基于熒光光譜和二維相關(guān)分析技術(shù)探究硝磺草酮對(duì)玉米的生理效應(yīng)

高 倩, 陳盼盼, 王 毅

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，合肥 230036)

玉米是我國(guó)的重要糧食作物之一，種植區(qū)域分布十分廣泛。雜草危害是造成玉米減產(chǎn)的重要因素之一，而且隨著玉米種植范圍的不斷擴(kuò)大，雜草的種類也逐年增多[1]。玉米田雜草可使玉米減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重時(shí)甚至減產(chǎn)40%以上[2]。化學(xué)除草劑是防治玉米田雜草的主要措施，但近年來(lái)由于草甘膦的過(guò)度使用導(dǎo)致了抗藥性雜草的產(chǎn)生，因此開(kāi)發(fā)新型除草劑的需求日益迫切。對(duì)羥基苯基丙酮酸雙加氧酶 (HPPD) 抑制劑類除草劑具有高效、低毒、對(duì)作物安全性高、不易產(chǎn)生抗藥性及對(duì)環(huán)境友好等特點(diǎn)，被認(rèn)為是替代草甘膦的轉(zhuǎn)基因作物靶標(biāo)除草劑。目前，HPPD 抑制劑的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用仍是研究的熱點(diǎn)[3-4]。

硝磺草酮 (mesotrione，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖式1) 作為HPPD 抑制劑類除草劑的代表性品種，具有用量低、土壤殘留量少、對(duì)環(huán)境和后茬作物安全等優(yōu)點(diǎn)，主要用于玉米田除草[5]。然而，隨著硝磺草酮的大量使用以及玉米新品種的出現(xiàn)，其對(duì)玉米的藥害也時(shí)有發(fā)生。硝磺草酮對(duì)植物的藥害表現(xiàn)在光合作用受到抑制、葉片褪綠、株高和鮮重降低等現(xiàn)象。例如，李向楠等[6]通過(guò)測(cè)定耐性和敏感型玉米在硝磺草酮處理下的超氧陰離子產(chǎn)生速率、過(guò)氧化氫含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)，發(fā)現(xiàn)敏感型玉米葉片中積累的活性氧更多，光合作用受到嚴(yán)重抑制，最終植株干枯死亡。張宏軍等[7]研究了4 個(gè)煙嘧磺隆敏感型玉米品種對(duì)硝磺草酮的響應(yīng)情況，發(fā)現(xiàn)當(dāng)硝磺草酮施藥劑量高于有效成分210 g/hm2時(shí)，玉米光合效率顯著降低，且4 種玉米的株高和鮮重均明顯降低。除此之外，硝磺草酮的使用也會(huì)對(duì)玉米根系分泌物產(chǎn)生影響。根系分泌物在植物抵御各類逆境脅迫中發(fā)揮了重要作用，其分泌的生物大分子和小分子有機(jī)化合物具有較強(qiáng)的絡(luò)合或螯合能力。因此，當(dāng)農(nóng)藥與根系分泌物發(fā)生相互作用時(shí)，可以通過(guò)根系分泌物熒光強(qiáng)度的變化，間接地反映出農(nóng)藥對(duì)植株產(chǎn)生藥害的程度，但目前尚未見(jiàn)關(guān)于硝磺草酮對(duì)玉米根系分泌物影響的研究報(bào)道。

圖式1 硝磺草酮結(jié)構(gòu)式Scheme 1 The structural formula of mesotrione

鑒于此，本研究采用紫外-可見(jiàn)吸收光譜 (UVvis)、熒光光譜和二維相關(guān)分析 (2D-COS) 技術(shù)，探究了玉米植株在硝磺草酮脅迫下的生理響應(yīng)，擬通過(guò)分析玉米根、莖、葉鮮重和葉綠素、類胡蘿卜素含量的變化，以及玉米根系分泌物熒光物質(zhì)成分的改變等，揭示不同濃度硝磺草酮對(duì)玉米生長(zhǎng)過(guò)程的影響，以期為指導(dǎo)硝磺草酮的合理使用提供依據(jù)，并為HPPD 抑制劑類除草劑對(duì)作物的安全性評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥劑及主要儀器

