miR-31改善2型糖尿病小鼠的肝損傷

付 媛， 王宇斐， 何金鳳， 杜若琛， 原一桐， 張玉娟，王春芳*， 張軒萍*

(1)山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，山西 晉中 030619； 2)山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 太原 030001)

糖尿病是指以高血糖和內(nèi)源性胰島素的分泌或作用不足為特征的代謝疾病[1]。2型糖尿病(type 2 diabetes，T2DM)是最常見的一種糖尿病，其特征是因胰島素分泌受損或外周胰島素抵抗引起的高血糖[2]。肝作為糖脂代謝的主要器官，在糖尿病發(fā)病過程中易發(fā)生肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ER stress，ERS)，這是肥胖、胰島素抵抗和糖尿病之間的重要樞紐[3, 4]。與T2DM并行的多種刺激因素例如氧化應(yīng)激、高血糖、高游離脂肪酸、氧化型膽固醇等都會(huì)破壞肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致ER應(yīng)激[5]。微小核糖核酸(microRNAs，miRNA)在不同物種之間是保守的，抑制基因翻譯或促進(jìn)基因降解在轉(zhuǎn)錄后水平上負(fù)調(diào)節(jié)其靶基因[6,7]。一些研究表明，miR-31與代謝性疾病相關(guān)，有助于肥胖和糖尿病的發(fā)展，參與了糖尿病血管疾病的調(diào)控[8-10]。也有研究表明，在2型糖尿病患者血清中miR-31的表達(dá)量下降，miR-31會(huì)制約糖尿病腎病發(fā)展，負(fù)向調(diào)控患者的炎癥狀態(tài)[11,12]。因此，miR-31在2型糖尿病病程中發(fā)揮何種作用仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。目前，關(guān)于miR-31調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的研究較少，有研究者使用雙熒光素酶檢測(cè)驗(yàn)證了miR-31和轉(zhuǎn)錄激活因子6(activating transcription factor 6，ATF6)之間的靶向關(guān)系，進(jìn)一步下調(diào)了ATF6相關(guān)的ER應(yīng)激因子[13]。在發(fā)生ER應(yīng)激時(shí)，ATF6與ER應(yīng)激元件相互作用，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而導(dǎo)致相關(guān)的基因上調(diào)，相關(guān)性較高的有促凋亡轉(zhuǎn)錄因子C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucoregulatory protein 78，GRP78)[14]。因此，miR-31和ER應(yīng)激相關(guān)分子可能是潛在T2DM及其并發(fā)肝損傷的藥物作用靶點(diǎn)。在本研究中，通過觀察miR-31對(duì)2型糖尿病小鼠基礎(chǔ)指標(biāo)、糖脂代謝指標(biāo)及肝組織中ER應(yīng)激因子的作用，來探索miR-31對(duì)T2DM肝損傷的影響及其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)4～6周齡雄性FVB小鼠30只和過表達(dá)miR-31轉(zhuǎn)基因小鼠16只，體重18～20 g，均購(gòu)于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(晉)2019-0005】。miR-31過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心采用網(wǎng)關(guān)克隆(gateway cloning)技術(shù)和顯微注射技術(shù)構(gòu)建，且驗(yàn)證了miR-31在小鼠心、肝等主要組織器官中的高表達(dá)[15]。本實(shí)驗(yàn)于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障環(huán)境中【SYXK(晉)2019-0007】進(jìn)行，晝夜各半循環(huán)照明，濕度恒定，溫度控制在22～25 ℃，潔凈通風(fēng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由進(jìn)食飲水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求(審批號(hào)：SYDL2021015)以及中華人民共和國(guó)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.2 主要試劑和儀器

鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)于中國(guó)Solarbio公司；組織DNA提取試劑盒購(gòu)于美國(guó)Omega公司；ELISA試劑盒購(gòu)于中國(guó)南京建成生物工程研究所；DL500 DNA標(biāo)記物、Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit和TB Green?Premix Ex TaqTMII購(gòu)于日本Takara公司; RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)于美國(guó)Thermo Scientific公司；miR-31和ATF6引物定購(gòu)于中國(guó)深圳華大基因股份有限公司；山羊抗兔IgG H&L(HRP)購(gòu)于英國(guó)Abacam公司；β-肌動(dòng)蛋白抗體、ATF6抗體、GRP78抗體和CHOP抗體購(gòu)于美國(guó)GeneTex公司。RM 2245型石蠟切片機(jī)購(gòu)于德國(guó)Leica；酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀和高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad。

