干擾NSUN2通過調(diào)控細(xì)胞周期蛋白表達(dá)抑制黑素瘤細(xì)胞增殖

李國錦， 王金萍， 張 強， 見玉文， 王珊珊, 2), 4)，張 濤,3),4)， 王 令,4)*

(1)陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院 生物工程系，陜西 漢中 723001； 2)陜西理工大學(xué) 陜西資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723001；3)陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 漢中 723001； 4)陜西理工大學(xué)陜西秦巴生物資源與生態(tài)環(huán)境省部共建國家重點實驗室(培育)，陜西 漢中 723001)

黑素瘤是一種高轉(zhuǎn)移與高侵襲性的惡性腫瘤，常見于皮膚，少見于口腔、腸道或眼睛[1]。黑素瘤的主要特征是病情進(jìn)展迅速，易侵襲其他組織器官，且在發(fā)病早期癥狀不明顯，診斷率較低，一旦確診多屬晚期[2]。一項多機構(gòu)的回顧性研究評估了抗pd-1抗體在肢端黑素瘤和粘膜黑素瘤患者中的臨床療效。肢端黑素瘤患者的客觀緩解率和中位無進(jìn)展生存期分別為32%和4.1個月，粘膜黑素瘤患者的客觀緩解率為23%和3.9個月[3]。現(xiàn)有的臨床治療手段很難取得理想的治療效果，且患者的預(yù)后較差，生存率也極低[4-5]。因此，進(jìn)一步深入探索黑素瘤的發(fā)病機制并尋找新的分子靶點，會在一定程度上提高早期診斷與治療，有效減少腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，進(jìn)而降低黑素瘤的死亡率。

5-甲基胞嘧啶(m5C)RNA甲基化修飾是RNA轉(zhuǎn)錄后的一種修飾，廣泛存在于tRNA、rRNA和mRNA[6]。其甲基化修飾發(fā)生在胞嘧啶的第5位碳原子，修飾后的RNA序列未發(fā)生改變，但基因的表達(dá)發(fā)生了可遺傳的改變。RNA的m5C甲基化由系列甲基化酶催化完成。其中，太陽結(jié)構(gòu)域家族蛋白酶2(NOP2/Sun RNA methyltransferase 2, Nsun2)是mRNA發(fā)生m5C修飾的關(guān)鍵酶。mRNA的m5C修飾通過提高mRNA穩(wěn)定性和出核運輸，增強蛋白質(zhì)翻譯等方式參與了細(xì)胞增殖[7-9]、細(xì)胞分化[10]和細(xì)胞衰老[11]等過程，而且與人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[12]。據(jù)統(tǒng)計，NSUN2在乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌和食管鱗狀細(xì)胞癌等惡性腫瘤中均表達(dá)上調(diào)，已成為部分腫瘤發(fā)生發(fā)展和預(yù)后的候選標(biāo)記[13-14]。

NSUN2在黑素瘤的發(fā)生和發(fā)展中作用機制尚不明確。本研究以小鼠黑素瘤B16細(xì)胞為材料，利用慢病毒載體穩(wěn)定高效干擾B16細(xì)胞的Nsun2基因；通過細(xì)胞增殖檢測和轉(zhuǎn)錄物組測序技術(shù)分析干擾Nsun2對B16細(xì)胞增殖的影響和關(guān)鍵差異表達(dá)基因及其相關(guān)信號通路，為解析黑素瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 材料

小鼠黑素瘤B16細(xì)胞、小鼠黑素前體細(xì)胞(mouse melanin precursor cells，MMPCs)[15]、HEK293 T細(xì)胞購自賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司；慢病毒干擾載體pLKO.1-TRC-Puro、包裝輔助載體psPAX2、pMD2.G由本實驗室保存。內(nèi)切酶EcoRI、AgeI和T4DNA連接酶購自NEB公司；嘌呤霉素購自Invivogen公司；脂質(zhì)體2000(Lipofectamine 2000)購自Invitrogen公司；EdU試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司；細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI1640、胎牛血清FBS購自賽默飛世爾科技公司(Thermo Fisher Scientific)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量檢測試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司(Takara Bio)。NSUN2、CDK1和CDK2兔多克隆抗體、HRP標(biāo)記的GAPDH鼠單克隆抗體和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司(Proteintech)，GADD45A兔多克隆抗體購自Abcam公司。