97%硝磺草酮 (mesotrione) 原藥，由廣西南寧綠豐化工有限公司提供；二甲基亞砜 (DMSO)， 購(gòu)自上海阿拉丁生化科技有限公司。以加入73.83%硝酸鈣的霍格蘭 (Hoagland) 營(yíng)養(yǎng)液用于玉米植株的培養(yǎng)。所用純水和超純水均通過(guò)Milli-Q 超純水儀制取。

UV1900i 紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；Cary Eclipse 熒光分光光度計(jì)，美國(guó)安捷倫公司。

1.2 植物培養(yǎng)

挑選籽粒飽滿、均勻一致的玉米種子 (金玉698)，用0.5% NaClO 溶液消毒30 min；洗凈后置于濕潤(rùn)的濾紙上，于25 ℃、相對(duì)濕度80%條件下萌發(fā)3 d；將幼苗用海綿包裹并移栽至霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液中，放置于光照培養(yǎng)箱 (25 ℃，相對(duì)濕度80%) 中培養(yǎng)21 d，即玉米長(zhǎng)至3 葉1 心期。

1.3 硝磺草酮暴露試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取0.01 g (精確至0.000 1 g)硝磺草酮原藥，用DMSO 溶解并定容至10 mL，配制成1 000 mg/L 的母液；用加有73.83% 硝酸鈣的霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液將母液梯度稀釋。根據(jù)其目前在中國(guó)登記的使用劑量，本研究中硝磺草酮溶液的試驗(yàn)質(zhì)量濃度分別設(shè)為：0、0.5、1、5 和10 mg/L。

選取長(zhǎng)勢(shì)一致的玉米幼苗，分別移栽至裝有1 L 不同質(zhì)量濃度硝磺草酮溶液的6 孔黑色培養(yǎng)盒中。每盒移入6 株，再將培養(yǎng)盒放入25 ℃、相對(duì)濕度80%、12 h 光照/12 h 黑暗、375 μmol photon/(m2· s) 的光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。分別于處理后2 h 和1、3、7、10、14 d 取葉片樣品并提取根系分泌物，每個(gè)處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

1.4 葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量測(cè)定

葉綠素含量測(cè)定：參考Lichtenthaler 等[8]的方法。選取葉心處葉片，將葉片中脈兩側(cè)對(duì)稱位置的鮮葉剪下；準(zhǔn)確稱取0.01 g (精確至 0.0001 g)鮮葉，剪成大小一致的片狀，用3～5 mL 80%丙酮溶液于黑暗條件下浸泡提取，直至葉片完全變?yōu)榘咨?。?0%丙酮溶液作為溶劑對(duì)照，采用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定提取液在646 和663 nm 處的吸光度 (A646和A663) 。根據(jù)公式1～3 分別計(jì)算新鮮葉片中葉綠素a、葉綠素b 的含量以及總?cè)~綠素含量。

式中，Ca為葉綠素a 的含量，mg/g (FW)；Cb為葉綠素b 的含量，mg/g (FW)；Ca+b為總?cè)~綠素含量 (葉綠素a 和葉綠素b 含量的總和)，mg/g(FW)；V0為提取液體積，mL；m0為樣品鮮重(fresh weight，F(xiàn)W)，g。

類胡蘿卜素含量測(cè)定：參考Lichtenthaler[8]的方法。同樣采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定470 nm(A470) 處玉米葉片的吸光度，然后根據(jù)所得葉綠素含量Ca和Cb以及公式 (4) 計(jì)算得到類胡蘿卜素含量 (Cc，mg/g (FW))。

1.5 玉米根系分泌物提取及根莖葉鮮重測(cè)定

將洗凈的玉米植株根系放入裝有100 mL 超純水的錐形瓶中，浸泡提取10 h[9]。根系分泌物提取過(guò)程中，植物于25 ℃、相對(duì)濕度80%、375 μmol photon/(m2· s) 條件下繼續(xù)生長(zhǎng)10 h。將收集的玉米根系分泌物提取液過(guò)0.45 μm 濾膜，于4 ℃保存，待用。將提取完分泌物的根系剪下，與莖葉分開(kāi)，用濾紙快速吸干根系水分，分別稱重并記錄在不同質(zhì)量濃度硝磺草酮脅迫下玉米植株地上部分莖葉和根系的鮮重。