1.3 過表達(dá)miR-31轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定

剪取小鼠鼠尾端0.5～1 cm提取DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果鑒定是否為過表達(dá)miR-31陽(yáng)性小鼠。miR-31序列為5′-AGGCAAGAUGCUGGCAUAGCUG-3′，鑒定引物F：5′-ATGTAGGGCCCTGTGACTTG-3′, R：5′-GCTGGGCACATGTAAGGTTT-3′。反應(yīng)程序：94 ℃反應(yīng)30 s，59 ℃反應(yīng)30 s和72 ℃反應(yīng)40 s，共30個(gè)循環(huán)。

1.4 動(dòng)物分組及干預(yù)檢測(cè)

小鼠分為3組：FVB小鼠對(duì)照組(C)，F(xiàn)VB小鼠誘導(dǎo)糖尿病組(DM)和過表達(dá)miR-31小鼠誘導(dǎo)2型糖尿病組(31DM)，每組15只。參考文獻(xiàn)并經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)探索，確立采用高脂飲食(HFD，60%熱量來自脂肪)喂養(yǎng)8周聯(lián)合連續(xù)5 d腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，45 mg/kg)誘導(dǎo)2型糖尿病[16,17]。C組采用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)并腹腔注射同等劑量的檸檬酸緩沖液。在誘導(dǎo)后定期用血糖儀測(cè)量空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)。糖尿病小鼠的認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)為在誘導(dǎo)后3 d或1周內(nèi)FBG水平≥11.1 mmol/L[15]。繼續(xù)飼養(yǎng)6周，對(duì)小鼠實(shí)施安樂死。

1.5 一般情況監(jiān)測(cè)、口服糖耐量實(shí)驗(yàn)(oral glucose tolerance test，OGTT)和胰島素耐量實(shí)驗(yàn)(insulin tolerance test，ITT)

定期觀察并記錄小鼠體重、進(jìn)食、飲水、排尿、行為及精神狀態(tài)等一般情況。OGTT：小鼠禁食14 h后測(cè)空腹尾靜脈血糖作為0時(shí)血糖值，葡萄糖(2 g/kg)灌胃，測(cè)定灌胃結(jié)束后15、30、60、90、120 min時(shí)尾靜脈血糖濃度。ITT：小鼠禁食4 h后，測(cè)空腹尾靜脈血糖作為0時(shí)血糖，腹腔注射胰島素(0.75 u/kg)，測(cè)定腹腔注射結(jié)束后 15、30、45、60、90 min尾靜脈血糖濃度。

1.6 脂代謝參數(shù)、血清胰島素含量(fasting serum insulin，F(xiàn)INS)測(cè)定及穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估法-胰島素抵抗指數(shù)(insulin resistance index，HOMA-IR)

按照試劑盒說明書測(cè)定血清中總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglycerides，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)和血清胰島素水平。將小鼠處死時(shí)得到的空腹血糖值和血清胰島素值按以下公式計(jì)算HOMA-IR：HOMA-IR = 空腹血清胰島素值(mIU/L)·空腹血糖值(mmol/L)/22.5。

1.7 肝指數(shù)及蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色

安樂死小鼠后分離肝組織，按公式計(jì)算肝指數(shù)：肝指數(shù) = 肝重量(mg)/體重(g)×100%。

小鼠肝組織在4%多聚甲醛中固定、包埋于石蠟，切片后進(jìn)行HE染色，鏡下觀察肝的病理學(xué)變化，根據(jù)肝組織學(xué)活動(dòng)指數(shù)(histological activity index，HAI)評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)分得到最終評(píng)分。

1.8 RNA提取和定量實(shí)時(shí)PCR(RT-qPCR)

使用Trizol法從肝組織中提取總RNA，按照說明書將miR-31和ATF6反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，Real-time PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序如下，預(yù)變性：95℃1 min; 40個(gè)循環(huán)：95℃15 s，60℃1 min；建立熔解曲線：95℃15 s，60℃1 min, 95℃15 s和60℃15 s。特異性引物如下：miR-31 F：5′-AGGCAAGATGCTGGCATAGCTG-3′，R：試劑盒隨附的mRQ3′引物；U6 F：5′-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3′，R：5′-TGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3′；ATF6 F：5′-TCGCCTTTTAGTCCGGTTCTT-3′，R：5′-GGCTCCATAGGTCTGACTCC-3′；β-肌動(dòng)蛋白 F：5′-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3′，R：5′-GCCGGACTCATCGTACTCC-3′。相對(duì)miRNA和mRNA表達(dá)水平以U6和β-肌動(dòng)蛋白為參考基因，根據(jù)公式2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算。

