微塑料對氯氟醚菌唑在水稻環(huán)境中的立體選擇性降解行為的影響

金銀銀, 李晨琛, 朱云龍, 李宗杰, 劉艷霞,符 康, 柴婷婷*,, 崔 峰*,

(1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 食品與健康學(xué)院，杭州 311300；2. 浙江農(nóng)林大學(xué) 綠色農(nóng)藥 2011 協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 311300)

氯氟醚菌唑 (mefentrifluconazole，MFZ) 是一種新型三唑類殺菌劑，可通過抑制真菌細(xì)胞膜重要組成成分麥角甾醇的生物合成，進(jìn)而抑制病原菌的細(xì)胞生長[1]。氯氟醚菌唑具有廣譜、高效，兼具保護(hù)、治療、鏟除作用，適用于大田作物以及經(jīng)濟(jì)作物等大約60 種作物中真菌性病害的防治，尤其對水稻紋枯病及稻瘟病等具有顯著防效[2]。氯氟醚菌唑具有一個手性碳中心 (圖式1)，已有研究表明，其對映異構(gòu)體的生物活性以及對非靶標(biāo)生物的毒性具有立體選擇性差異[3]。Cui 等[4]研究結(jié)果表明，氯氟醚菌唑S體對斑馬魚的毒性高于R體；Li 等[5]發(fā)現(xiàn)，氯氟醚菌唑R體比S體可與靶蛋白形成更穩(wěn)定的構(gòu)象，從而使R體對真菌表現(xiàn)出更高的生物活性。然而，目前我國尚未制定氯氟醚菌唑在水稻中的最大殘留限量，有關(guān)其在水稻環(huán)境中的立體選擇性行為也尚未見相關(guān)報道。

圖式1 氯氟醚菌唑?qū)τ钞悩?gòu)體化學(xué)結(jié)構(gòu)式Scheme 1 The structural formula of mefentrifluconazole enantiomers

微塑料 (micro-plastics，MPs) 是直徑小于5 mm的塑料碎片或顆粒，廣泛分布在水體、陸地和空氣中，是造成環(huán)境污染的主要載體[6]。已有研究表明，微塑料可通過雨水或灌溉遷移到周圍的河流和農(nóng)業(yè)徑流中[7]，并在農(nóng)作物生長環(huán)境中持續(xù)存在。微塑料會直接或間接改變水土中微生物菌群的分布和理化性質(zhì)[8]，并影響生物對于藥物的代謝分解[9-10]。規(guī)?；痉N植的農(nóng)業(yè)環(huán)境中存在各種微塑料污染[11]，以及由真菌病害等作物疾病防治產(chǎn)生的農(nóng)藥殘留超標(biāo)風(fēng)險。本研究參考前期報道中的微塑料對水稻生長代謝產(chǎn)生顯著影響的濃度(1.5 mg/kg)[12]以及土壤環(huán)境中微塑料檢出范圍(0.57～12.9 mg/kg)[13]，進(jìn)行水稻植株盆栽模擬試驗，研究了微塑料對氯氟醚菌唑在水稻環(huán)境中的立體選擇性行為及消解動態(tài)的影響，旨在為氯氟醚菌唑的立體選擇性環(huán)境行為研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (液相為LC-20A，質(zhì)譜為LCMS-8050，日本島津公司)；TG16.5 臺式高速離心機 (上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；VORTEX GENIUS 3 渦旋混合器 (德國 IKA 公司)；BSA223S-CW 分析天平 (德國Sartorius 公司)； Milli-Q 超純水系統(tǒng) (美國Millipore 公司)；57044-SPE 固相萃取裝置 (美國Supelco 公司)；SHB-III 循環(huán)水式多用真空泵 (鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；DN-24W 恒溫水浴氮氣吹干儀 (上海比朗儀器制造有限公司)；KQ5200E 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

甲醇和乙腈 (色譜純，德國 Merck 公司)；氯化鈉和無水硫酸鈉 (分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；氨水 (優(yōu)級純，西隴科學(xué)股份有限公司)；OasisHLB 固相萃取柱 (美國Waters 公司，200 mg/6 mL)；98.42%氯氟醚菌唑外消旋體 (racmefentrifluconazole ) 原藥 (畢得醫(yī)藥公司)；500 nm聚苯乙烯 (PS) 微球 (麥可欣科技有限公司)。

