PM2.5通過激活NLRP3/Caspse-1通路誘導(dǎo)大鼠子宮炎癥反應(yīng)

張豐泉， 趙 杉， 董恩恒*

(1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院 公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，河南 新鄉(xiāng) 453000； 2)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453000)

空氣污染的健康危害已成為全球范圍內(nèi)一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問題，是造成人類過早死亡的第4大危險(xiǎn)因素，其對(duì)全球死亡率和發(fā)病率的影響超過其他已知環(huán)境健康危險(xiǎn)因素的總和[1]。中國環(huán)境生態(tài)公報(bào)顯示，截止2020年，我國337個(gè)地級(jí)以上城市中有43.3%的城市空氣質(zhì)量超標(biāo)，并且以細(xì)顆粒物(fine particulate matter，PM2.5)和可吸入顆粒物(particulate matter，PM)為首要污染物的天數(shù)分別為51.0%和11.7%[2]。由此可見，顆粒物依然是我國空氣污染的首要污染物。顆粒物對(duì)人體的危害不僅因其成分復(fù)雜(包含重金屬、細(xì)菌、病毒以及多環(huán)芳烴和脂多糖等)，而且因其粒徑較小可直接進(jìn)入肺內(nèi)并滯留肺泡，導(dǎo)致肺內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，對(duì)肺造成嚴(yán)重的損傷[3]，而粒徑更小的PM2.5可以透過肺泡進(jìn)入血液循環(huán)中，對(duì)其他組織和器官造成損傷。

通常人們比較關(guān)注顆粒物對(duì)呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等的損傷作用，而對(duì)其生殖系統(tǒng)影響的關(guān)注和研究較少。全球多地區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，顆粒物對(duì)生殖系統(tǒng)有損傷作用，影響胎兒的出生結(jié)局。一項(xiàng)對(duì)非洲42 952名孕婦的調(diào)查結(jié)果顯示，PM2.5使孕婦流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高，當(dāng)孕婦暴露PM2.5每增加10 μg/m3時(shí)，其流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)升高1.112倍[4]。Strickland等對(duì)亞特蘭大地區(qū)2002年1月到2006年2月間27 3711孕婦的調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PM2.5、PM10、CO、NO2等空氣污染物均能降低新生兒的出生體重[5]。波蘭的一項(xiàng)研究顯示，當(dāng)孕期接觸PM2.5濃度>25 μg/m3時(shí)，低出生體重新生兒的數(shù)量增加4倍[6]。另有研究顯示，顆粒物與精子數(shù)量、濃度和活性呈負(fù)相關(guān)，能明顯降低精子質(zhì)量[7]。目前的流行病學(xué)調(diào)查已證實(shí)，顆粒物能夠損傷生殖系統(tǒng)，但關(guān)于顆粒物生殖毒性作用機(jī)制的研究較少，其作用機(jī)制仍不清楚。

顆粒物暴露可以增加機(jī)體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)等氧自由基，同時(shí)減少內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)的生成，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激，進(jìn)而激活核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)等促炎癥反應(yīng)細(xì)胞信號(hào)通路，使機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)[8]。Bové等[9]利用飛秒脈沖的方法證實(shí)，顆粒物通過血液循環(huán)到達(dá)子宮并透過胎盤屏障后蓄積于胎盤，這一研究結(jié)果為顆粒物生殖系統(tǒng)損傷作用提供了確切的證據(jù)。我們的前期研究[10]已證實(shí)，當(dāng)雌鼠暴露于PM2.5，子宮中氧化性物質(zhì)增加，而抗氧化物質(zhì)減少，子宮發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而損傷子宮組織。通常情況下，ROS以及氧化應(yīng)激能夠誘導(dǎo)組織發(fā)生炎癥反應(yīng)[11]，但目前尚無顆粒物誘導(dǎo)雌性生殖系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的相關(guān)報(bào)道。本文將通過免疫熒光的方法檢測(cè)PM2.5暴露后，大鼠子宮內(nèi)的炎癥反應(yīng)情況，并探討其作用機(jī)制，為PM2.5生殖毒性的預(yù)防和治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

