:SA101B);超聲儀(日本Fuji film ,型號:Visual Sonics Vevo 2100);熒光定量RCP儀(Thermo公司,型號:PIKO REAL 96);熒光PCR板(Thermo公司,型號:SPL0960);水平瓊脂糖電泳槽(北京六一生物科技有限公司,型號:DYCP-31DN)。
AMPK(美國CST),P-AMPK(Santa Cruz),PPARα(Novus),以上抗體來源為 Rabbit;β-actin(美國proteintech),抗體來源為Mouse。
50只SD大鼠采用隨機數字表法選取10只大鼠設為正常對照組,其余40只大鼠參考文獻[4]腹腔注射鹽酸阿霉素造模。將阿霉素配成2 mg/mL溶液,經腹腔注射建模,劑量1.5 mg/kg,共注射6周,每周2次。將存活且建模成功的36只大鼠按隨機數字表法分為4組:CHF模型對照組9只、曲美他嗪組9只、運動組9只和運動+AMPK抑制劑組9只。
運動訓練于第7周開始進行,運動組、運動+AMPK抑制劑組大鼠每天在跑臺上進行5 min的適應性訓練(坡度為0°,速度為5 m/min),隨后采用中強度運動訓練,即將跑臺調整為5°,20 m/min(根據 Bedford經驗公式[5],相當于60%最大攝氧量)。運動各組大鼠第1天運動20 min,第2天運動30 min,第3天運動40 min,此后運動量保持坡度5°,速度20 m/min,時間40 min,每周5 d,連續(xù)運動訓練8周。各組干預方式見表1。
表1 各組大鼠實驗干預方案
1.7.1 各組大鼠的死亡率及一般情況 觀察各組大鼠死亡率及一般情況,一般情況包括精神狀態(tài)、活動、反應、皮毛、水腫、大便、進食、運動等。
1.7.2 心臟超聲檢查 于第6周末行心臟超聲檢查,按大鼠體重3 mg/kg劑量腹腔注10%水合氯醛溶液麻醉大鼠后由專業(yè)超聲科醫(yī)師操作。測量指標:左室射血分數(Left ventricular ejection fraction,LVEF)、左室短軸縮短分數(Left ventricular fractional shortening,LVFS)。于14周末,再次行心臟超聲檢查,檢測指標:LVEF、LVFS、左室收縮末期內徑(Left ventricular end-systolic dimension,LVDs)、左室舒張末期內徑(Left ventricular enddiastolic dimension,LVDd)。
1.7.3 Western Blot檢 測 心 肌 AMPK、P-AMPK、PPARα蛋白表達水平 取出大鼠心臟,取心肌組織,加裂解液,裂解細胞后提取細胞總蛋白,剪取0.025 g心肌組織后用預冷的PBS沖洗,勻漿器中加入250 μL RIPA裂解液后反復研磨組織。研磨好的組織置于冰上10 min后,4 ℃、12 000 r/min離心15 min,離心后取上清。上清液按BCA蛋白定量試劑盒(Wellbio)的指示測定蛋白質濃度,作為WB檢測的參考。經電泳→轉膜→封閉→一抗孵育→二抗孵育→顯色曝光后,得出結果。
1.7.4 Real-time PCR法檢測心肌AMPK mRNA、PPARα mRNA表達水平 每只大鼠取0.2 g心肌組織研磨混勻,Trizol法提取組織總RNA,經離心、沉淀、電泳后,以細胞總mRNA為模板,逆轉錄cDNA。擴增體系為30 μL,擴增程序為95 ℃預變性10 min、95 ℃變性15 min、60 ℃退火60 s,40個循環(huán)。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成,AMPK引物序列為上游GACCTCGGTCAAGTGTCG,下游TGGGTTATCAACGGGCTA,引物長度為177 bp;PPARα引物序列 為上游ATCCACGAAGCCTACCTGA,下游CCTTGGCAAATTCCGTGAGC,引物長度為250 bp;GAPDH引物序列為上游 CAGCAACAGGGTGGTGGAC,下游TTTGAGGGTGCAGCGAACTT,引物長度為252 bp。每個樣本設3個復孔,采用SYBR法計算基因相對表達量。