1.2 盆栽模擬試驗

供試水稻品種為“甬燦975”。將水稻種子浸種催芽后，統(tǒng)一播種于水稻基質(zhì)土上育苗。直至分蘗初期，將甬燦秧苗移至處理組盆中。本研究采用PS 微球水溶液與土壤混勻，使土壤中PS 微球含量為1 mg/kg，并設(shè)置有PS 微球處理組60 盆與無PS 微球處理組60 盆。于水稻分蘗末期，使用0.1%吐溫80 水溶液將氯氟醚菌唑原藥配制成藥液，按有效成分180 g/hm2噴霧施用于水稻葉面，設(shè)計4 個處理 (M 組：無微塑料但噴施氯氟醚菌唑；MP 組：有微塑料且噴施氯氟醚菌唑；P 組：有微塑料但不噴施藥物；CK 組：無微塑料且不施藥，為空白對照組)，每個處理組3 個平行，每組平行10 盆稻苗，共計120 盆。分別于施藥后0 (2 h)、1、3、5、7、14、21 和28 d，采用隨機多點取樣法采集水稻植株、根系、土壤和田水樣品。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品制備

田水樣本：準(zhǔn)確量取田水樣500 mL 于棕色試劑瓶中4 ℃環(huán)境保存，并盡快完成處理；

植株樣本：土壤上部分的水稻植株用剪刀剪下，土壤下部分取到根，洗凈，擦干水分，植株樣本加入液氮用磨粉機磨碎后于-20 ℃環(huán)境保存；

土壤樣本：隨機取盆中土壤50 g，除去土壤中的碎石、雜草和植物根莖等雜物，混勻后留樣，-20 ℃環(huán)境保存。

1.3.2 樣品提取與凈化

田水樣本 (每個樣本設(shè)3 個平行處理)：500 mL 水樣通過0.45 μm 濾膜后存于上樣瓶中。依次加入5 mL 甲醇和5 mL 純水活化HLB 小柱，將過濾后的水樣以3～5 mL/min通過HLB 柱，以5 mLV(甲醇) :V(水) = 30 : 70 進(jìn)行淋洗，棄去流出液后抽干，用5 mL 甲醇 (含體積分?jǐn)?shù)為1% 的氨水) 洗脫目標(biāo)物。收集洗脫液，于40 ℃水浴下氮吹至近干，用甲醇定容至1 mL，過0.22 μm 有機濾膜于1.5 mL 樣品瓶中，-80 ℃保存待分析。

植株樣本、土壤樣本 (每個樣本設(shè)3 個平行處理)：分別稱取5 g 樣品 (水稻植株、根系以及土壤) 于50 mL 離心管中，加入10 mL 超純水，渦旋混勻。加入20 mL 乙腈超聲提取20 min 后，再加入2 g 氯化鈉渦旋20 s，于7 000 r/min 下離心3 min 后取上清液至50 mL 離心管中。重復(fù)提取1 次。合并2 次上清液，加入2 g 無水硫酸鈉于離心管中，上清液于40 ℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干。用甲醇定容至1 mL，過0.22 μm 有機濾膜于1.5 mL 進(jìn)樣小瓶中，-80 ℃下保存待分析。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件 Chiralpak IG 手性柱 (4.6 mm ×150 mm，5 μm，大賽璐)；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量1 μL；流速0.5 mL/min；流動相為V(10 mmol/L 乙酸銨水溶液) :V(甲醇) = 5 : 95。

1.4.2 質(zhì)譜條件 采用多反應(yīng)監(jiān)測 (MRM) 條件下電噴霧正離子 (ESI+) 模式；霧化氣流量3 L/min；加熱氣流量10 L/min；離子化電壓 +3 500 V；接口溫度300 ℃；傳輸線溫度250 ℃；加熱塊溫度400 ℃；干燥氣流量10 L/min。

氯氟醚菌唑的離子信息見表1。

表1 氯氟醚菌唑離子對信息Table 1 The ion-pair information of mefentrifluconazole

1.5 計算方法

1.5.1 對映體EF 值 通過測定氯氟醚菌唑各對映體的含量，按 (1) 式計算氯氟醚菌唑?qū)τ丑w的EF值 (enantiomerfraction，對映體分?jǐn)?shù))，評價氯氟醚菌唑在水稻環(huán)境中的立體選擇性[5]。EF 值范圍為0～1，如EF=0.5 時，說明無立體選擇性；反之EF≠0.5，且偏離0.5 越多代表立體選擇性越強[14]。

式中：CS表示氯氟醚菌唑S體的殘留量，μg/kg；CR表示氯氟醚菌唑R體的殘留量，μg/kg。

1.5.2 一級動力學(xué)方程公式和半衰期 根據(jù)一級動力學(xué)方程公式 (2) 得到降解速率常數(shù)k，按 (3)式計算氯氟醚菌唑?qū)τ丑w半衰期t1/2。