蛋白質(zhì)垂直電泳系統(tǒng)(Mini-PROTEAN Tetra，Bio-Rad)，多功能成像分析系統(tǒng)(FluorChem R，ProteinSimple)，熒光顯微鏡(M205 FA，Leica)，NLRP3抑制劑MCC950購于上海Selleck公司，TGF- β1和IL-1β Elisa檢測(cè)試劑盒購于酶聯(lián)生物，Immunofluorescence Application Solutions Kit和ProLong?Gold Antifade Reagent with DAPI試劑盒(CST，USA)，CD45和CD11b(Abcam, UK)，山羊抗小鼠Alexa Fluor 488和山羊抗兔Alexa Fluor 594二抗(Invitrogen，USA)，白介素1β(interleukin 1β, IL-1β)一抗購于Affinity Biosciences，核苷酸結(jié)合低聚體結(jié)構(gòu)域樣受體3 (nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor containing pyrin domain 3, NLRP3)、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白質(zhì)(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)、胱天蛋白酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1, caspase-1)和pro-caspase-1一抗購于Abcam。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

清潔級(jí)雌性SD大鼠(8周齡，180～200 g)購于北京維通利華【許可證：SCXK(京)2012-0001】。將40只雌鼠隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組(Con)、低劑量暴露組(1.5 mg/kg bw PM2.5，L-Exp)、高劑量暴露組(6 mg/kg bw PM2.5，H-Exp)和抑制劑組(10 mg/kg bw MCC950+6 mg/kg bw PM2.5，MCC950)[12]每組10只。雌鼠飼養(yǎng)于IVC動(dòng)物房，22 ℃～24 ℃，12 h/12 h晝夜交替，自由飲食。

1.3 PM2.5染毒

于晴朗和無風(fēng)天氣時(shí)收集PM2.5，并用生理鹽水配置成3 mg/mL低濃度和12 mg/mL高濃度懸液。將PM2.5液復(fù)溫重懸，采用氣管滴注法暴露PM2.5，用棉線繩掛住麻醉后的大鼠上切牙，使大鼠保持垂直懸掛，用鑷子將大鼠舌頭快速拉出，吸取50 μL/100 g bw PM2.5懸液注入大鼠舌根部，迅速捏緊大鼠鼻腔，迫使大鼠經(jīng)口腔將PM2.5液吸入肺內(nèi)，當(dāng)聽到肺部濕羅音表示成功吸入PM2.5。抑制劑組雌鼠在滴注PM2.5后給予腹腔注射MCC950。連續(xù)暴露30 d。對(duì)照組采用同樣的方法吸入50 μL/100 g bw的生理鹽水。

1.4 子宮臟器系數(shù)及相關(guān)組織細(xì)胞和腺體指標(biāo)的測(cè)定

大鼠脫臼處死后，取出子宮稱重，計(jì)算各組大鼠子宮的臟器系數(shù)。取新鮮子宮組織生理鹽水漂洗，常規(guī)方法制成石蠟切片，鏡下觀察并計(jì)算子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞厚度，內(nèi)膜腺上皮高度和內(nèi)膜腺體數(shù)量。子宮內(nèi)膜腺體計(jì)數(shù)：200×視野下，計(jì)數(shù)每個(gè)視野下腺體數(shù)量，每張切片隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野。子宮內(nèi)膜腺上皮高度測(cè)定：400×視野下，相互垂直4點(diǎn)測(cè)腺上皮的高度，每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)算平均值。子宮內(nèi)膜上皮厚度：Image Pro-plus軟件測(cè)定5處最厚處內(nèi)膜上皮的厚度，計(jì)算平均值。每組計(jì)數(shù)6張樣本切片。

1.5 子宮組織和血清中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1和白介素-1β檢測(cè)

采用ELISA法檢測(cè)大鼠子宮組織和血清中TGF-β1和IL-1β的含量。新鮮子宮組織于冰浴勻漿，4 ℃離心1 000 g×5 min，取上清待測(cè)。心臟采血法收集各組大鼠的血液，1 000 g×10 min離心，收集血清，-80 ℃保存待測(cè)。按照試劑盒說明分別測(cè)定組織和血清TGF- β1和IL-1β含量。

