強(qiáng)力定眩片中2種成分的藥動(dòng)學(xué)研究

羅歡歡，馮澤宇，李 捷，謝艷華，田惠玲，肖會(huì)敏，王四旺*，李志平

1.西北大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部，西安 710069；2.陜西漢王藥業(yè)股份有限公司，漢中 723000；3.空軍軍醫(yī)大學(xué)中藥與天然藥物教研室，西安 710032

強(qiáng)力定眩片(Qiangli Dingxuan Tablets，QLDXT)是陜西漢王藥業(yè)股份有限公司獨(dú)家生產(chǎn)的復(fù)方制劑，系由天麻、杜仲、杜仲葉、野菊花、川芎5味中藥組成， 該藥能擴(kuò)張血管，降低血黏稠度，臨床療效顯著[1-4]。其目前臨床應(yīng)用最多的適應(yīng)證主要集中在各種原因所致的眩暈性疾病[5-6]。中藥藥代動(dòng)力學(xué)可以揭示多成分之間的相互作用，是中藥化學(xué)與中藥藥效學(xué)研究之間的橋梁和紐帶，為中藥物效基礎(chǔ)研究中的關(guān)鍵一步[7-8]。

為保證QLDXT的安全性和規(guī)范臨床用藥，課題組前期對(duì)QLDXT中的化學(xué)成分作了物質(zhì)歸屬，其主要成分包含黃酮類(lèi)、有機(jī)酚酸類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)等。并用HPLC法建立了制劑的指紋圖譜和13種成分的含量測(cè)定，有關(guān)QLDXT藥代動(dòng)力學(xué)尚未報(bào)道。為明確QLDXT在體內(nèi)含量的經(jīng)時(shí)變化，本實(shí)驗(yàn)以相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道和課題組對(duì)制劑中13個(gè)代表成分的含量研究為基礎(chǔ)，用HPLC法對(duì)QLDXT的入血成分進(jìn)行研究。

迄今為止，有關(guān)QLDXT的報(bào)道多集中于臨床研究，而其在體內(nèi)以何種成分、何種形式發(fā)揮作用，至今尚屬空白。本試驗(yàn)建立快速、靈敏的HPLC法，并用于QLDXT大鼠血漿中天麻素(gastrodin, GAS)和藁本內(nèi)酯(ligustilide, LIG)的測(cè)定，為闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，深入研究人體藥動(dòng)學(xué)以及設(shè)計(jì)合理的用藥方案提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-2030plus高效液相色譜儀(SHIMADZU公司)；BSA124S電子分析天平(德國(guó)Sartorius)；氮吹儀(天津恒奧科技有限公司)；快速渦旋混勻器(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司)；低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)。

1.2 試藥

強(qiáng)力定眩片藥粉(批號(hào)279011-006009，陜西漢王藥業(yè)股份有限公司)。對(duì)照品：天麻素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)HR16313B1)、藁本內(nèi)酯(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)HL09355198)，均購(gòu)自寶雞辰光生物科技有限公司。肝素鈉(蘇州亞科科技有限公司)；甲酸(天津大茂化工有限公司)；甲醇、乙腈均為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Fisher公司。

1.3 動(dòng)物

雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量(220±50) g，由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(陜)2019-001。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Lamdo Stamsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動(dòng)相1 mL·L-1甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～2 min，3%～7% B；2～20 min，7% B；20～30 min，7%～12% B；30～90 min，12%～30% B)。檢測(cè)波長(zhǎng)：220、280 nm，進(jìn)樣量：30 μL；流速為0.7 mL·min-1；柱溫為30 ℃。

2.2 強(qiáng)力定眩片灌胃藥液的制備

精密稱(chēng)取強(qiáng)力定眩片藥粉適量，置于潔凈燒杯中，加入超純水適量，超聲(功率250 W，頻率：40 kHz)混勻，即得0.42 g·mL-1的強(qiáng)力定眩片灌胃藥液。

2.3 混合對(duì)照品母液及系列對(duì)照品溶液的制備

取GAS、LIG對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.508 、1.236 mg·mL-1的混合對(duì)照品母液。精密吸取混合對(duì)照品母液加甲醇稀釋成7個(gè)系列對(duì)照品溶液(GAS質(zhì)量濃度分別為101.6、50.8、25.4、12.7、6.35、5.29、3.18 μg·mL-1，LIG質(zhì)量濃度分別為247.20、123.60、61.80、30.90、15.45、12.88、7.73 μg·mL-1)，置于4 ℃冰箱中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 血漿樣品處理

精密吸取血漿200 μL，加入乙腈600 μL，渦旋2 min，離心10 min(4 ℃，13 000 r ·min-1)，小心吸取全部上清于40 ℃氮?dú)饬飨麓蹈桑瑲堅(jiān)?00 μL 體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇復(fù)溶，離心10 min(4 ℃，13 000 r·min-1)，取上清，待測(cè)。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn) 分別取大鼠空白血漿、空白血漿加對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)、給藥后的大鼠血漿樣品加內(nèi)標(biāo)，按2.4項(xiàng)下方法處理，并按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，得到空白血漿、空白血漿+對(duì)照品、給藥后血漿樣品色譜圖(圖1)。結(jié)果顯示，天麻素與藁本內(nèi)酯的測(cè)定不受血漿中雜質(zhì)及內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，且待測(cè)成分可實(shí)現(xiàn)完全分離，表明建立的方法專(zhuān)屬性良好。