1.9 蛋白質(zhì)免疫印跡

稱取肝組織并加入RIPA裂解緩沖液進(jìn)行組織均質(zhì)化。將樣品離心后取上清，用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE凝膠電泳分離，裁下所需凝膠部分并轉(zhuǎn)至PVDF膜，在5%的脫脂奶粉中室溫封閉2 h。洗膜后與ATF6(1∶1 000)、GRP78(1∶1 000)、CHOP(1∶1 000)和β-肌動(dòng)蛋白(1∶2 500)特異性抗體在4 ℃下過夜。次日，TBST洗膜后，與相應(yīng)的二抗(1∶5 000)在室溫下孵育60 min。洗滌后使用ECL發(fā)光試劑檢測(cè)免疫反應(yīng)條帶，ChemiDoc XRS系統(tǒng)曝光、Image Lab軟件進(jìn)行圖像分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 26軟件統(tǒng)計(jì)分析，采用GraphPad Prism 8.3.0軟件作圖。數(shù)據(jù)表示為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差(Mean ±SD)表示，多組間比較運(yùn)用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0. 05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 篩選過表達(dá)miR-31為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因小鼠

將鑒定為miR-31轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性小鼠列入實(shí)驗(yàn)范圍，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如Fig.1。

2.2 miR-31對(duì)T2DM小鼠基礎(chǔ)指標(biāo)的影響

高脂飲食8周，與C組相比，DM組的體重及空腹血糖均顯著升高(P<0.05)。在STZ誘導(dǎo)后第3 d和第7 d，DM組和31DM組血糖值分別達(dá)到高血糖模型標(biāo)準(zhǔn)。在T2DM小鼠中可觀察到好斗、躁動(dòng)不安和精神亢奮，呈現(xiàn)出典型的“三多一少”狀態(tài)。在STZ誘導(dǎo)2周時(shí)，DM組和31DM組進(jìn)食量、飲水量均顯著升高(P<0.05)；在STZ誘導(dǎo)4周時(shí)，DM組進(jìn)食量、飲水量均顯著高于31DM組(P<0.05)，見Table 1和Table 2。STZ誘導(dǎo)后第3 d至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，31DM組體重均顯著高于DM組(P<0.05)，見Table 3。在STZ誘導(dǎo)后第3 d，31DM組血糖值顯著低于DM組(P<0.05)；在STZ誘導(dǎo)后1周，31DM組與DM組血糖無明顯差異；直至STZ誘導(dǎo)后4周，再次觀察到miR-31對(duì)高血糖的改善作用見Table 4。

Fig.1 Mice overexpressing miR-31 were screened by PCR genotyping The mouse tail DNA was extracted, amplified by PCR, and subjected to agarose gel electrophoresis. The agarose gel showed bands of approximately 200 bp, which were identified as miR-31 overexpressing mice. The results showed that channel 2 was miR-31-negative mouse, and the rest were miR-31-positive mice

Table 1 Comparison of food intake at different stages of mice in each group (g. Mean ± SD， n = 6)

Table 2 Comparison of water intake at different stages of mice in each group (g. Mean ± SD， n = 6)

Table 3 Comparison of body weight at different stages of mice in each group (g. Mean ± SD， n = 6)

Table 4 Comparison of fasting blood glucose at different stages of mice in each group (mmol/L. Mean ± SD， n = 6)

2.3 miR-31改善T2DM小鼠的糖代謝紊亂

OGTT實(shí)驗(yàn)表明，DM組小鼠較C組小鼠糖耐量受損，血糖持續(xù)偏高，在灌胃葡萄糖15～30 min時(shí)出現(xiàn)血糖值波峰，120 min時(shí)血糖仍顯著較高(P<0.05)。ITT實(shí)驗(yàn)表明，與C組相比，DM組小鼠對(duì)胰島素不敏感，血糖持續(xù)顯著較高(P<0.05)。與DM組相比，31DM組小鼠的OGTT和ITT曲線下面積(area under the curve，AUC)均顯著下降(P<0.05)。在安樂死小鼠前的最后1次測(cè)定中，31DM組和DM組的FBG、FINS和HOMA-IR相比均顯著下降(P<0.01)，結(jié)果見Fig.2。