1.6 熒光光譜掃描

采用熒光分光光度計(jì)掃描得到同步熒光光譜。在298 K 下，掃描波長(zhǎng)范圍設(shè)置為220～500 nm；激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的狹縫寬度均設(shè)為10 nm，發(fā)射波長(zhǎng)和激發(fā)波長(zhǎng)的差值設(shè)定為60 nm恒定值，即Δλ=Em-Ex= 60 nm；掃描速率為1 200 nm/min。三維熒光光譜同樣通過(guò)熒光分光光度計(jì)掃描獲得。激發(fā)波長(zhǎng)為200～550 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為250～650 nm，掃描速率為9 600 nm/min，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的狹縫寬度均為5 nm。所測(cè)結(jié)果均扣除試驗(yàn)空白 (即扣除相同條件下超純水的背景值)。

1.7 二維相關(guān)分析

二維相關(guān)分析 (2D-COS) 作為一種先進(jìn)的光譜分析手段，能夠?qū)⒐庾V信號(hào)擴(kuò)展至二維，從而提高分辨率。2D-COS 可以把多個(gè)重疊峰的復(fù)雜圖譜進(jìn)行簡(jiǎn)化，通過(guò)各信號(hào)峰之間的變化關(guān)系，研究分子內(nèi)和分子間的相互作用[10]。此外，通過(guò)同步光譜和異步光譜的協(xié)同分析，可以很好地揭示復(fù)雜體系中熒光基團(tuán)、官能團(tuán)等分子基團(tuán)的變化序列。為了研究硝磺草酮與玉米根系分泌物熒光基團(tuán)結(jié)合的順序，本研究采用以硝磺草酮質(zhì)量濃度為外部擾動(dòng)的內(nèi)部因素評(píng)價(jià)矩陣 (internal factor evaluation matrix，IFE) 校正同步熒光光譜進(jìn)行2D-COS 分析，并采用2Dshige 軟件，對(duì)同步熒光光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行再處理，得到同步和異步的熒光光譜二維等高線圖，用以揭示硝磺草酮脅迫后玉米根系分泌物熒光基團(tuán)的變化規(guī)律。

同步圖表示給定2 個(gè)波長(zhǎng) (λ1和λ2) 下光譜強(qiáng)度的同步變化。在對(duì)角線上出現(xiàn)的相關(guān)峰稱作自峰，在對(duì)角線兩側(cè)的峰為交叉峰；其中自峰均為正值，而交叉峰可能為正值也可能為負(fù)值。在同步光譜中，若光譜強(qiáng)度Y(λ1,λ2)＞0，則λ1和λ2的變化趨勢(shì)相同；若Y(λ1,λ2)＜0，則λ1和λ2的變化趨勢(shì)相反。將同步光譜和異步光譜結(jié)合，如果對(duì)應(yīng)的同步光譜強(qiáng)度Y(λ1,λ2) 和異步光譜強(qiáng)度X(λ1,λ2)正負(fù)相同，則波長(zhǎng)λ1的變化比波長(zhǎng)λ2的變化快；相反，如果正負(fù)不同，則表明λ2的變化比λ1快[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片葉綠素含量變化

硝磺草酮通過(guò)植物根系進(jìn)入植株體內(nèi)后，會(huì)影響植株的正常生理活動(dòng)。例如，史國(guó)棟研究發(fā)現(xiàn)，隨著硝磺草酮葉面噴施濃度增加，谷子葉片中葉綠素含量整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且藥劑濃度越高其影響越難以得到緩解[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，高濃度硝磺草酮脅迫組的玉米葉心逐漸褪綠變白；當(dāng)硝磺草酮質(zhì)量濃度為5 和10 mg/L時(shí)，肉眼可以觀察到這兩個(gè)濃度下的玉米葉心分別在第7 天和第5 天開(kāi)始出現(xiàn)白化癥狀。因此，為了探究不同濃度硝磺草酮脅迫不同時(shí)間下對(duì)玉米植株產(chǎn)生的影響，進(jìn)一步測(cè)定了玉米葉片中葉綠素的含量變化。圖1 為不同處理時(shí)間下玉米葉片的葉綠素相對(duì)含量，結(jié)合圖2 可以看到，隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)照組玉米的葉綠素a、葉綠素b 和葉綠素a 和b 總含量均呈先降低再升高然后再降低的趨勢(shì)。表1 是通過(guò)單因素方差分析所得的不同脅迫時(shí)間下玉米葉片中葉綠素含量差異分析結(jié)果，從中可看出：在硝磺草酮單一濃度下，隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，10 和14 d 葉片中的葉綠素a、葉綠素b 含量及葉綠素a 和b 的總含量與2 h 及1、3、7 d 均具有顯著差異 (P＜0.05)；另外，在相同時(shí)間內(nèi)，隨著硝磺草酮脅迫濃度增高，葉綠素總含量降低趨勢(shì)逐漸加快，其中硝磺草酮為10 mg/L時(shí)降低最為明顯。研究結(jié)果表明，當(dāng)硝磺草酮脅迫濃度高于5 mg/L 時(shí)，10 d 后對(duì)玉米植株葉綠素的合成產(chǎn)生了明顯的抑制作用，從而影響玉米的正常生長(zhǎng)。