注：A.空白血漿；B.空白血漿加對(duì)照品；C.大鼠含藥血漿色譜圖；1.天麻素；2.藁本內(nèi)酯。

2.5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 分別吸取2.3項(xiàng)下的系列對(duì)照品溶液各20 μL，加入200 μL空白血漿中，配制成相應(yīng)的系列質(zhì)量濃度含藥血漿樣品，按照2.4項(xiàng)下方法處理，按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣。以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，峰面積為縱坐標(biāo)(y)，進(jìn)行線性回歸，線性方程和范圍見(jiàn)表1。結(jié)果表明，天麻素和藁本內(nèi)酯在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r≥0.999 5。

表1 天麻素和藁本內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

2.5.3精密度和準(zhǔn)確度 取200 μL大鼠空白血漿共6份，加入2.5.2項(xiàng)下配制的高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的GAS、LIG溶液20 μL，制成制成高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品(QC)，再按照2.4項(xiàng)下方法處理，日內(nèi)組1 d內(nèi)連續(xù)測(cè)定6次，日間組每天測(cè)定1次，連續(xù)6 d，記錄GAS和LIG的峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其質(zhì)量濃度。結(jié)果，血漿中2種成分的日內(nèi)、日間準(zhǔn)確度RE在-13.07%～7.70%之間，日內(nèi)、日間精密度RSD在0.95%～10.03%之間，均符合生物樣品分析測(cè)定方法的要求。見(jiàn)表2。

表2 大鼠血漿中GAS和LIG的精密度和準(zhǔn)確度 (n=6)

表3 大鼠血漿中GAS和LIG的回收率 (n=6)

2.5.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 按2.5.3項(xiàng)下含藥血漿樣品的制備方法，對(duì)高、中、低質(zhì)量濃度的血漿樣品進(jìn)行穩(wěn)定性考察。室溫放置4 h，考察其室溫穩(wěn)定性；-20 ℃冰箱中反復(fù)凍融3次，考察其反復(fù)凍融穩(wěn)定性；-80 ℃冰箱中冷凍30 d，檢測(cè)其長(zhǎng)期穩(wěn)定性。結(jié)果，樣品在短期、長(zhǎng)期、反復(fù)凍融穩(wěn)定性試驗(yàn)中RSD均在1.07%～10.15%之間，RE在-10.56%～12.70%之間，說(shuō)明血漿樣品在上述考察條件下均穩(wěn)定，符合生物樣品檢測(cè)的要求，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 大鼠血漿中GAS和LIG的穩(wěn)定性 (n=6)

2.6 藥代動(dòng)力學(xué)研究

選取健康雄性SD大鼠，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水，按6 g·kg-1(按15 mL·kg-1)的劑量灌胃給藥，每只大鼠于給藥前及給藥后0.08、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、10 h眼眶靜脈叢取血，每次取血約0.5 mL，置于用10 μL 10 g·L-1肝素鈉浸潤(rùn)過(guò)的EP管中，以3 000 r·min-1離心10 min，吸取上層血漿，按2.4項(xiàng)下方法處理，按2.1項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析。用DAS2.0軟件進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)擬合計(jì)算，獲得天麻素、藁本內(nèi)酯平均藥時(shí)曲線與相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。擬合結(jié)果GAS與LIG藥動(dòng)學(xué)特征符合二室模型，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)與各組分藥-時(shí)曲線見(jiàn)圖2、表5。結(jié)果顯示，大鼠給藥5 min后血中可以檢測(cè)到GAS和LIG，二者均在0.5 h左右達(dá)峰，半衰期較短，分別為8.47 、7.70 h。Cmax分別為(32.37±1.23)、(230.32±2.99) mg·L-1。LIG的Cmax和AUC均較大，有利于發(fā)揮療效。CLz/F分別為(20.22±5.52)、(11.61±1.11) L·h·kg-1，Vz/F分別為(220.41±30.51)、(114.42±153.15) L·kg-1，兩者的MRT(0～t)、 MRT(0～∞)較??；提示在體內(nèi)的滯留時(shí)間短，消除速度快。綜上表明，2種成分在大鼠體內(nèi)吸收迅速，起效快，不易蓄積；提示QLDXT臨床用藥時(shí)二次用藥時(shí)間的間隔不能太長(zhǎng)，否則難以維持有效血藥質(zhì)量濃度。