2.4 miR-31改善T2DM小鼠的脂代謝紊亂

與C組相比，DM組TC、TG、LDL-C水平顯著升高(P<0.05)，HDL-C水平顯著下降(P<0.05)。同時(shí)，31DM組與DM組的各項(xiàng)指標(biāo)均有顯著差異(P<0.05)，結(jié)果見Table 5。

Fig.2 miR-31 ameliorated glucose metabolism disorders in T2DM mice Type 2 diabetes were induced in mice and the relevant indicators were measured before euthanizing the mice. (A) Comparison of blood glucose concentration and area under the curve (AUC) in the oral glucose tolerance test (OGTT) in the control, diabetic and miR-31-overexpressing diabetic group (mean ± SD, n = 4). (B) Comparison of the percentage change in blood glucose to basal blood glucose and the area under the curve (AUC) in the insulin tolerance test (ITT) among groups (mean ± SD, n = 4). (C) Comparison of fasting blood glucose (FBG), fasting serum insulin (FINS) and insulin resistance index (HOMA-IR) among groups (mean ± SD, n = 6).**P<0.01 vs group C; #P<0.05,##P<0. 01 vs group DM

Table 5 Comparison of lipid metabolism indicators in mice in each group (mmol/L, Mean ± SD, n = 6)

Fig.3 miR-31 ameliorated liver damage in type 2 diabetic mice The liver index was calculated, and the degree of liver injury was assessed using HE staining and HAI score. (A) Comparison of mice liver index in the control, diabetic and miR-31-overexpressing diabetic group (mean ± SD，n = 6). (B) Comparison of liver HAI scores among the three groups (mean ± SD，n = 6). (C) Representative images of liver HE staining in each group. Green arrows represent inflammatory cell infiltration, yellow arrows represent vacuolar degeneration and nuclear swelling of hepatocytes and red arrows represent areas of hepatocyte degeneration and necrosis. Scale bar = 50 μm.**P<0.01 vs group C; ##P<0. 01 vs group DM

2.5 miR-31改善T2DM小鼠的肝損傷

與C組相比，DM組的肝指數(shù)和HAI評(píng)分顯著升高(P<0.05)，而31DM組與DM組相比肝指數(shù)和HAI評(píng)分均顯著降低(P<0.01)。在肝的HE染色中，C組肝細(xì)胞呈放射狀排列，大小正常，胞質(zhì)分布均勻，肝小葉組織結(jié)構(gòu)完整；DM組小鼠肝細(xì)胞排列無序，可見較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、以淋巴細(xì)胞為主，出現(xiàn)彌漫性的脂肪變性空泡和核腫脹，有多量巨核肝細(xì)胞和雙核肝細(xì)胞，伴有多處組織變性壞死；而31DM組僅見個(gè)別炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，少量肝細(xì)胞空泡變性，結(jié)果見Fig.3。

2.6 miR-31抑制T2DM小鼠肝的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

RT-qPCR結(jié)果表明，與C組相比，31DM組小鼠肝中miR-31的表達(dá)顯著升高，DM組小鼠肝中miR-31的表達(dá)顯著降低(P<0.01)；DM組與C組相比ATF6 mRNA的表達(dá)顯著升高，31DM組表達(dá)較DM組顯著降低(P<0.01)。Western印跡結(jié)果表明，與C組比，DM組小鼠肝組織中ATF6、CHOP、GRP78的蛋白質(zhì)表達(dá)均顯著升高(P<0.01)；與DM組相比，31DM組顯著降低了這些蛋白質(zhì)的表達(dá)(P<0.05)，結(jié)果見Fig.4。

Fig.4 miR-31 attenuated ER stress in the liver of type 2 diabetic mice (A, B) The relative expression levels of miR-31 and ATF6 mRNA in the liver of the control, diabetic and miR-31-overexpressing diabetic mice using RT-qPCR assay (mean ± SD，n = 4). (C, D, E) The relative protein levels of ATF6, CHOP and GRP78 in mice liver among groups were determined by Western blotting (mean ± SD, n = 3).*P<0.05,**P<0.01 vs group C; #P<0.05,##P<0. 01 vs group DM