1.6 組織免疫熒光染色

為觀察子宮組織中炎癥反應(yīng)情況，本文采用免疫熒光雙染色法檢測(cè)白細(xì)胞共有抗原CD45和巨噬細(xì)胞特異抗原CD11b，按照Immunofluorescence Application Solutions Kit試劑盒的說明進(jìn)行操作。4%多聚甲醛于冰浴固定子宮組織30 min，PBS漂洗1次/5 min，30%蔗糖4 ℃平衡2 h，OCT包埋，切成5 μm切片。將切片放入封閉緩沖液中室溫下封閉1 h，用免疫熒光抗體稀釋液配置的一抗(1∶60小鼠抗大鼠CD45和1∶300兔抗大鼠CD11b)4 ℃過夜孵育，1×洗滌緩沖液漂洗3次/5 min，免疫熒光抗體稀釋液配置的二抗(1∶2 000山羊抗小鼠Alexa Fluor 488和1∶20 000山羊抗兔Alexa Fluor 594)室溫下濕盒中孵育1 h，1×洗滌緩沖液漂洗3次/5 min，使用Gold Antifade Reagent with DAPI封片，4 ℃避光保存或在熒光顯微鏡下觀察。相同的方法制作陽性對(duì)照和IgG陰性對(duì)照。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)不重疊的視野，計(jì)數(shù)子宮內(nèi)膜上皮層、基質(zhì)細(xì)胞層、內(nèi)膜腺上皮中CD45+白細(xì)胞和CD11b+巨噬細(xì)胞，每組計(jì)數(shù)6個(gè)樣本。

1.7 炎性小體相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)檢測(cè)

用RIPA冰浴提取子宮組織中的總蛋白質(zhì)，BCA法檢測(cè)樣品蛋白質(zhì)含量。取25 μg蛋白質(zhì)樣品，經(jīng)SDS-PAGE，將目的蛋白質(zhì)分別轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，含5% BSA封閉液室溫封閉1 h，NLRP3一抗(1∶1 000)、ASC一抗(1∶800) 、胱天蛋白酶1一抗(1∶1 000)、IL-1β一抗(1∶600)、β-肌動(dòng)蛋白一抗(1∶3 000)，4 ℃孵育過夜，用含0.1% Tween-20的TBST洗膜，加入二抗(1∶5 000)室溫孵育1.5 h，ECL發(fā)光，多功能成像系統(tǒng)成像并分析。每組檢測(cè)6個(gè)樣本。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PM2.5改變子宮內(nèi)膜組織結(jié)構(gòu)

PM2.5對(duì)子宮臟器系數(shù)、內(nèi)膜上皮厚度、腺上皮細(xì)胞高度和內(nèi)膜腺體數(shù)量的影響見Table 1和Fig.1。與Con組相比，PM2.5暴露30 d，大鼠子宮臟器系數(shù)均有所升高，特別是H-Exp組子宮臟器系數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。H-Exp組大鼠子宮內(nèi)膜上皮厚度也明顯比對(duì)照組厚(P<0.05)。

雖然PM2.5暴露對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜腺體的數(shù)量影響不大，但H-Exp組的大鼠子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞高度明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

當(dāng)大鼠給予抑制劑MCC950后，PM2.5對(duì)大鼠子宮臟器系數(shù)、內(nèi)膜上皮厚度和內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞高度的影響減少，MCC950組大鼠的子宮臟器系數(shù)、內(nèi)膜上皮厚度和內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞高度均接近正常對(duì)照組大鼠，趨于正常(Table 1)。

Table 1 Effects of PM2.5 on the thickness of uterine-body weight ratio, endometrial epithelium, number of glands and height of gland epithelium in different groups (mean ± SD, n=6)

Fig.1 Representative pathological images of uterine tissue Samples were stained with H&E. Black arrows indicate endometrial epithelium and green arrows indicate gland epithelium. Endometrial epithelium, number of glands and height of gland epithelium were examined. Bar, 50 μm