注：A.天麻素；B. 藁本內(nèi)酯。

3 討論

3.1 測(cè)定成分的選擇

灌胃后血漿中主要檢測(cè)到天麻素(gastrodin, GAS)、藁本內(nèi)酯(ligustilide, LIG)、東莨菪內(nèi)酯、沒(méi)食子酸4 種成分，且這4 種成分均為L(zhǎng)C-MS物質(zhì)歸屬中檢測(cè)到的成分。研究表明GAS為君藥天麻中的主要成分，具有抗眩暈、降壓、降血脂、降血糖、降低血液黏稠度、腦缺氧保護(hù)、抗血小板聚集等多種藥理效應(yīng)[9-14]。川芎苯酞類(lèi)成分具有保護(hù)心腦血管、改善血液流變和調(diào)節(jié)血脂代謝的作用，而LIG則是這些藥效成分之一[15-16]。

表5 GAS和LIG的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

由于沒(méi)食子酸和東莨菪內(nèi)酯的分離度較差，且內(nèi)源性干擾較大，峰面積較小，該條件下提取回收率較低，因此未能對(duì)其進(jìn)行定量研究。研究表明，達(dá)峰質(zhì)量濃度(Cmax)和血藥質(zhì)量濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC0～∞)是評(píng)價(jià)活性成分體內(nèi)暴露量的2個(gè)重要指標(biāo)，藥效活性較強(qiáng)且體內(nèi)暴露顯著的成分可能為復(fù)方中的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[17-18]，故選擇GAS、LIG作為QLDXT藥動(dòng)學(xué)研究的指標(biāo)成分。

3.2 色譜條件選擇

實(shí)驗(yàn)中嘗試了不同品牌和規(guī)格的色譜柱，如：Thermo Syncronis C18(50 mm×2.1 mm，5 μm)、Lamdo Stamsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，最終以Lamdo Stamsil C18柱(250×4.6 mm，5 μm)分離效果較理想。

3.3 樣品前處理方法的優(yōu)化

蛋白沉淀法、液液萃取法和固相萃取法是測(cè)定生物樣品時(shí)常用的樣品前處理方法。蛋白沉淀法因具有操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的特點(diǎn)，故目前最常用。本實(shí)驗(yàn)中比較了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲醇-乙腈(1∶1)、甲醇-乙酸乙酯(1∶1)等不同的處理方法。結(jié)果顯示，以上條件下目標(biāo)峰峰面積無(wú)顯著差異，但乙腈沉淀蛋白較為完全，且重復(fù)性好，內(nèi)源性干擾較少，目標(biāo)峰的提取回收率較高，峰形良好，故用乙腈作為蛋白沉淀劑。實(shí)驗(yàn)初期采用乙腈(A)-1 mL·L-1甲酸水(B)為流動(dòng)相時(shí)，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)峰嚴(yán)重拖尾，而采用甲酸后，峰形得以改善。因此，最終選擇乙腈除去血漿中的蛋白，乙腈(A)-1 mL·L-1甲酸水(B)作為流動(dòng)相。氮吹是富集成分、提高檢測(cè)質(zhì)量濃度的常用方法[19]。為提高目標(biāo)峰的檢測(cè)質(zhì)量濃度，采用了氮吹復(fù)溶的方法。

3.4 藥動(dòng)學(xué)結(jié)果分析

強(qiáng)力定眩片6 g·kg-1灌胃給予大鼠后0.5 h左右GAS和LIG在血漿中即達(dá)到較高的質(zhì)量濃度，Cmax分別為32.37 mg·L-1和230.32 mg·L-1，藁本內(nèi)酯的Cmax和AUC均較高，有利于發(fā)揮療效。CLz/F分別為20.22 L·h·kg-1和11.61 L·h·kg-1，Vz/F分別為220.41 L·kg-1和114.42 L·kg-1，兩者的MRT(0～t)、 MRT(0～∞)較低；提示在體內(nèi)的滯留時(shí)間短，消除速度快。實(shí)驗(yàn)前期對(duì)10 批強(qiáng)力定眩片樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)LIG在樣品中的含量并不是最高，可能是LIG脂溶性較大，更易透過(guò)生物膜進(jìn)入體內(nèi)。綜上表明，GAS和LIG在大鼠體內(nèi)吸收迅速，起效快，不易蓄積；提示強(qiáng)力定眩片臨床用藥時(shí)的二次給藥時(shí)間不能間隔太長(zhǎng)，否則難以維持有效成分的血藥質(zhì)量濃度。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首次研究了QLDXT中GAS和LIG在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程符合二室模型，分布消除迅速,半衰期和血漿清除率均比較穩(wěn)定。這些結(jié)果為QLDXT的組織分布研究奠定了基礎(chǔ)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)建立了一種簡(jiǎn)便、快速的HPLC法，并用于QLDXT血漿中GAS和LIG的測(cè)定，為闡明其物效基礎(chǔ)等提供依據(jù)。但該方法僅檢測(cè)了血漿中的兩種成分，可能原因一是成藥中的含量低，HPLC檢測(cè)限不能檢出；二是有可能代謝成其他產(chǎn)物，且目前各成分在機(jī)體內(nèi)的暴露和藥效與靶器官之間的相互作用規(guī)律還不明確。后續(xù)將重點(diǎn)研究入血成分體內(nèi)暴露量和藥效與靶器官之間的聯(lián)系及QLDXT中的其他成分的藥代動(dòng)力學(xué)特征。