1. 2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠黑素瘤B16細(xì)胞和黑素前體細(xì)胞MMPCs置于含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的1640培養(yǎng)基，5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 干擾載體構(gòu)建 參考NCBI 公布的小鼠Nsun2基因mRNA序列(GenBank：NM_145354.5)，設(shè)計2個靶點序列和1個無關(guān)序列，結(jié)合骨架載體pLKO.1-TRC-Puro特征，設(shè)計并合成含目標(biāo)序列的寡聚核苷酸引物(Table 1)。引物對經(jīng)過直接退火合成含黏性末端的靶序列片段，克隆至骨架載體的AgeI和EcoRI酶切位點之間，測序鑒定后獲得干擾載體2個，無關(guān)序列對照載體1個。

Table 1 DNA oligo sequence

1.2.3 Nsun2干擾細(xì)胞株的建立 利用脂質(zhì)體2000將干擾載體、輔助包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2G共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h和72 h分別收取病毒上清液，離心后分裝，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。用制備的病毒液感染B16細(xì)胞，加入Polybrene(2 μg/mL)增強感染效率。感染24 h后更換含2 μg/mL嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基，連續(xù)篩選2周，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。實驗組細(xì)胞命名為Nsun2-shRNA1和Nsun2-shRNA2，對照組細(xì)胞命名為shRNA-NC。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測Nsun2表達(dá) 利用RNAisoPlus法分別提取干擾組和對照組B16細(xì)胞總RNA，按照Prime Script(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄試劑盒，合成cDNA第一鏈。以cDNA為模板，利用實時熒光定量PCR系統(tǒng)(StepOne Plus，Applied Biosystems)檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的Nsun2表達(dá)水平。qPCR擴增體系如下：SYBR Premix ExTaq 10 μL，上下游各1.6 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 4.8 μL，總體積20 μL。反應(yīng)程序95 ℃，10 min；95 ℃，15 s，60 ℃，15 s，40個循環(huán)。每個反應(yīng)設(shè)置3個重復(fù)，以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt方法計算目標(biāo)基因mRNA相對表達(dá)量。

1.2.5 Western 印跡檢測目標(biāo)蛋白質(zhì) 收集待測細(xì)胞，加入RIPA裂解液，細(xì)胞裂解液經(jīng)處理后進(jìn)行SDS-PAGE，再轉(zhuǎn)移凝膠中的蛋白質(zhì)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉。以抗NSUN2、CDK1和CDK2兔多克隆抗體(Proteintech)，以及抗GADD45A兔多克隆抗體(Abcam)為一抗。加入檢測目標(biāo)蛋白質(zhì)的一抗(1∶500稀釋)和HRP標(biāo)記的GAPDH鼠單克隆抗體(Proteintech，1∶1 000稀釋)，37 ℃孵育2 h后清洗膜3次。檢測目標(biāo)蛋白質(zhì)的膜與HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(Proteintech，1∶1 000稀釋)室溫孵育，2 h后清洗膜，加入顯色液，化學(xué)曝光儀檢查，記錄結(jié)果。利用灰度分析軟件，量化信號強度，以GAPDH為內(nèi)參，分析目標(biāo)蛋白質(zhì)相對表達(dá)量。