3 討論

糖尿病是人群中最常見的代謝紊亂，主要影響細(xì)胞兩大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，即碳水化合物以及脂質(zhì)的代謝，導(dǎo)致代謝途徑的破壞以及有害代謝物的產(chǎn)生[18]。2型糖尿病占糖尿病發(fā)病率90%以上，其典型特征是胰島素抵抗，即由于胰島素產(chǎn)生不足和身體無法對(duì)胰島素作出充分響應(yīng)而導(dǎo)致持續(xù)的高血糖[19]。糖尿病的危險(xiǎn)因素，例如氧化應(yīng)激、高血糖、高游離脂肪酸、氧化型膽固醇等都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。而在人體中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激主要針對(duì)于肝、骨骼肌和脂肪[5]。同時(shí)，肝是糖代謝和脂代謝的重要器官，與胰島素抵抗過程密切相關(guān)，故而在2型糖尿病過程中易發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，導(dǎo)致糖尿病性肝細(xì)胞損傷[20]。miR-31由于其保守性，對(duì)調(diào)節(jié)生命新陳代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和基因組穩(wěn)定性有重要意義[7]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-31不僅作為抑癌和促癌因子參與到廣泛的癌癥調(diào)節(jié)中，對(duì)于糖酵解、糖原代謝和肥胖都具有重要意義[21]。因此，本文考慮將miR-31和ER應(yīng)激相關(guān)基因作為改善2型糖尿病糖脂代謝紊亂和肝損傷可能的藥物作用靶點(diǎn)。

在本研究中，使用STZ誘導(dǎo)后，DM組小鼠與31DM組小鼠相比血糖升高較快，可以認(rèn)為miR-31延緩了糖尿病的形成過程。本文觀察到，與C組相比，DM組小鼠的體重持續(xù)下降、空腹血糖緩慢波動(dòng)升高。OGTT和ITT實(shí)驗(yàn)均證明，DM組小鼠發(fā)生了糖代謝紊亂，血樣中升高的TC、TG、LDL濃度和下降的HDL濃度均證實(shí)，DM組小鼠發(fā)生了脂代謝紊亂，同時(shí)，DM組小鼠的肝指數(shù)顯著升高，HE染色及HAI評(píng)分顯示其發(fā)生了廣泛的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、空泡變性和壞死，而miR-31顯著改善了這些過程。本文認(rèn)為，miR-31對(duì)于T2DM形成及發(fā)展是一種潛在的制約因素，通過這種作用，在一定程度上抵御了糖尿病性肝細(xì)胞損傷。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成、折疊、修飾和加工[22]。為了維持ER的穩(wěn)態(tài)，真核細(xì)胞進(jìn)化出一種基本適應(yīng)性細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路——未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)，適當(dāng)程度的ER應(yīng)激有助于通過UPR促進(jìn)蛋白質(zhì)加工的恢復(fù)，嚴(yán)重和持續(xù)的ER應(yīng)激會(huì)引發(fā)相關(guān)細(xì)胞的凋亡[23]。通過跨膜傳感器蛋白激活的UPR分支有3種，在生理狀態(tài)下與GRP78結(jié)合而保持其不活躍的狀態(tài)[23]。發(fā)生ER應(yīng)激時(shí)，3個(gè)感受蛋白質(zhì)與GRP78解離后進(jìn)行翻譯后修飾，分別激活3條UPR通路[24]。正常生理狀態(tài)時(shí)，ATF6以酶原形式存在，在應(yīng)激狀態(tài)下被切割后釋放其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域至細(xì)胞核，引起GRP78及CHOP的上調(diào)[13]。CHOP位于PKR樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PKR-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)/真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)/轉(zhuǎn)錄激活因子-4(activating transcription factor 4，ATF4)通路下游，是ER應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要調(diào)節(jié)劑[25]。在本研究中，采取HFD聯(lián)合STZ誘導(dǎo)2型糖尿病小鼠，安樂死后小鼠肝被分離，RT-qPCR和蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果均表明，miR-31可能通過下調(diào)ATF6、CHOP和GRP78來改善肝內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

綜上所述，miR-31對(duì)T2DM小鼠肝損傷發(fā)揮保護(hù)作用，這種作用不僅與改善糖尿病病程中的葡萄糖耐量、胰島素敏感性和脂代謝紊亂相關(guān)，也可能與負(fù)向調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程有關(guān)。此次研究為開發(fā)2型糖尿病的新型治療策略提供了有趣的思路，可能會(huì)為糖尿病并發(fā)癥的進(jìn)一步研究提供新的作用靶點(diǎn)。