式中：Ct表示采樣時間為t時分析物殘留量，μg/kg；C0表示施藥后分析物的初始?xì)埩袅?，μg/kg；k代表消解系數(shù)；t表示施藥后時間，d。

1.6 方法驗證

1.6.1 基質(zhì)效應(yīng) 基質(zhì)效應(yīng) (matrix effects，Me)

是指樣品中除分析物以外的所有成分對目標(biāo)物測量的綜合影響[15]。干擾成分影響目標(biāo)物離子化效率，增強或抑制待測物響應(yīng)，按 (4) 式計算參數(shù)Me，評價氯氟醚菌唑在不同水稻環(huán)境樣品中的基質(zhì)效應(yīng)。當(dāng)Me為正值時為基質(zhì)增強效應(yīng)，反之基質(zhì)減弱效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)在 -20%～20%之間為弱基質(zhì)效應(yīng)；在 -50%～-20%或20%～50%之間為中等基質(zhì)效應(yīng)；超過 -50%或50%為強基質(zhì)效應(yīng)[16]。

式中：km代表基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；ks代表溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

1.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制

溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線：將20 000 mg/L的氯氟醚菌唑標(biāo)準(zhǔn)樣品依次用甲醇稀釋成400 和8 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，并逐級稀釋成質(zhì)量濃度為0.2、0.1、0.05、0.01 、0.005 和0.001 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線：稱取空白樣品， 按 1.3.2 節(jié)方法進(jìn)行前處理后獲得空白基質(zhì)液，分別配制質(zhì)量濃度為0.2、0.1、0.05、0.01 、0.005 和0.001 mg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.3 添加回收試驗 取空白水稻植株、根系和土壤樣品進(jìn)行4 個水平 (5 、10 、100 和2 000 μg/kg)的添加回收試驗 (單一對映體為2.5 、5 、50 和1 000 μg/kg)，田水樣品進(jìn)行4 個水平 (0.5、1、10和20 μg/L) 的添加回收試驗 (單一對映體為0.25、0.5、5 和10 μg/L)，每檔濃度設(shè)置5 個平行。前處理方法同1.3.2 節(jié)，儀器條件同1.4 節(jié)進(jìn)行測定分析。對添加水平為100 和2 000 μg/kg 的水稻植株、根系和土壤樣品，以及添加水平為0.5、1、10 和20 μg/L 的田水樣品，定容后用甲醇稀釋至線性范圍內(nèi)再進(jìn)行儀器測定。以同步稀釋的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量分析，并計算氯氟醚菌唑?qū)τ丑w的添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)。

1.6.4 方法定量限 以滿足農(nóng)殘分析回收率要求的最低添加水平為方法定量限 (LOQ)[16]。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)顯著性分析采用SPSS 22 進(jìn)行：采用單因素方差分析 (ANOVA) 和 Dunnett 檢驗分析對照組與處理組之間的顯著性差異 (P＜0.05，表示差異顯著)；配對樣本T檢驗分析M 組與MP 組之間顯著性差異 (P＜0.05，表示差異顯著)。采用Graph-Pad 8.0.2 對數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 氯氟醚菌唑殘留分析方法

課題組前期已完成氯氟醚菌唑?qū)τ丑w的拆分及制備，并完成絕對構(gòu)型解析[4]。基于前期工作，本研究采用HPLC-MS/MS 確定了氯氟醚菌唑R體和S體在Chiralpak IG 柱上分離度為1.79，達(dá)到完全分離，且氯氟醚菌唑R體優(yōu)先出峰 (圖1)。氯氟醚菌唑R體和S體在水稻植株、根系、土壤和田水中基質(zhì)效應(yīng)范圍均在 -20%～20% 之間，為弱基質(zhì)效應(yīng)，因此可采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。

圖1 氯氟醚菌唑?qū)τ丑w典型色譜圖Fig. 1 Typical chromatogram of mefentrifluconazole enantiomers

在0.000 5～0.1 mg/L 范圍內(nèi)，氯氟醚菌唑R體和S體的峰面積與對應(yīng)的質(zhì)量濃度間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。氯氟醚菌唑R體線性方程：Y=21 208X+79 837 (R2=0.999 1)，氯氟醚菌唑S體線性方程為Y= 21 104X+ 75 161(R2= 0.999 2)。

在有微塑料但不施藥處理組 (P 組) 和空白對照組 (CK 組) 樣本分別添加氯氟醚菌唑后，回收試驗結(jié)果如表2 所示。P 組中，氯氟醚菌唑在水稻植株、根系、土壤和田水中平均回收率為75%～109%，RSD 為1.4%～13%；CK 組中平均回收率是76%～108%，RSD 為1.3%～12%。結(jié)果表明，P 組與CK 組氯氟醚菌唑?qū)τ丑w回收率無明顯差異，且均符合《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則》[17]要求。氯氟醚菌唑?qū)τ丑w在水稻植株、根系和土壤中的 LOQ 為2.5 μg/kg，在田水中的LOQ 為0.25 μg/L。