1.2.6 EdU摻入實驗檢測細(xì)胞增殖 參考EdU試劑盒操作說明，待細(xì)胞密度為70% ～ 80%時，加入EdU工作液(工作濃度10 μmol/L)，培養(yǎng)2 h棄培養(yǎng)液。4%多聚甲醛室溫固定15 min，洗滌3次，通透15 min，加入Click反應(yīng)液避光孵育30 min，吸去Click反應(yīng)液，于倒置熒光顯微鏡觀察。隨機選擇10個非重疊視野，用ImageJ軟件分析統(tǒng)計藍(lán)色熒光和紅色熒光細(xì)胞數(shù)量，以同一視野下紅色熒光細(xì)胞數(shù)與藍(lán)色熒光細(xì)胞數(shù)的比值計算EdU陽性細(xì)胞率。

1.2.7 CCK-8檢測細(xì)胞增殖 取100 μL 細(xì)胞懸液(約10 000個細(xì)胞)接種于96孔板。分別于接種后24 h，48 h和72 h向培養(yǎng)細(xì)胞中加入WST-8浴液，孵育2 h。再用酶標(biāo)儀測定450 nm吸光度(A450)，每組5個重復(fù)。

1.2.8 細(xì)胞克隆形成實驗 6孔板接種500個細(xì)胞/孔，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)2周。待細(xì)胞克隆生長到適當(dāng)大小，棄培養(yǎng)基，PBS清洗2次，70%乙醇固定后加結(jié)晶紫處理15 min，棄染液，每孔加2 mL PBS洗滌3～5次，室溫干燥。倒置顯微鏡下計數(shù)大于50個細(xì)胞的克隆數(shù)?？寺⌒纬陕?(細(xì)胞克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.9 RNA-seq測序及差異表達(dá)基因的富集分析 收集6 cm培養(yǎng)皿中對數(shù)生長期的Nsun2干擾組和對照組B16細(xì)胞。PBS清洗，加入1 mL Trizol裂解3 min，細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，液氮速凍后置于干冰，寄送北京華大基因有限公司。從細(xì)胞裂解液中提取RNA并建庫，進(jìn)行RNA-seq測序。其中，干擾組與對照組各設(shè)置3個重復(fù)。測序結(jié)果上傳至華大基因多組學(xué)系統(tǒng)網(wǎng)站(https://biosys.bgi.com/)，進(jìn)行在線分析。對測序數(shù)據(jù)總體質(zhì)量分析合格的基礎(chǔ)上，設(shè)置︱log2(fold change)︱≥1，Q-值≤0.05條件篩選差異顯著基因，應(yīng)用華大基因在線網(wǎng)站進(jìn)行差異基因的GO和KEGG富集分析，尋找具有統(tǒng)計學(xué)意義的注釋條目。

1.2.10 差異表達(dá)基因的驗證 選取差異表達(dá)上調(diào)基因10個和下調(diào)的基因6個，以小鼠β-肌動蛋白作為內(nèi)參基因，設(shè)計并合成定量PCR引物(Table 2)。參考1.2.4進(jìn)行熒光實時定量PCR反應(yīng)，2-ΔΔCt方法分析mRNA相對表達(dá)量。

Table 2 RT-PCR primers

1.2.11 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示統(tǒng)計分析結(jié)果，采用t檢驗比較各組數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)差異，差異顯著(P<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 NSUN2在B16細(xì)胞中蛋白質(zhì)水平表達(dá)增高

為探究NSUN2在小鼠黑素瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平，以黑素前體細(xì)胞MMPCs為對照組，應(yīng)用Western 印跡檢測NSUN2在2種細(xì)胞的表達(dá)水平。量化結(jié)果顯示，NSUN2在B16細(xì)胞中表達(dá)量是MMPCs中的2.5倍(*P<0.05，F(xiàn)ig.1 A, B)，表明NSUN2在黑素瘤B16細(xì)胞水平表達(dá)顯著高于正常黑素前體細(xì)胞。

Fig.1 The expression level of NSUN2 in two types of melanocytes (A) Western blotting detects the expression level of NSUN2 in two types of melanocytes. (B) Quantitative analysis of the expression level of NSUN2 in two types of melanocytes. Data are presented as mean ± SD (n=3). Two group comparisons were done with a two-tailed student’s t test. *P < 0.05 compared to MMPCs

