NIR-BP聯(lián)合定量模型快速分析長春西汀注射液的含量

張秉華，王小亮

陜西省食品藥品檢驗研究院，西安 710065

長春西汀是長春花堿的半合成衍生物，于20世紀70年代由匈牙利Gedeon Richter公司研制，具有增加腦血流量、促進頭部葡萄糖和氧的攝取利用、減輕腦缺氧損傷、清除動脈粥樣硬化斑塊等藥理作用，以其顯著的治療效果和極低的毒副作用在臨床上廣泛應用，成為治療心腦血管疾病的一線用藥，在我國的使用量逐年增加[1-4]。

目前，對長春西汀的檢驗和質量控制方法主要包括用高效液相色譜法測定長春西汀注射液、長春西汀片中長春西汀的含量以及用氣相色譜-質譜法測定長春西汀注射液中的長春西汀含量等，而對長春西汀近紅外建模和快速檢驗方法的研究還未見相關報道[5-8]。

本文將近紅外光譜快速檢測方法和BP(Back Propagation)神經(jīng)網(wǎng)絡智能算法相結合，進行了長春西汀注射液的NIR-BP聯(lián)合定量建模方法研究，實現(xiàn)了對長春西汀注射液含量的定量快速檢驗。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Matrix-F近紅外光譜儀(德國Bruker公司)，配有1.5 m長固體光纖探頭測樣附件，銦鎵砷(InGaAs)檢測器，OPUS5.5光譜分析軟件(德國Bruker公司)；MathWorks公司的MATLAB R2010商用數(shù)學軟件；高效液相色譜儀(美國Waters公司)，配有DAD檢測器；BP211D電子分析天平(德國賽多利斯公司)。

1.2 試藥

2020年國家評價性抽檢長春西汀注射液樣品，包含8個廠家的78批樣品。

2 方法

2.1 含量測定

按照國家新藥轉正標準56冊“WS1-(X-177)2004Z”用高效液相色譜法測定長春西汀注射液的含量。所有樣本的含量分布和頻數(shù)見圖1，其中大部分樣品的含量分布在4.88～6.04 mg·mL-1范圍內(nèi)。

注：A.含量分布；B.含量頻數(shù)。

2.2 近紅外光譜測定

定量模型建模時建模集、校正集和預測集的劃分見表1，建模集、校正集和預測集的樣本數(shù)量分別為56、10、12，為避免連續(xù)樣本建?？赡芤氲南到y(tǒng)誤差，建模時采用隨機取樣方法。樣本前2個主成分分布見圖2，由圖2可知，建模集、校正集和預測集分布均勻，隨機取樣結果合理有效。

表1 定量模型建模樣本劃分

圖2 樣本的前兩個主成分得分分布

近紅外光譜測定方法：用液體附件間接測量法，以固體光纖探頭配合液體附件直接測量采集樣品NIR圖譜。光譜掃描范圍為12 000～4 000 cm-1，分辨率8 cm-1，掃描次數(shù)64次，每批樣品測定3次，取其平均值。最終獲得的樣本光譜見圖3。

圖3 經(jīng)平均后的近紅外建模光譜

2.3 定量模型的精度評價

建模集用于定量模型的建立，校正集參與優(yōu)化模型，提高模型的泛化能力，而預測集用于對模型的預測精度檢驗。定量模型的精度通常用相關系數(shù)R、交叉驗證均方根誤差RMSECV、預測均方根誤差REMSEP等指標來衡量[9-10]。R用于考察樣本預測值與真實值之間的相關程度，R約接近1，說明預測值和真實值之間的相關程度越高；RMSECV用于評價所建立模型的預測能力，通過交叉驗證來實現(xiàn)；RMSEP用于評價所建立模型對外部獨立樣本的預測能力，RMSEP越小，說明模型對外部獨立樣本的預測能力越高。R、REMSECV和RMSEP的具體表示如下：

2.4 光譜分析與預處理

受測試樣品狀態(tài)、測試設備誤差、高頻隨機誤差、光散射及雜光等外部因素的影響，近紅外光譜中除了待測樣品的真實響應信息外，還包含其他干擾背景信息。通過預處理可以有效地改進光譜質量，提高后續(xù)建模的準確性。常用的光譜數(shù)據(jù)預處理方法包括均值中心化MC、Min Max歸一化、一階求導、標準正態(tài)變換SNV、SG平滑、多元散射校正MSC等[11-12]，經(jīng)過不同預處理方法處理后的樣本光譜見圖4。