圖1 不同濃度硝磺草酮脅迫不同時(shí)間下玉米葉片葉綠素含量(n=3)Fig. 1 The chlorophyll content in leaves of maize under different concentrations of nitrosulfuron stress at different times (n=3)

表1 硝磺草酮脅迫不同時(shí)間下玉米葉片葉綠素含量差異分析Table 1 Differential analysis results of chlorophyll content in maize leaves at different times under the stress of mesotrione

圖2 硝磺草酮脅迫不同時(shí)間玉米葉片葉綠素含量變化趨勢(shì) (n=3)Fig. 2 Variation trend of chlorophyll content in maize leaves under the stress of mesotrione at different times (n=3)

2.2 葉片類胡蘿卜素含量變化

HPPD 是植物中酪氨酸分解代謝和質(zhì)體醌(PQ) 生物合成途徑的關(guān)鍵酶，HPPD 將酪氨酸轉(zhuǎn)化為PQ 和α-生育酚[13]。當(dāng)HPPD 被抑制時(shí)，生育酚和PQ 水平下降，使得類胡蘿卜素被耗盡，進(jìn)而導(dǎo)致葉片漂白甚至植物死亡[14]。因此，對(duì)硝磺草酮敏感的植物可能會(huì)出現(xiàn)類胡蘿卜素和葉綠素含量降低，葉片白化、植株變矮及鮮重降低等現(xiàn)象。不同濃度硝磺草酮脅迫不同時(shí)間下玉米葉片中類胡蘿卜素的含量變化見(jiàn)圖3。從中可以看出，不同濃度硝磺草酮脅迫2 h 及1、3、7 d 后，玉米葉片中類胡蘿卜素含量變化不大 (t檢驗(yàn)分析得P＞0.05)；而脅迫10 和14 d 后，高濃度硝磺草酮(5 和10 mg/L) 處理組類胡蘿卜素含量均低于對(duì)照組和低濃度組，且差異顯著 (P＜0.05)。結(jié)合葉綠素含量變化，可以得出，高濃度硝磺草酮脅迫能夠抑制玉米的光合作用，且隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)藥害加重，受害葉片因色素含量降低而出現(xiàn)白化癥狀。

圖3 不同濃度硝磺草酮脅迫不同時(shí)間下玉米葉片中類胡蘿卜素含量 (n=3)Fig. 3 The carotenoid content in maize leaves under different concentrations of mesotrione stress at different times (n=3)

2.3 根、莖、葉鮮重變化

2.4 同步熒光光譜分析

不同濃度硝磺草脅迫不同時(shí)間下玉米根系分泌物的同步熒光光譜見(jiàn)圖5。該光譜中共含有3 個(gè)熒光峰：峰I (Ex= 225～235 nm)、峰II (Ex= 280～325 nm) 和峰III (Ex= 390～400 nm)。根據(jù)文獻(xiàn)中對(duì)同步熒光光譜中熒光峰的劃分[15-17]，峰I 和峰II 為類蛋白熒光峰，峰III 屬于類腐殖質(zhì)熒光峰。從圖5 中可以看出：隨著硝磺草酮脅迫濃度升高，玉米根系分泌物的同步熒光光譜發(fā)生了顯著變化，整體上呈現(xiàn)隨濃度升高熒光強(qiáng)度降低的趨勢(shì)，表明不同濃度硝磺草酮脅迫導(dǎo)致玉米根系分泌物中熒光物質(zhì)組分發(fā)生了變化。另外，在相同濃度硝磺草酮脅迫下，14 d 后峰I 的熒光強(qiáng)度相對(duì)增強(qiáng)，峰II 的熒光強(qiáng)度相對(duì)減弱。研究結(jié)果表明，硝磺草酮濃度和脅迫時(shí)間均會(huì)影響玉米根系