2.2 穩(wěn)定敲低Nsun2和對照細(xì)胞株的建立

通過分子克隆方法構(gòu)建靶向敲低小鼠Nsun2基因的shRNA載體和無關(guān)序列載體，包裝重組慢病毒，再感染B16細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選后獲得病毒感染細(xì)胞株。以感染NC-shRNA的病毒細(xì)胞為對照，實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，shRNA1組和shRNA2組細(xì)胞中Nsun2表達(dá)水平分別降低了47.4%和59.6% (*P<0.05，F(xiàn)ig. 2A)。Western印跡檢測結(jié)果顯示，shRNA干擾后NSUN2蛋白質(zhì)水平表達(dá)下調(diào)至28.6%和19.6%，說明成功敲低B16細(xì)胞的Nsun2基因表達(dá)(*P<0.05，F(xiàn)ig. 2B，C)。mRNA和蛋白質(zhì)檢測結(jié)果均表明，Nsun2-shRNA2組的干擾效果優(yōu)于Nsun2-shRNA1組，故選擇Nsun2-shRNA2干擾組為后續(xù)實驗材料。

Fig.2 Detection of shRNA-mediated Nsun2 knock-down efficiency (A) qPCR detection of Nsun2 mRNA expression level. (B) Western blotting detection of NSUN2 protein expression level. (C) Quantitative analysis of NSUN2 protein expression. Data are presented as mean ± SD (n=3), two group comparisons were done with a two-tailed student’s t test. *P < 0.05 compared to control

Fig. 3 Nsun2 Knockdown inhibits proliferation of B16 cells (A) Interference with Nsun2 and control group B16 cells EdU staining image. (B) EdU positive cell rate quantification diagram. (C) CCK-8 detection of cell proliferation. (D) Interference Nsun2 and control group B16 cell clone formation diagram. (E) Quantitative analysis of clone formation rate. Data are presented as mean ± SD (n=3). Two group comparisons were done with a two-tailed student’s t test. *P < 0.05 compared to control

2.3 敲低Nsun2抑制B16細(xì)胞增殖

為探究敲低Nsun2表達(dá)對B16細(xì)胞增殖能力的影響，采用EdU染色法檢測增殖期細(xì)胞數(shù)量，EdU陽性率越高說明細(xì)胞增殖能力越強。對照組細(xì)胞EdU陽性率為97.6%，敲低組細(xì)胞陽性率為40.5%(*P<0.05)(Fig. 3A,B)，說明穩(wěn)定干擾Nsun2顯著抑制B16細(xì)胞S期DNA合成能力。Nsun2基因敲低后，B16細(xì)胞在48 h和72 h的增殖能力顯著低于對照組(Fig. 3C)。細(xì)胞克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定干擾Nsun2的B16細(xì)胞克隆形成率僅12.5%，顯著低于對照組36.3%的克隆形成率(Fig. 3D,E)，說明穩(wěn)定干擾Nsun2抑制B16細(xì)胞增殖和克隆形成能力。

2.4 RNA-seq測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

分別選擇NC-shRNA對照組和Nsun2-shRNA實驗組B16細(xì)胞進(jìn)行RNA-Seq測序，每組3個生物學(xué)重復(fù)。各組的 Clean reads占比均大于98%，所有樣品Q20均大于98%，Q30均大于94%(結(jié)果見Table 3)。綜上所述，Nsun2敲低組和對照組細(xì)胞樣品測序生成的數(shù)據(jù)均符合轉(zhuǎn)錄物組分析相關(guān)要求。

Table 3 Reads quality statistics after filtering

Fig.4 The statistical analysis of DEGs (A) Co-expressed genes and differential gene display between SiNsun2 and control. (B) The number of genes up-regulated and down-regulated in co-expressed genes. (C) Volcano map of DEGs with fold change ≥2. (D) The number of DEGs with fold change ≥2 . (E) Heat map of DEGs expression level in different samples