注：A.均值中心化MC；B.MinMax歸一化；C.一階求導；D.標準正態(tài)變換SNV；E.SG平滑；F.多元散射校正MSC。

2.5 BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡

BP(Back-Propagation)神經(jīng)網(wǎng)絡是一種按誤差逆?zhèn)鞑ニ惴ㄓ柧毜那梆伓鄬泳W(wǎng)絡，網(wǎng)絡包含輸入層、隱含層和輸出層，每層網(wǎng)絡均由多個并行計算的神經(jīng)元組成，網(wǎng)絡層與層之間通過神經(jīng)元連接，而同一層網(wǎng)絡的神經(jīng)元相互獨立[13-14]。典型多輸入單輸出BP神經(jīng)網(wǎng)絡結構圖見圖5，xj表示輸入層第j個節(jié)點的輸入，wij表示隱含層第i個節(jié)點到輸入層第j個節(jié)點的權值，θi表示隱含層第i個節(jié)點的閾值，Φ表示隱含層的激勵函數(shù)，wki表示輸出層第k個節(jié)點到隱含層第i個節(jié)點的權值，ak表示輸出層第k個節(jié)點的閾值，ψ表示輸出層的激勵函數(shù)，yk表示輸出層第k個節(jié)點的輸出。

BP神經(jīng)網(wǎng)絡具有極強的非線性映射能力，在函數(shù)逼近、模式識別、分類和數(shù)據(jù)壓縮等領域都有廣泛的應用[15-19]。理論上，只要隱含層神經(jīng)元的數(shù)量足夠多，BP神經(jīng)網(wǎng)絡能夠以任意精度對任意非線性映射進行逼近，契合了近紅外光譜定量模型對預測精度的需求。

圖5 典型多輸入單輸出BP神經(jīng)網(wǎng)絡結構圖

3 結果與討論

3.1 光譜預處理方法的選擇

由于不同的預處理方法對光譜信息的改善側重點不同，如導數(shù)預處理側重于消除原始光譜的基線漂移及背景因素干擾，而標準正態(tài)變換主要用來消除樣品固體顆粒的大小、光程變化及表面散射對樣品漫反射光譜的影響[20-21]。因此，無法直接對上述6種預處理方法進行優(yōu)劣判定，但可結合后續(xù)建模過程，從主成分分析信息解釋程度和定量建模精度兩方面出發(fā)選擇最優(yōu)的光譜預處理方法。

不同預處理方法對應的主成分累計貢獻率見圖6，除一階求導預處理方法外，其余5種預處理方法在前30階主成分的累計貢獻率均超過了99%，說明其他5種預處理方法均能很好地保留樣本的有效光譜信息，可作為建模備選預處理方法。

圖6 不同預處理方法對應的主成分累計貢獻率

建立6種預處理方法的BP神經(jīng)網(wǎng)絡定量預測模型，對模型的預測精度進行對比，見表2。用原始光譜、均值中心化MC、MinMax歸一化、一階求導和SG平滑預處理光譜進行建模時，所有樣本預測值與真實值的相關系數(shù)R均未超過0.900。標準正態(tài)變換SNV預處理方法所建立模型的交叉驗證均方根誤差最小，但對預測集的預測誤差較大，導致其整體相關系數(shù)R并非最優(yōu)。多元散射校正MSC預處理方法對應的模型預測值與真實值的相關系數(shù)R為0.972，為6種預處理方法中的最優(yōu)值，因此，后續(xù)建模中采用多元散射校正MSC方法對光譜進行預處理。

3.2 建模光譜段的選擇

通過對建模光譜段的篩選，不僅可以有效降低模型的復雜程度，還可以剔除大量不相關的冗余信息，建立預測能力更強、穩(wěn)健性更好的預測模型[22-23]。通過對樣本光譜的分析可知，光譜在8 000～12 000 cm-1譜段內(nèi)的吸光度很小，很容易受到噪聲信號的干擾，因此建模時首先剔除該譜段的光譜數(shù)據(jù)。而在4 000 cm-1附近容易受到邊緣效應的影響，因此對4 000～4 500 cm-1譜段也不予考慮。從剩余的4 500～8 000 cm-1譜段中選取不同的譜段區(qū)間進行建模預測，結果見表3，選取建模譜段為6 000～8 000 cm-1時，可獲得最準確的模型預測結果。

表2 不同預處理方法的主成分累計貢獻率和模型預測精度

表3 不同建模譜段對應的模型預測精度

3.3 神經(jīng)網(wǎng)絡參數(shù)的選擇

BP神經(jīng)網(wǎng)絡的設計一般從網(wǎng)絡的層數(shù)、每層中神經(jīng)元的數(shù)量、激勵函數(shù)、初始值以及學習速率等方面考慮[24-25]。對于一般應用，1～2層隱含層即可滿足精度要求，層數(shù)太多會增加網(wǎng)絡復雜性，影響網(wǎng)絡收斂速度，本研究中采用1層隱含層。隱含層的神經(jīng)元數(shù)量太少，網(wǎng)絡的學習能力有限，容錯性差；神經(jīng)元太多，會增加網(wǎng)絡訓練時間，降低網(wǎng)絡的泛化能力。不同隱含層神經(jīng)元數(shù)量對應的模型預測精度見表4，當神經(jīng)元取值為20個時，所建立的模型具有最佳預測精度。