圖4 不同質(zhì)量濃度硝磺草酮脅迫不同時(shí)間下玉米根、莖、葉的鮮重變化 (n=3)Fig. 4 Changes of fresh weight of maize roots, stems and leaves under different concentrations of mesotrione stress at different times (n=3)

分泌物中熒光組分的變化。

2.5 三維熒光光譜分析

通過(guò)三維熒光光譜可以更直觀地看出熒光峰值強(qiáng)度的變化。圖6 和表3 分別為不同濃度硝磺草酮脅迫不同時(shí)間下玉米根系分泌物的三維熒光光譜和譜圖中峰A (Ex：225～235 nm/Em：310～348 nm) 和峰B (Ex：280～325 nm/Em：316～358 nm)的熒光強(qiáng)度值。根據(jù)文獻(xiàn)中對(duì)溶解性有機(jī)質(zhì)三維熒光峰歸屬的劃分[18-19]，本研究中的峰A 和峰B均屬于類蛋白峰。結(jié)合圖5 的同步熒光光譜，由于其類腐殖質(zhì)峰的熒光強(qiáng)度太低，所以在三維熒光譜圖中未體現(xiàn)出來(lái)，說(shuō)明在硝磺草酮脅迫下，玉米根系分泌物中的主要熒光物質(zhì)為類蛋白物質(zhì)，類腐殖質(zhì)含量相對(duì)較少。根據(jù)玉米根系分泌物的熒光峰值強(qiáng)度，與對(duì)照組相比，在同一時(shí)間下，不同濃度硝磺草酮脅迫后根系分泌物的熒光強(qiáng)度均減弱。其中，當(dāng)硝磺草酮濃度為10 mg/L時(shí)，3 d 和7 d 時(shí)峰A 消失，14 d 時(shí)峰B 也近乎消失，表明經(jīng)10 mg/L 硝磺草酮脅迫后，玉米根系分泌物中的熒光物質(zhì)組分發(fā)生了顯著變化。脅迫時(shí)間為2 h 及1、3 d 時(shí)，峰A 隨著硝磺草酮質(zhì)量濃度的升高熒光強(qiáng)度逐漸減弱，峰B 在硝磺草酮質(zhì)量濃度為5 mg/L 和10 mg/L 時(shí)熒光強(qiáng)度反而增強(qiáng)；脅迫7、10 和14 d 時(shí)，峰A 和峰B 的熒光強(qiáng)度均隨著硝磺草酮質(zhì)量濃度的升高呈先減弱后增強(qiáng)的趨勢(shì)，原因可能是在較高濃度農(nóng)藥脅迫下，植物根系更傾向于分泌出富含類蛋白熒光基團(tuán)的物質(zhì)，以此來(lái)應(yīng)對(duì)根系周?chē)h(huán)境中農(nóng)藥的脅迫，這與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果[20]一致。因此，7、10 和14 d熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)，可能是由于玉米根系分泌出了更多的類蛋白以應(yīng)對(duì)高濃度硝磺草酮脅迫的緣故。

表3 不同質(zhì)量濃度磺草酮脅迫不同時(shí)間下玉米根系分泌物三維熒光強(qiáng)度Table 3 Fluorescence intensity of fluorescence peaks in the three-dimensional fluorescence spectrum of maize root exudates under the stress of different concentrations of mesotrione at different times

圖5 不同質(zhì)量濃度硝磺草酮脅迫不同時(shí)間下玉米根系分泌物的同步熒光光譜Fig. 5 Synchronous fluorescence spectra of maize root extractions under the stress of different concentrations mesotrione at different times

圖6 不同質(zhì)量濃度硝磺草酮脅迫不同時(shí)間下玉米根系分泌物的三維熒光光譜Fig. 6 3D fluorescence spectra of maize root extractions under the stress of different concentrations of mesotrione at different times

表2 硝磺草酮脅迫不同時(shí)間下玉米根、莖、葉鮮重差異顯著性分析Table 2 Significance analysis of fresh weight difference of root, stem and leaf of maize under mesotrione stress at different times