2.5 差異表達(dá)基因分析

通過比較敲低組和對照組細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物組測序數(shù)據(jù)，兩組共表達(dá)基因15 689個(Fig. 4A)。其中，2 080個基因上調(diào)，1 876個基因下調(diào)，11 733個基因無顯著變化 (P<0.05，n=3)(Fig. 4B)。以︱log2(fold change)︱≥1，Q-值≤0.05為篩選條件，共篩選出1 062個差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)，其中678個上調(diào)基因，384個下調(diào)基因(Fig. 4C, D)。通過聚類分析，進(jìn)一步說明差異表達(dá)基因在組內(nèi)樣品間一致性較好(Fig. 4E)。由于NSUN2的主要功能是mRNA甲基化修飾，提高mRNA穩(wěn)定性，增強翻譯效率。干擾Nsun2后，其靶基因mRNA甲基化修飾減少；或調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄因子mRNA修飾下調(diào)，從而直接或間接影響DEGs表達(dá)。

Fig.5 GO enrichment analysis of differentially expressed genes (A) Secondary GO terms enriched for differentially expressed genes. (B) Top 20 GO terms enriched for differentially expressed genes

2.6 差異表達(dá)基因GO功能注釋分析

進(jìn)一步對篩選的1 062個DEGs進(jìn)行GO富集分析，生物過程(biological process)、分子功能(molecular function)和細(xì)胞組分(cellular component)分別富集了28、12和17個二級GO條目(Fig. 5A)。3個部分富集的前20個GO條目中，生物過程的前3個條目包括細(xì)胞周期(cell cycle)、細(xì)胞分裂(cell division)、DNA復(fù)制(DNA replication)；分子功能主要包括蛋白質(zhì)結(jié)合(protein binding)、核苷酸結(jié)合(nucleotide binding)、微管結(jié)合(microtubule binding)等條目；細(xì)胞組分主要包括染色體著絲粒區(qū)(chromosome, centromeric region)、動粒(kinetochore)、濃縮染色體動粒(condensed chromosome kinetochore)等條目(Fig. 5B)。差異基因富集的GO條目說明，Nsun2主要通過細(xì)胞周期、大分子結(jié)合與染色體結(jié)構(gòu)等方面調(diào)控黑素瘤細(xì)胞增殖。

2.7 差異表達(dá)基因KEGG 通路富集分析

對差異基因進(jìn)行KEGG 通路富集分析。分別注釋到細(xì)胞過程(Cellular Processes)、遺傳信息處理(Genetic Information Processing)、人類疾病(Human Diseases)、環(huán)境信息處理(Environmental Information Processing)、新陳代謝(Metabolism)、有機系統(tǒng)(Organismal Systems)6個分支(Fig. 6A)。其中，差異基因在這3個一級通路中富集較多。在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)、癌癥(cancers)、免疫系統(tǒng)(immune system)、細(xì)胞生長和死亡(cell growth and death)等二級通路中富集的差異基因較多。

前20條顯著富集的KEGG通路主要集中在細(xì)胞周期(cell cycle)、DNA復(fù)制(DNA replication)、ECM受體互作(ECM-receptor interaction)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、p53信號通路(p53 signaling pathwayp)、細(xì)胞衰老(cellular senescence)等(Fig. 6B)。其中，參與細(xì)胞周期的DEGs數(shù)目高達(dá)34個，與細(xì)胞衰老相關(guān)的DEGs 22個。敲低Nsun2的B16細(xì)胞中，促進(jìn)細(xì)胞增殖的基因例如Cdk2，Cdc25c，Pcna和Mcm家族等基因表達(dá)下調(diào)，而阻滯細(xì)胞增殖基因Gadd45g，Gadd45b和Gadd45a表達(dá)上調(diào)(Fig. 6 C，D)。上述基因表達(dá)差異詮釋了敲低Nsun2顯著降低B16細(xì)胞DNA合成和增殖能力。

Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed genes (A) Prediction of differentially expressed genes KEGG pathway. (B) The top 20 KEGG pathways with significant enrichment of differentially expressed genes. (C) Clustering Heat Map of Differential Genes in Cell Cycle Pathway. (D) Clustering Heat Map of Differential Genes in DNA Replication Pathway

2.8 DEGs的表達(dá)驗證

為驗證RNA-Seq結(jié)果的準(zhǔn)確性，從篩選獲得的DEGs中隨機選擇表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的基因進(jìn)行RT-qPCR驗證。與對照相比，Nsun2在實驗組細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)，同時10個上調(diào)基因和6個下調(diào)基因的表達(dá)情況與RNA-Seq結(jié)果一致(Fig. 7A,B)。進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，敲低Nsun2顯著下調(diào)周期蛋白依賴性激酶(Cyclin-dependent kinases, CDK)CDK1和CDK2表達(dá)，而上調(diào)生長阻滯和DNA損傷誘導(dǎo)蛋白GADD45A表達(dá)(Fig. 7C，D)。上述結(jié)果驗證了轉(zhuǎn)錄物組篩選的關(guān)鍵DEGs表達(dá)量與實際表達(dá)水平一致。

Fig.7 Verification of differentially expressed genes via RT-qPCR and Western blot (A) Up-regulated gene expression quantification results. (B) Down-regulated gene expression quantification results. (C) The level of CDK1,CDK2,GADD45A protein was detected by Western blotting. (D) Quantitative analysis of Western blotting. GAPDH was used to normalize the variability in template loading. Data are presented as mean ± SD (n=3), and the statistical difference between two group were compared with a two-tailed student’s t test. *P < 0.05 compared to control

3 討論

RNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾，最近關(guān)于RNA甲基化的研究主要集中在mRNA的m6A修飾方面，但對m5C修飾知之甚少。太陽結(jié)構(gòu)域家族蛋白成員2(Nsun2)，是典型的RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶，在靶基因成熟mRNA的編碼區(qū)以及非編碼區(qū)進(jìn)行5-甲基胞嘧啶(m5C)化學(xué)修飾，提高靶基因的mRNA穩(wěn)定性和翻譯效率 。已有的研究表明，RNA m5C修飾參與腫瘤細(xì)胞的自我更新與分化，調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖與侵襲，例如膽囊癌和乳腺癌等[16]。但是，Nsun2在惡性黑素瘤細(xì)胞內(nèi)的作用，目前為止尚不明確。本研究所構(gòu)建的靶向Nsun2重組慢病毒RNA干擾載體，可有效降低Nsun2 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平，且EdU染色結(jié)果表明，穩(wěn)定干擾Nsun2顯著抑制B16細(xì)胞DNA合成，從而抑制黑素瘤細(xì)胞增殖。

本研究利用轉(zhuǎn)錄物組測序探索干擾Nsun2 的B16細(xì)胞全基因組表達(dá)水平，對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG 通路富集分析。DEGs主要富集于細(xì)胞周期、DNA復(fù)制和細(xì)胞衰老等信號通路。RNA-seq和qPCR驗證發(fā)現(xiàn)，調(diào)控細(xì)胞周期和DNA合成的相關(guān)基因Cdk2、Cdc25D、Ccna2均顯著下調(diào)，而阻滯細(xì)胞增殖的Gadd45家族基因表達(dá)上調(diào)，說明NSUN2可能通過RNA甲基化影響DNA復(fù)制，調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖。