表4 不同隱含層神經(jīng)元數(shù)量對應的模型預測精度

BP神經(jīng)網(wǎng)絡中常用的激勵函數(shù)包括雙曲正切函數(shù)tansig、對數(shù)S型函數(shù)logsig和線性函數(shù)purelin等，隱含層和輸出層分別取不同激勵函數(shù)時對應的模型預測精度見表5，當隱含層激勵函數(shù)為purelin，輸出層預測函數(shù)為tansig時，所建立的BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型預測精度最佳。

表5 不同激勵函數(shù)對應的模型預測精度

學習速度主要用來控制網(wǎng)絡訓練過程中的權值變化幅度大小，學習速度過低會減慢網(wǎng)絡學習速度，導致網(wǎng)絡很難收斂；學習速度過高會使權值和誤差函數(shù)產(chǎn)生分歧，導致網(wǎng)絡性能指標振蕩，無法達到合適的值。學習速率一般取值在0.01～0.10之間，本文中取為0.05。

3.4 定量模型的建立

根據(jù)光譜預處理、建模譜段和神經(jīng)網(wǎng)絡參數(shù)的優(yōu)化結果，最終確定的NIR-BP聯(lián)合定量模型建模參數(shù)選取見表6。

表6 NIR-BP聯(lián)合定量模型建模參數(shù)

最終所建立的NIR-BP聯(lián)合定量模型對建模集和校正集的含量預測結果及誤差見圖7，模型預測值和真實值很好吻合，最大絕對誤差為0.40 mg·mL-1，建模集和校正集的預測均方根誤差RMSE和RMSECV分別為0.11、0.16 mg·mL-1。

注：A.含量預測；B.預測誤差。

建模集及校正集樣本含量預測值與真實值的相關系數(shù)分別為0.994 7、0.997 7，說明預測值和真實值顯著相關。見圖8。

注：A.建模集；B.校正集。

3.5 定量模型驗證

3.5.1準確性 用12組預測集樣本進行定量模型的準確性驗證，結果見表7。預測值與真實值的最大絕對偏差為0.27 mg·mL-1，平均絕對偏差為0.10 mg·mL-1，最大相對偏差為4.54%，平均相對偏差為1.64%，未超過近紅外快速檢驗誤差限度(5%)。同時，將定量模型預測值與標準方法檢驗真實值進行配對t檢驗，在95%的置信區(qū)間內(nèi)，P值為0.914 8，小于顯著性水平0.05對應的臨界值2.18，說明模型預測結果與標準檢驗方法檢測結果無顯著性差異。

表7 NIR-BP定量模型預測準確性驗證

圖9給出了預測集樣本含量預測值及與真實值的相關性，預測值和真實值的相關系數(shù)為0.997 8，預測均方根誤差REMSEP為0.14 mg·mL-1，所建立的定量模型在預測集上取得了很高的預測精度。

注：A.含量預測值；B.與真實值相關性。

3.5.2專屬性 用歐氏距離來衡量所建立定量模型的專屬性，假定樣本呈隨機分布，理論上99%的樣品應分布在μ+3σ范圍內(nèi)。建模集和校正集共計66組樣本光譜數(shù)據(jù)與平均光譜之間的歐氏距離平均值μ=0.167 1，標準偏差σ=0.095 8，以此確定的專屬性判定閾值為0.454 6。所建立的NIR-BP聯(lián)合定量模型專屬性驗證結果見表8，樣本1～12為預測集樣本，其最大歐氏距離為0.417 2，全部檢驗通過。樣本13～16為煙酸注射液樣本，其歐氏距離均遠大于閾值，全部檢驗不通過。專屬性驗證樣本的歐氏距離分布情況見圖10，驗證結果表明所建立的定量模型對長春西汀注射液具有很好的專屬性。

表8 NIR-BP定量模型專屬性驗證

圖10 專屬性驗證樣本歐氏距離分布

4 結論

本文將近紅外光譜快速檢驗方法和BP神經(jīng)網(wǎng)絡智能算法相結合，通過對光譜預處理方法、建模光譜段和神經(jīng)網(wǎng)絡參數(shù)的優(yōu)化，最終建立了長春西汀注射液的NIR-BP聯(lián)合定量模型。

模型的準確性和專屬性驗證結果顯示，所建立的定量模型在95%的置信區(qū)間內(nèi)，P值為0.914 8，與標準檢驗方法檢測結果無顯著性差異。長春西汀注射液樣本的歐氏距離均小于閾值，煙酸注射液樣本的歐氏距離均遠大于閾值，表現(xiàn)出良好的專屬性。所建立的定量模型均有準確、快速、便捷的特點，提供了近紅外光譜建模的新方法，同時對藥品的在線檢驗具有較高的參考價值。