2.2 PM2.5增加子宮組織中炎性細(xì)胞數(shù)量

為觀察炎性細(xì)胞在子宮組織內(nèi)的聚集情況，采用免疫熒光雙標(biāo)記的方法，觀察每個(gè)實(shí)驗(yàn)組白細(xì)胞共表達(dá)抗原CD45和巨噬細(xì)胞特異抗原CD11b的陽性表達(dá)情況。熒光顯微鏡下CD45白細(xì)胞顯示為綠色熒光，CD11b巨噬細(xì)胞顯示為紅色熒光(Fig.2)。與Con組相比，PM2.5暴露組CD45白細(xì)胞和CD11b巨噬細(xì)胞均明顯增加(P<0.05)，L-Exp組和H-Exp組CD45白細(xì)胞分別是對(duì)照組的1.85倍和3.14倍，CD11b巨噬細(xì)胞分別增加1.74倍和2.73倍。當(dāng)雌鼠給予抑制劑MCC950后，與L-Exp和H-Exp組相比，子宮CD45白細(xì)胞明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MCC950組子宮CD11b巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯低于H-Exp(P<0.05)，MCC950組子宮CD11b巨噬細(xì)胞數(shù)量與L-Exp組相比，雖然差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但相比L-Exp組依然降低較多(Fig.3A)。

CD45白細(xì)胞和CD11巨噬細(xì)胞在子宮內(nèi)的分布存在差異。CD45白細(xì)胞主要聚集在子宮內(nèi)膜上皮層(Fig.3B)，而CD11b巨噬細(xì)胞主要聚集在子宮基底層(Fig.3C)。

2.3 PM2.5促進(jìn)子宮組織和血清中IL-1β和TGF-β1的釋放

與Con組相比，L-Exp組和H-Exp組子宮組織中IL-1β和TGF-β1含量明顯升高(P<0.05)；且子宮組織中IL-1β含量與PM2.5暴露劑量存在劑量效應(yīng)關(guān)系(r=0.904，P=0.000)。與PM2.5暴露組相比，MCC950組大鼠子宮組織中IL-1β和TGF-β1含量均有所降低。特別是與H-Exp組相比，MCC950組大鼠子宮中IL-1β和TGF-β1含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(Table 2)。

PM2.5暴露后，各組大鼠血清中IL-1β和TGF-β1含量見Table 2。PM2.5促進(jìn)血清中IL-1β和TGF-β1的釋放。L-Exp和H-Exp組大鼠血清中IL-1β和TGF-β1含量均明顯高于Con組(P<0.05)。

Fig.2 Representative images of inflammatory cells in uterine The inflammatory cells were stained with immunofluorescence double staining and observed using fluorescence microscope. CD45 leukocyte appeared green, CD11b macrophage appeared red and nucleus appeared blue under fluorescence microscope. Epi, Epithelial cells. St, Stroma cells. Eg, Endometrial gland. Bar, 50 μm

Fig.3 The number and distribution of CD45 and CD11b in uterine (A) Compared to control group, the fold change of CD45 and CD11b in L-Exp, H-Exp and MCC950 groups. (B) The distribution of CD45 in uterine. (C) The distribution of CD11b in uterine. Epi, Epithelial cells. St, Stroma cells. Eg, Endometrial gland. Values were expressed as mean ± SD of six determinations from separate experiments.* P < 0.05,** P < 0.001

Table 2 Effects of PM2.5 on the levels of IL-1β and TGF- β1 in uterine tissue and serum (mean ± SD, n=6)

2.4 PM2.5 上調(diào)NLRP3/Caspase-1通路中關(guān)鍵蛋白質(zhì)的表達(dá)量

Fig.4 The expression levels of key proteins of NLRP3/Caspase-1 path were increased after the female rats were exposed to different doses of PM2.5 with or without MCC950 for 30 days The expression levels of key proteins were tested by Western blot. (A) The representative images of Western blot analysis for NLRP3, ASC, pro-ILβ, pro-Caspase-1 and Caspase-1. (B) The relative expression of NLRP3. (C) The relative expression of ASC. (D) The relative expression of pro-Caspase-1. (E) The relative expression of Caspase-1. (F) The relative expression of pro-ILβ. Values were expressed as mean ± SD of six determinations from separate experiments.*P<0.05,**P<0.001

為了驗(yàn)證NLRP3/Caspase-1炎性信號(hào)通路在PM2.5誘導(dǎo)子宮炎癥反應(yīng)中的作用，采用Western印跡法檢測(cè)NLRP3/Caspase-1通路中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)NLRP3、ASC、胱天蛋白酶1和IL-1β在不同劑量PM2.5暴露后的表達(dá)情況，蛋白質(zhì)表達(dá)結(jié)果見Fig.4A。大鼠暴露PM2.530 d，L-Exp組和H-Exp組大鼠子宮中NLRP3、ASC、pro-IL-1β、前體胱天蛋白酶1和胱天蛋白酶1的蛋白質(zhì)表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)(Fig.4B-E)。