2.6 二維相關(guān)分析

與同步熒光分析相比，二維相關(guān)分析 (2D-COS)技術(shù)提供了更詳細(xì)的熒光峰變化信息。2D-COS 同步光譜圖 (圖7) 的對(duì)角線上存在兩個(gè)顯著的自峰(Ex=232 nm 和Ex=284 nm)，分別對(duì)應(yīng)于圖5 中同步熒光光譜的峰I 和峰II。其中，在2 h 和1、3、7 d 時(shí)，Ex= 284 nm 處自峰的熒光強(qiáng)度高于Ex=232 nm 處自峰的熒光強(qiáng)度，說(shuō)明隨著硝磺草酮脅迫濃度的增加，上述4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的不同熒光基團(tuán)熒光強(qiáng)度變化的絕對(duì)值依次為284 nm 處類蛋白熒光基團(tuán)＞232 nm 處類蛋白熒光基團(tuán)。在圖7 的同步光譜中，所有峰值均大于0，并且交叉峰X(qián)(284,232) 也大于0，說(shuō)明在本研究濃度范圍內(nèi)，隨著硝磺草酮濃度的增加，玉米根系分泌物熒光強(qiáng)度的整體變化趨勢(shì)相同。而10 d 和14 d 的根系分泌物熒光強(qiáng)度變化趨勢(shì)與2 h 及1、3、7 d 相反。

結(jié)合異步光譜圖，2D-COS 技術(shù)可以揭示同步熒光光譜中不同波長(zhǎng)處熒光基團(tuán)的熒光強(qiáng)度隨硝磺草酮濃度變化而變化的相互關(guān)系。從圖7 中可知，1 d 和10 d 時(shí)根系分泌物的2D-COS 異步光譜譜圖右下區(qū)域?yàn)檎徊娣?，其?0 d 處有兩個(gè)正交叉峰X(qián)(284, 234) 和X(346, 234)；2 h 和3、7、14 d 的2D-COS 異步光譜譜圖右下區(qū)域呈現(xiàn)負(fù)交叉峰區(qū)域，其中，2 h 和7、14 d 處有兩個(gè)負(fù)交叉峰X(qián)(282～304, 232～234) 和X(306～360, 234～284)。兩個(gè)正交叉峰區(qū)域的存在說(shuō)明圖7 的同步熒光光譜中類蛋白熒光峰 (Ex= 225～235 nm) 和(Ex= 280～325 nm) 均發(fā)生了熒光峰重疊。該結(jié)果同時(shí)還證實(shí)了2D-COS 是解決同步熒光光譜中峰重疊問(wèn)題的有效工具。

圖7 硝磺草酮脅迫不同時(shí)間下玉米根系分泌物的同步和異步2D-COS 熒光光譜Fig. 7 Synchronous and asynchronous 2D-COS fluorescence spectra of maize root exudates under the stress of mesotrione at different times

根據(jù)2D-COS 解譜規(guī)則，所有的負(fù)交叉峰X(qián)(282～304, 232～234) 和X(306～360, 234～284) 表明，隨著硝磺草酮質(zhì)量濃度增加，2 h 和3、7、14 d 時(shí)玉米根系分泌物中232 nm 處的類蛋白先于284 nm 處類蛋白與硝磺草酮的結(jié)合；峰區(qū)域X(284, 234) 和X(346, 234) ＞0，說(shuō)明1 d 和10 d 時(shí)玉米根系分泌物中284 nm 處的類蛋白先于232 nm處類蛋白與硝磺草酮結(jié)合。類蛋白物質(zhì)隨著硝磺草酮脅迫濃度增加的變化快慢可能與不同脅迫時(shí)間下不同類蛋白與硝磺草酮之間的結(jié)合能力強(qiáng)弱有關(guān)。

3 結(jié)論與討論

本研究探討了硝磺草酮脅迫下玉米的生理效應(yīng)，分別采用紫外可見(jiàn)吸收光譜、同步熒光光譜、三維熒光光譜和2D-COS 技術(shù)，研究了硝磺草酮對(duì)玉米葉片光合系統(tǒng)、根莖葉鮮重和根系分泌物的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除草劑在使用過(guò)程中可能會(huì)對(duì)作物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生抑制作用，對(duì)生理指標(biāo)產(chǎn)生不利影響。高鳴等[21]的研究表明，硝磺草酮葉面噴施后，對(duì)谷子株高和鮮重會(huì)造成影響；馬兵兵[22]也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)土壤中莠去津 (atrazine) 濃度超過(guò)50 mg/kg 時(shí)，植株和根的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制；武婷婷[23]研究發(fā)現(xiàn)，大豆苗后施用10%硝磺草酮懸浮劑后，植株上部復(fù)葉褪綠，藥害嚴(yán)重時(shí)復(fù)葉干枯、植株萎蔫。本研究結(jié)果表明，隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，5 和10 mg/L 的硝磺草酮處理能夠抑制玉米葉片葉綠素和類胡蘿卜素的合成，導(dǎo)致玉米出現(xiàn)白化癥狀，影響其正常生長(zhǎng)，進(jìn)而導(dǎo)致根、莖、葉鮮重降低。