采用SPSS 26.0軟件進行分析,數據采用均值±標準差()表示,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較符合正態(tài)分布及方差齊性時采用單因素方差分析,不符合正態(tài)分布時采用多個獨立樣本非參數檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
正常對照組無大鼠死亡,建模組大鼠死亡13只,死亡率26%,36只建模成功,1只未成功。在后期干預過程中,正常對照組、曲美他嗪組大鼠無死亡,其余3組大鼠各死亡1只。正常對照組大鼠實驗過程中精神、健康狀況良好,反應敏捷。各實驗組大鼠在建模開始后陸續(xù)出現精神差,反應遲鈍,進食減少,體重下降,四肢和或陰部和或腹部出現不同程度的水腫。至14周末模型對照組大鼠上述癥狀明顯加重,曲美他嗪組及運動干預各組癥狀均較前減輕。
建模6周后,與正常對照組比較,模型組LVEF和LVFS下降(P<0.05),說明造模成功。見表2。
表2 6 周后各組大鼠LVEF和LVFS變化() %
表2 6 周后各組大鼠LVEF和LVFS變化() %
注:與正常對照組比較,*P<0.05。
組別 n LVEF LVFS正常對照組 10 93.57±2.25 68.68±2.25模型組 36 73.09±2.06* 44.44±2.29*
與正常對照組比較,造模各組LVEF和LVFS均下降,LVDd、LVDs均升高(P<0.05);與模型對照組比較,干預各組LVEF、LVFS均升高(P<0.05),運動組 LVDd、LVDs下降(P<0.05),曲美他嗪組、運動+AMPK抑制劑組LVDs下降(P<0.05),LVDd比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與曲美他嗪組比較,運動組LVEF、LVFS升高(P<0.05)、LVDd、LVDs比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),運動+AMPK抑制劑組LVEF、LVFS下降、LVDs升高(P<0.05),LVDd比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與運動組比較,運動+AMPK抑制劑組LVEF、LVFS下降(P<0.05),LVDs升高(P<0.05),LVDd比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。
表3 14周后各組大鼠心臟功能變化()
表3 14周后各組大鼠心臟功能變化()
注:與正常對照組比較,*P<0.05;與模型對照組比較,△P<0.05;與曲美他嗪組比較,#P<0.05;與運動組比較,&P<0.05。
組別 n LVEF/% LVFS/% LVDd/mm LVDs/mm正常對照組 10 91.37±0.35 60.15±1.46 5.16±0.18 2.38±0.27模型對照組 8 66.89±1.00* 40.74±0.14* 6.86±0.88* 4.07±0.18*曲美他嗪組 9 75.21±0.30*△ 48.73±2.25*△ 6.26±0.49* 2.98±0.12*△運動組 8 82.89±0.39*△# 51.76±1.10*△# 6.03±0.07*△ 2.84±0.10*△運動 +AMPK 組 8 72.64±2.02*△#& 42.50±0.86*#& 6.48±0.51* 3.51±0.12*△#&
與正常對照組比較,各組間AMPK蛋白表達均無統(tǒng)計學差異(P>0.05),各組P-AMPK均升高(P<0.05)、運動組PPARα蛋白表達下降無統(tǒng)計學意義(P>0.05),其余各組PPARα下降(P<0.05);與模型組比較,曲美他嗪組P-AMPK下降(P<0.05),PPARα蛋白表達無統(tǒng)計學意義(P>0.05),運動組 P-AMPK、PPARα 蛋白表達明顯升高(P<0.05)、運動+AMPK抑制劑組P-AMPK、PPARα蛋白表達無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與曲美他嗪組比較,運動各組P-AMPK蛋白表達升高P<0.05),PPARα蛋白表達差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與運動組比較,運動+AMPK抑制劑組P-AMPK蛋白表達下降(P<0.05),PPARα蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表 4、圖 1。