與L-Exp組相比，MCC950抑制劑能明顯降低PM2.5暴露所致的NLRP3和ASC蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(結(jié)果見Fig.4B,C)。MCC950同樣能降低胱天蛋白酶1的表達(dá)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與高劑量組相比，MCC950能明顯降低NLRP3/Caspase-1通路中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)NLRP3、ASC、pro-IL-1β、前體胱天蛋白酶1和胱天蛋白酶1蛋白質(zhì)的表達(dá)水平(P<0.05)(Fig.4B-E)。

3 討論

顆粒物作為首要的空氣污染物，對(duì)呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)均有損害。雖然目前顆粒物生殖損傷的研究較少，流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果也存在不一致性，但顆粒物對(duì)生殖系統(tǒng)的損傷作用已日益受到人們關(guān)注。已有研究證實(shí)，空氣中的顆粒物可以通過血液循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)生殖器官，并且可以透過胎盤屏障[9]。我國臺(tái)灣地區(qū)一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，男性精子質(zhì)量與PM2.5暴露濃度呈明顯的負(fù)相關(guān)，當(dāng)PM2.5暴露濃度增加5 μg/m3，精子的畸形率升高1.29%[13]。Bosco等[14]在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，顆粒物具有遺傳毒性，空氣污染(PM2.5、PM10)使精子DNA碎片率升高30%。本文前期的研究結(jié)果[15]顯示，PM2.5能夠改變大鼠子宮內(nèi)膜組織結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡。本文中進(jìn)一步證實(shí)，PM2.5誘發(fā)子宮內(nèi)炎癥反應(yīng)，其可能與NLRP3炎性小體通路的激活有關(guān)。

顆粒物可以造成全身多組織炎癥反應(yīng)，是顆粒物毒性的重要作用機(jī)制之一。短期暴露顆粒物可明顯提升血液中炎性標(biāo)志物TNF-а和凝血標(biāo)志物纖維蛋白原的含量，誘發(fā)心血管系統(tǒng)疾病[16]。PM2.5暴露可下調(diào)支氣管SIRT2的表達(dá)和活性，促使p65的磷酸化和乙?；せ頝F-κB信號(hào)通路，誘發(fā)氣道炎癥和支氣管高反應(yīng)性[17]。PM2.5使角膜中ROS的產(chǎn)生增高，促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和凋亡，致使角膜上皮細(xì)胞衰老死亡[18]。為了檢測(cè)PM2.5是否能夠誘發(fā)子宮內(nèi)的炎癥反應(yīng)，本次研究采用免疫熒光的方法，檢測(cè)子宮組織炎性細(xì)胞CD45白細(xì)胞和CD68巨噬細(xì)胞的數(shù)量和分布。CD45作為白細(xì)胞共有抗原，能夠較好地反應(yīng)炎癥反應(yīng)中白細(xì)胞的浸潤情況。本文結(jié)果與對(duì)照組相比，PM2.5低劑量組和高劑量組大鼠子宮內(nèi)的CD45白細(xì)胞均明顯增多(Fig.3A)。同時(shí)觀察到，CD45白細(xì)胞主要聚集在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞層(Fig.3B)。由此可見，PM2.5可以誘發(fā)子宮發(fā)生炎癥反應(yīng)，并且炎癥主要發(fā)生在子宮內(nèi)膜層。過往的研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞在顆粒物誘導(dǎo)的組織/器官炎癥反應(yīng)中均明顯增加[19]。CD11b可特異性標(biāo)記巨噬細(xì)胞的抗原，本文檢測(cè)子宮組織中CD11b巨噬細(xì)胞的數(shù)量，以確定巨噬細(xì)胞在PM2.5誘導(dǎo)子宮炎癥反應(yīng)中是否同樣增加。結(jié)果顯示，PM2.5暴露組CD11b巨噬細(xì)胞數(shù)量均明顯高于對(duì)照組(Fig.3A)，同時(shí)巨噬細(xì)胞能夠釋放IL-1β和TGF-1β，能夠誘導(dǎo)機(jī)體的炎癥和纖維化。由此可見，巨噬細(xì)胞同樣在PM2.5誘導(dǎo)的子宮炎癥中發(fā)揮作用。另外，本文測(cè)量了PM2.5暴露后子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞厚度和內(nèi)膜腺上皮高度。結(jié)果顯示，PM2.5使子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞厚度和內(nèi)膜腺上皮高度增加。由此推測(cè)，這可能與PM2.5誘導(dǎo)的子宮內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤導(dǎo)致炎性增生有關(guān)。