細(xì)胞周期是一個進(jìn)化保守的過程，對細(xì)胞生長至關(guān)重要。細(xì)胞周期功能障礙是人類癌癥發(fā)生的標(biāo)志之一[17]。靶向細(xì)胞周期相關(guān)蛋白質(zhì)是治療癌癥的主要臨床手段。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶是調(diào)控真核細(xì)胞分裂周期的主要蛋白激酶[18]。Xing等[19]研究表明，人骨肉瘤細(xì)胞(U3OS)中，NSun2以細(xì)胞周期依賴性方式調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)表達(dá)。敲低NSun2降低了CDK1蛋白水平，抑制細(xì)胞增殖，而過表達(dá)Nsun2升高CDK1蛋白水平。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，NSun2甲基化CDK1 mRNA增強CDK1翻譯效率，促進(jìn)細(xì)胞增殖。Tang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，敲低NSUN2的成纖維細(xì)胞中p27蛋白水平升高，CDK1表達(dá)降低，抑制了細(xì)胞增殖，加速細(xì)胞復(fù)制性衰老；當(dāng)細(xì)胞過表達(dá)NSUN2，p27蛋白水平降低，CDK1表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，延緩復(fù)制性衰老。本研究亦發(fā)現(xiàn)，干擾Nsun2基因抑制黑素瘤細(xì)胞增殖，轉(zhuǎn)錄物組篩選出差異表達(dá)基因中CDK1的mRNA和蛋白質(zhì)水平也顯著降低。由此本文推測，NSUN2主要通過調(diào)控CDK1表達(dá)水平，影響黑素瘤細(xì)胞增殖，是黑素瘤治療的潛在靶點。

細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)主要負(fù)責(zé)細(xì)胞周期G1期向S期的轉(zhuǎn)變，參與細(xì)胞增殖調(diào)控[21]。研究表明，多種腫瘤細(xì)胞的CDK2過度表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞周期的異常，促進(jìn)了癌癥的發(fā)生和發(fā)展[22]。Tang等[23]研究發(fā)現(xiàn)，沉默CDK2促進(jìn)腫瘤抑制因子SIRT5的表達(dá)，CDK2是腫瘤治療的潛在靶點。本研究表明，Nsun2敲低后黑素瘤細(xì)胞DNA合成減少，DEGs主要富集于細(xì)胞周期和DNA復(fù)制等方面，該現(xiàn)象與干擾Nsun2細(xì)胞中Cdk2表達(dá)下調(diào)相關(guān)，說明NSUN2可能通過調(diào)控CDK2表達(dá)水平影響黑素瘤細(xì)胞增殖。

嘌呤和嘧啶代謝與DNA復(fù)制過程中原材料dNTP供應(yīng)相關(guān)。黃奕芝等[24]通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析和蛋白質(zhì)免疫印跡發(fā)現(xiàn)，NSUN2在肝癌組織中高表達(dá)，敲低NSUN2后肝癌細(xì)胞增殖能力降低，差異表達(dá)基因主要富集于嘌呤和嘧啶代謝通路。該結(jié)果與本研究發(fā)現(xiàn)的干擾Nsun2后降低黑素瘤細(xì)胞DNA合成能力相似，說明NSUN2可能通過影響嘌呤和嘧啶的合成來調(diào)控癌細(xì)胞DNA復(fù)制能力。

生長阻滯和DNA損傷誘導(dǎo)蛋白GADD45主要參與細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡。多項研究表明，黑素瘤細(xì)胞中，GADD45高表達(dá)能有效阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但調(diào)控Gadd45表達(dá)的分子機制未知[25-26]。本文研究發(fā)現(xiàn)，Nsun2干擾的黑素瘤細(xì)胞中Gadd45基因表達(dá)明顯上調(diào)，說明NSUN2是調(diào)控黑素瘤細(xì)胞Gadd45基因表達(dá)的關(guān)鍵因子之一，補充了Gadd45表達(dá)調(diào)控分子機制。

本研究對干擾Nsun2抑制小鼠黑素瘤B16細(xì)胞增殖相關(guān)信號通路進(jìn)行了分析，并驗證細(xì)胞周期相關(guān)差異表達(dá)基因，揭示了NSUN2在黑素瘤細(xì)胞中生物學(xué)功能，為黑素瘤治療及靶向藥物開發(fā)提供參考。