表2 氯氟醚菌唑?qū)τ丑w在樣品中的添加回收率 ( n＝5)Table 2 Recoveries of MFZ enantiomers in samples (n＝5)

2.2 氯氟醚菌唑?qū)τ丑w在土壤和水稻根系中的選擇性降解行為

施藥后28 d 內(nèi)M 組和MP 組土壤中氯氟醚菌唑R體和S體濃度總體呈上升趨勢 (圖2-A 和圖2-B)，在藥后21 d 達(dá)到殘留量最高值，M 組氯氟醚菌唑R體和S體殘留量分別為0.072 和0.073 mg/kg，MP 組分別為0.094 和0.096 mg/kg。EF 值隨施藥時間推移保持在0.50～0.52 范圍內(nèi) (圖2-C)，土壤中氯氟醚菌唑?qū)τ丑w之間無立體選擇性差異(P＞0.05)，且微塑料對氯氟醚菌唑?qū)τ丑w的立體選擇性環(huán)境行為無顯著影響 (P＞0.05)。MP 組土壤中氯氟醚菌唑R體和S體的含量分別高于M 組38.3%和39.3% (圖2-D)，表明土壤中微塑料對農(nóng)藥存在吸附作用，影響氯氟醚菌唑在土壤中的降解和生物轉(zhuǎn)化率。這與胡婷婷等[18]研究發(fā)現(xiàn)微塑料對環(huán)境中污染物的吸附作用結(jié)果一致。

圖2 氯氟醚菌唑?qū)τ丑w在土壤中殘留量 (A、B 和D) 以及EF 值變化曲線 (C)Fig. 2 Residue (A, B and D) and EF value (C) of MFZ enantiomers in soil

由圖3-A 和圖3-B 可以看出：M 組和MP 組水稻根系中氯氟醚菌唑?qū)τ丑w分別在7 和14 d 時殘留量達(dá)到最高值，隨后其殘留量變化趨于穩(wěn)定。隨施藥時間推移，氯氟醚菌唑?qū)τ丑w在水稻植株中的EF 值變化趨勢如 (圖3-C) 所示：水稻植株中氯氟醚菌唑?qū)τ丑w之間無立體選擇性差異(P＞0.05)，且微塑料對氯氟醚菌唑?qū)τ丑w的立體選擇性環(huán)境行為無顯著影響 (P＞0.05)。本研究施藥方式為葉面噴霧，氯氟醚菌唑從葉面和水體沉降到土壤表面和水稻根系并被吸附需要一定的過程[19]，待達(dá)到吸附平衡后濃度隨施藥時間趨于穩(wěn)定。MP 組氯氟醚菌唑?qū)τ丑w濃度變化趨于穩(wěn)定的時間比M 組明顯延長，其原因是微塑料在外部根表面和根冠上積累[20]，阻塞細(xì)胞壁孔來限制根系對水分的吸收及與土壤環(huán)境的交互作用[21]，并抑制根系生長、損害光合機制和抗氧化代謝[22]。

圖3 氯氟醚菌唑?qū)τ丑w在水稻根系中殘留量 (A、B 和D) 以及EF 值變化曲線 (C)Fig. 3 Residue (A, B and D) and EF value (C) of MFZ enantiomers in root

2.3 氯氟醚菌唑?qū)τ丑w在田水和水稻植株中的選擇性降解行為

氯氟醚菌唑?qū)τ丑w在田水和水稻植株中的降解動態(tài)曲線如 (圖4) 所示。M 組和MP 組中，田水樣本中氯氟醚菌唑R體、S體降解率分別為94.73%、94.23%和79.26%、78.84%；植株樣本中分別為97.04%、97.16%和92.25%、92.50%。結(jié)合施藥后28 d 內(nèi)EF 值變化趨勢 (圖4-C 和圖4-F) 發(fā)現(xiàn)，M 組和MP 組氯氟醚菌唑在田水和水稻植株中均無立體選擇性差異 (P＞0.05)，且微塑料對氯氟醚菌唑?qū)τ丑w的立體選擇性環(huán)境行為無顯著影響(P＞0.05)。然而Li 等[5]發(fā)現(xiàn)氯氟醚菌唑S體在黃瓜中優(yōu)先降解。生物體是一個復(fù)雜的手性環(huán)境，同一手性農(nóng)藥的對映體在不同的手性環(huán)境中通常會表現(xiàn)出不同的生理生化及環(huán)境行為[23]。Sun 等[24]發(fā)現(xiàn)茚蟲威在安徽和北京兩地甘藍(lán)中存在不同的選擇性降解行為，在北京地區(qū)甘藍(lán)中茚蟲威R體降解較快，而在安徽地區(qū)甘藍(lán)中茚蟲威S體優(yōu)先降解；王鳴華等[25]發(fā)現(xiàn)在大米中甲霜靈R體優(yōu)先降解，而在番茄和葡萄中甲霜靈S體優(yōu)先降解。