炎性小體在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[20]，是一種多蛋白質(zhì)復(fù)合物，主要由受體蛋白質(zhì)、銜接蛋白ASC和下游的胱天蛋白酶構(gòu)成。受體蛋白質(zhì)分為NOD樣受體(NLRs)和PYHIN家族。NLRP3是NLRs受體蛋白質(zhì)家族中研究最為深入的一種蛋白質(zhì)。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，NLRP3可以招募銜接蛋白質(zhì)ASC和前體胱天蛋白酶1形成NLRP3炎性小體，激活胱天蛋白酶1，促進(jìn)IL-1β生成，進(jìn)而誘發(fā)炎癥。研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎性小體在顆粒物致肺泡上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[21]。當(dāng)孕期小鼠暴露PM2.5時(shí)，子代小鼠海馬中HMGB1-NLRP3通路被激活，致使子代小鼠海馬發(fā)生炎癥反應(yīng)，損傷小鼠神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致子代小鼠認(rèn)知功能障礙[22]。為了驗(yàn)證PM2.5誘導(dǎo)子宮炎癥是否與NLRP3/Caspase-1炎性信號(hào)通路有關(guān)，本文檢測(cè)了NLRP3/Caspase-1通路中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)NLRP3、ASC、IL-1β和胱天蛋白酶1在不同劑量PM2.5暴露后的蛋白質(zhì)表達(dá)情況。結(jié)果顯示，PM2.5暴露上調(diào)子宮NLRP3、ASC、前體胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶1和pro-IL-1β蛋白質(zhì)的表達(dá)水平(Fig.4)，同時(shí)應(yīng)用NLRP3抑制劑來進(jìn)一步驗(yàn)證NLRP3/Caspase-1信號(hào)通路在PM2.5誘導(dǎo)子宮炎癥反應(yīng)中的作用。結(jié)果顯示，大鼠給予MCC950后，子宮中NLRP3、ASC、前體胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶1和pro-IL-1β蛋白質(zhì)的表達(dá)水平得到抑制，并趨同于對(duì)照大鼠子宮中這些蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。另外，本文還檢測(cè)了NLRP3/Caspase-1信號(hào)通路下游的效應(yīng)蛋白質(zhì)IL-1β。結(jié)果顯示，PM2.5暴露后，子宮內(nèi)IL-1β水平明顯高于對(duì)照組。由本文結(jié)果推測(cè)，PM2.5誘導(dǎo)的子宮炎癥反應(yīng)與NLRP3/Caspase-1炎性信號(hào)通路有關(guān)，抑制該信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)后能明顯降低PM2.5誘導(dǎo)的子宮炎癥反應(yīng)，這一結(jié)果也與本文炎性細(xì)胞免疫熒光結(jié)果相一致。

眾所周知，TGF-β家族是一種具有多功能的信號(hào)分子，參與機(jī)體發(fā)育、炎癥調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤促進(jìn)和抑制、纖維化發(fā)展和治療[23]。已有研究證實(shí)，巨噬細(xì)胞釋放的IL-1β和TGF-1β協(xié)同作用促進(jìn)肺內(nèi)膠原生成和沉積[24]。Cao等[25]研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5誘導(dǎo)的NLRP3炎癥反應(yīng)致肺纖維化與TGF-1β的高表達(dá)有關(guān)。本文大鼠經(jīng)PM2.5暴露后，子宮內(nèi)TGF-1β含量明顯升高，推測(cè)PM2.5可能造成子宮炎癥后的子宮纖維化。在后續(xù)的研究中，我們將延長(zhǎng)大鼠的暴露時(shí)間，從而驗(yàn)證PM2.5是否會(huì)引起子宮纖維化。

總之，通過本次研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5通過激活NLRP3/caspase-1信號(hào)通路誘導(dǎo)子宮炎癥反應(yīng)，為PM2.5生殖毒性的預(yù)防和治療提供了理論基礎(chǔ)。