表4 各組大鼠AMPK、P-AMPK、PPARα蛋白表達()
表4 各組大鼠AMPK、P-AMPK、PPARα蛋白表達()
注:與正常對照組比較,*P<0.05;與模型對照組比較,△P<0.05;與曲美他嗪組比較,#P<0.05;與運動組比較,&P<0.05。
組別 n AMPK P-AMPK PPARα正常對照組 10 0.59±0.03 0.10±0.02 0.49±0.14模型對照組 8 0.59±0.03 0.25±0.03* 0.15±0.04*曲美他嗪組 9 0.59±0.06 0.13±0.01△ 0.29±0.07*運動組 8 0.61±0.09 0.39±0.04*△# 0.38±0.12△運動+AMPK抑制劑組 8 0.65±0.08 0.28±0.04*#& 0.24±0.08*
圖1 各組大鼠心肌AMPK、P-AMPK、PPARα蛋白表達條帶情況
與正常組比較,其余各組AMPK mRNA、PPARα mRNA均下降(P<0.05);與模型組比較,運動+MPK抑制劑組AMPK mRNA、PPARαmRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),其余各組AMPK mRNA、PPARαmRNA明顯升高(P<0.05);與曲美他嗪組比較,運動組AMPK mRNA升高但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),PPARαmRNA升高(P<0.05),運動+AMPK抑制劑組AMPK mRNA下降(P<0.05),PPARαmRNA表達下降但無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與運動組比較,運動+AMPK抑制劑組AMPK mRNA、PPARαmRNA表達下降(P<0.05)。見表 5。
表5 各組大鼠心肌細胞AMPK mRNA、PPARαmRNA的表達情況()
表5 各組大鼠心肌細胞AMPK mRNA、PPARαmRNA的表達情況()
注:與正常對照組比較,*P<0.05;與模型對照組比較,△P<0.05;與曲美他嗪組比較,#P<0.05;與運動組比較,&P<0.05。
組別 n AMPK mRNA PPARαmRNA正常對照組 10 2.63±0.25 1.00±0.04模型對照組 8 0.96±0.08* 0.28±0.06*曲美他嗪組 9 1.87±0.20*△ 0.60±0.13*△運動組 8 2.03±0.26*△ 0.80±0.12*△#運動+AMPK抑制劑組 8 1.37±0.27*#& 0.44±0.10*&
心肌能量代謝障礙是CHF的重要病理機制之一,AMPK信號通路在其中發(fā)揮重要作用。低血糖、劇烈運動、缺氧和缺血均可激活AMPK,從而調節(jié)糖脂代謝[6]。過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)是AMPK的下游靶分子,二者形成AMPK/PPARα信號通路,在維持心肌能量代謝的穩(wěn)定性中起重要作用[7]。許多研究表明,運動訓練是預防及延緩心衰進程的重要方法,其機制可能是通過激活心肌AMPK來實現的。本實驗結果表明,經8周中等強度運動訓練后,運動組可明顯改善CHF模型大鼠心功能,且P-AMPK、PPARα蛋白表達明顯升高,證實了運動可激活AMPK/PPARα通路,并通過激活該通路改善CHF模型大鼠心功能;而運動+AMPK抑制劑組PPARα蛋白表達水平較運動前升高,這可能與PPARα蛋白存在多個上游因子有關;結果中存在蛋白及mRNA有表達不一致情況,考慮與mRNA翻譯受很多因素調控有關。綜上,本實驗證實了運動訓練能夠通過激活AMPK/PPARα通路,從而調節(jié)心衰大鼠心肌能量代謝,改善心衰癥狀,延緩心衰進展。但本實驗僅對AMPK/PPARα通路上兩個重要蛋白進行檢測分析,后續(xù)將完善該通路其他蛋白的檢測,以期揭示運動調控AMPK/PPARα通路的更多機制,為運動防治心衰提供更多實驗依據。