圖4 氯氟醚菌唑?qū)τ丑w在田水中降解曲線 (A 和B) 及EF 值變化曲線 (C) 和水稻植株中降解曲線 (D 和E) 及EF 值變化曲線 (F)Fig. 4 Degradation curve (A and B) and EF value (C) of MFZ enantiomers in paddy water and degradation curve (D and E)and EF value (F) of MFZ enantiomers in plant

氯氟醚菌唑?qū)τ丑w在田水和水稻植株中的降解規(guī)律符合一級反應(yīng)動力學(xué)方程，其降解方程及半衰期見表3。M 組和MP 組田水樣本中，氯氟醚菌唑R體、S體半衰期分別為6.7、6.7 d 和11.6、11.7 d，水稻植株中分別為7.5、7.4 d 和11.7、11.6 d。MP 組中田水和水稻植株中氯氟醚菌唑R體、S體的半衰期比M 組明顯延長，在田水中R體和S體分別延長73.1%和74.6%，在水稻植株中分別延長56.0%和56.8%。因微塑料對環(huán)境中殘留藥物具有吸附作用，且水稻根系具有向上輸導(dǎo)性[26]，導(dǎo)致水稻植株和田水中氯氟醚菌唑?qū)τ丑w半衰期的延長。

表3 氯氟醚菌唑?qū)τ丑w在田水和水稻植株中的降解方程及半衰期Table 3 Degradation equations and half-life of MFZ enantiomers in paddy water and plant

3 結(jié)論

本文基于HPLC-MS/MS 測定了盆栽模擬試驗施藥28 d 內(nèi)氯氟醚菌唑?qū)τ丑w在水稻植株、根系、土壤和田水中的殘留量，明確了氯氟醚菌唑?qū)τ丑w在水稻環(huán)境中的降解動態(tài)及其選擇性行為，以及微塑料對氯氟醚菌唑立體選擇性降解行為的影響。結(jié)果表明，氯氟醚菌唑?qū)τ钞悩?gòu)體在田水、土壤、水稻植株和水稻根系中的立體選擇性均無顯著差異。微塑料處理組研究結(jié)果表明，微塑料對氯氟醚菌唑?qū)τ丑w在水稻環(huán)境中的立體選擇性無明顯影響，但顯著延長了氯氟醚菌唑R體和S體在田水和水稻植株中的半衰期，增加手性農(nóng)藥氯氟醚菌唑殘留超標(biāo)風(fēng)險。本研究結(jié)果為氯氟醚菌唑?qū)τ钞悩?gòu)體的環(huán)境行為研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時也為微塑料對氯氟醚菌唑立體選擇性及降解動態(tài)的影響提供參考。

謹(jǐn)以此文慶賀中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)學(xué)科成立70 周年。

Dedicated to the 70th Anniversary of Pesticide Science in China Agricultural University.

作者簡介：

金銀銀，女，現(xiàn)為浙江農(nóng)林大學(xué)食品與健康學(xué)院在讀研究生。主要從事農(nóng)藥殘留分析檢測、新型污染物的環(huán)境行為等研究。

柴婷婷，女，2017 年畢業(yè)于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)專業(yè)獲得博士學(xué)位，現(xiàn)為浙江農(nóng)林大學(xué)食品與健康學(xué)院副教授。研究領(lǐng)域涉及新型污染物的環(huán)境行為、新型污染物環(huán)境毒理學(xué)研究等。近年來主持或參加國家自然科學(xué)基金、國家重點研發(fā)計劃、科技支撐計劃等多項科研項目的究工作。

崔峰，男，2018 年畢業(yè)于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)專業(yè)獲得博士學(xué)位，現(xiàn)為浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院講師。主要從事農(nóng)藥及新型污染物環(huán)境毒理學(xué)、農(nóng)藥生物活性評價等相關(guān)研究。近年來參與國家自然科學(xué)基金、國家重點研發(fā)計劃、浙江省重點研發(fā)計劃等多項科研項目的研究工作。