此外，也有大量文獻(xiàn)報(bào)道了植物根分泌物反過(guò)來(lái)對(duì)重金屬和有機(jī)物污染物的影響。Montiel-Rozas 等[24]發(fā)現(xiàn)，根系分泌物可以改變重金屬的生物利用度。Guo 等[25]的研究表明，植物根系分泌物對(duì)土壤中多環(huán)芳烴類 (PAHs) 化合物的降解和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。本研究中的同步熒光光譜和三維熒光光譜表明，玉米根系分泌物中含有類蛋白和類腐殖質(zhì)物質(zhì)，其熒光光譜的變化揭示了硝磺草酮與玉米根系分泌物的相互作用。硝磺草酮脅迫導(dǎo)致玉米根系分泌物中熒光物質(zhì)的組成發(fā)生了顯著變化，且藥劑濃度越高及脅迫時(shí)間越久，硝磺草酮對(duì)玉米根系分泌物的熒光猝滅作用越顯著。2D-COS 技術(shù)進(jìn)一步表明，284 nm 處的類蛋白熒光基團(tuán)優(yōu)先與硝磺草酮進(jìn)行結(jié)合，揭示了根系分泌物與硝磺草酮在不同脅迫時(shí)間下的結(jié)合能力不同。研究表明，當(dāng)硝磺草酮質(zhì)量濃度高于5 mg/L、脅迫時(shí)間超過(guò)10 d，會(huì)對(duì)玉米的生理和生長(zhǎng)產(chǎn)生較大影響。本研究結(jié)果可為硝磺草酮的安全合理使用提供參考，同時(shí)也證實(shí)了利用光譜技術(shù)和2D-COS 技術(shù)可以很好地揭示植物對(duì)污染物脅迫的響應(yīng)，拓展了其在環(huán)境毒理學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

謹(jǐn)以此文慶賀中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)學(xué)科成立70 周年。

Dedicated to the 70th Anniversary of Pesticide Science in China Agricultural University.

作者簡(jiǎn)介：

高倩，碩士，實(shí)驗(yàn)師。2008 年畢業(yè)于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)專業(yè)，獲農(nóng)學(xué)碩士學(xué)位。2008 年至今任職于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，從事農(nóng)藥學(xué)教學(xué)、科研及實(shí)驗(yàn)室管理工作，研究方向?yàn)檗r(nóng)藥殘留與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，是安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥殘留檢測(cè)中心核心成員。參與國(guó)家自然科學(xué)基金、省部級(jí)項(xiàng)目10 余項(xiàng)，以第一作者在國(guó)內(nèi)外期刊發(fā)表論文10 余篇，獲得國(guó)家發(fā)明專利1 項(xiàng)。

王毅，博士，教授，博士生導(dǎo)師，農(nóng)藥學(xué)系主任。2014 年畢業(yè)于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)專業(yè)，獲理學(xué)博士學(xué)位，現(xiàn)任職于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院。長(zhǎng)期從事農(nóng)藥環(huán)境毒理、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全、新農(nóng)藥創(chuàng)制等方面的研究工作。近年來(lái)，主持國(guó)家自然科學(xué)基金2 項(xiàng)、安徽省自然科學(xué)基金優(yōu)青、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)制定、安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)“神農(nóng)學(xué)者”英才計(jì)劃、企事業(yè)單位委托等項(xiàng)目。以第一作者或通訊作者在Journal of Hazardous Materials、Analytical Chemistry、Journal of Agricultural and Food Chemistry、Environmental Pollution、Science of the Total Environment等高質(zhì)量期刊上發(fā)表近30 篇SCI，以第一發(fā)明人授權(quán)國(guó)家發(fā)明專利3 項(xiàng)；擔(dān)任《農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)》青年編委、Journal of Hazardous Materials、Journal of Agricultural and Food Chemistry、Sensors and Actuators B: Chemical等期刊審稿人。