琥珀酸脫氫酶抑制劑類(lèi)殺菌劑抗性研究進(jìn)展

毛玉帥, 段亞冰,2, 周明國(guó)*,,2

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院 農(nóng)藥系，南京 210095；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)藥抗性與治理技術(shù)研究中心，南京 210095)

1965 年加拿大尤尼羅亞爾 (Uniroyal) 公司申請(qǐng)了氧硫雜芑順式丁烯酰替苯胺類(lèi)殺菌劑萎銹靈(carboxin，2,3-二氫-5-(N-甲酰苯胺)-6-甲基-1,4-氧硫雜芑) 的專(zhuān)利 (US1965451048)，并于1966 年商品化，用于種子和土壤處理，防治作物黑穗病。萎銹靈對(duì)擔(dān)子菌的專(zhuān)化性、內(nèi)吸輸導(dǎo)性和治療作用，引起了人們對(duì)其作用機(jī)制和克服其易被氧化及光解問(wèn)題的研究。1970 年美國(guó)蒙大拿州立大學(xué)的Mathre 發(fā)現(xiàn)萎銹靈的作用靶標(biāo)是呼吸鏈中的琥珀酸脫氫酶 (復(fù)合物II)，后來(lái)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，萎銹靈作用于琥珀酸脫氫酶B 亞基[1]。經(jīng)過(guò)20 多年的研究探索，至20 世紀(jì)80 年代中后期，日本住友化學(xué)株式會(huì)社、組合化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社、日產(chǎn)化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社分別開(kāi)發(fā)出呋吡菌胺(furametpyr)、滅銹胺 (mepronil) 和噻呋酰胺(thifluzamide)，并于90 年代商品化用于防治水稻紋枯病。此后，各大農(nóng)藥企業(yè)進(jìn)一步基于靶標(biāo)結(jié)構(gòu)生物學(xué)紛紛研發(fā)出結(jié)構(gòu)多樣、廣譜、高效、低毒、持效性長(zhǎng)的琥珀酸脫氫酶抑制劑 (succinate dehydrogenase inhibitors, SDHIs)，目前已經(jīng)成為繼麥角甾醇生物合成抑制劑類(lèi) (ergosterol biosynthesis inhibitors, EBIs) 和Qo 位點(diǎn)呼吸抑制劑類(lèi) (quinone outside inhibitors, QoIs) 之后，殺菌劑市場(chǎng)占有率第3 大的新型選擇性殺菌劑。但是，隨著SDHIs 殺菌劑的大量使用，多種植物病原真菌已經(jīng)對(duì)該類(lèi)藥劑產(chǎn)生了抗性，且抗性菌株在病原群體中的比例和抗性發(fā)生范圍不斷升高，如果不能及時(shí)采取抗藥性治理措施，必將影響這類(lèi)殺菌劑的使用壽命。2010 年，Avenot 綜述了SDHIs 殺菌劑的作用機(jī)制和抗性進(jìn)化機(jī)制[2]，2013 年，Sierotzki 綜述了SDHIs 殺菌劑的抗性研究進(jìn)展[3]。本文闡述SDHIs 殺菌劑的發(fā)展史及其作用機(jī)制，重點(diǎn)綜述植物病原真菌對(duì)該類(lèi)藥劑的抗性發(fā)生發(fā)展、抗性機(jī)制及抗性治理策略。

1 SDHIs 殺菌劑的開(kāi)發(fā)和分類(lèi)

SDHIs 是作用于細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合物II 的新型殺菌劑，因其化學(xué)結(jié)構(gòu)中均含有酰替苯胺活性基團(tuán)，又稱(chēng)酰替苯胺類(lèi)殺菌劑，根據(jù)酰胺鍵連接的官能團(tuán)不同又可細(xì)分為吡唑酰胺類(lèi)、吡啶酰胺類(lèi)、苯基酰胺類(lèi)等。SDHIs 殺菌劑屬線粒體呼吸鏈抑制劑，因真菌孢子萌發(fā)對(duì)能量及依賴(lài)能量代謝產(chǎn)生的小分子碳水化合物需求旺盛，以致SDHIs 殺菌劑對(duì)孢子萌發(fā)的抑制活性常常顯著高于對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制活性[4-5]。新型SDHIs 殺菌劑突破了早期開(kāi)發(fā)的SDHIs 殺菌劑如萎銹靈等有關(guān)生物學(xué)和理化性質(zhì)的局限性，不僅對(duì)擔(dān)子菌表現(xiàn)很高的抗菌活性，而且對(duì)多種子囊菌同樣表現(xiàn)高活性，且克服了易被氧化光解的缺點(diǎn)，可以噴施防治多種作物病害[6-7]。自巴斯夫于2003 年上市抗菌譜廣、活性高、環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)低、內(nèi)吸性和傳導(dǎo)性好的啶酰菌胺 (boscalid) 以后，各大農(nóng)藥公司紛紛投入大量精力和財(cái)力開(kāi)展了更加安全、高效、廣譜的新一代SDHIs 殺菌劑研發(fā)，并將其陸續(xù)商品化。如吡唑萘菌胺 (isopyrazam，2010 年，先正達(dá))、聯(lián)苯吡菌胺 (bixafen，2011 年，拜耳)、氟唑菌苯胺 (penflufen，2012 年，拜耳)、異丙噻菌胺(isofetamid，2015 年，日本石原)、氟唑菌酰羥胺(pydiflumetofen，2018 年，先正達(dá))、聯(lián)苯吡嗪菌胺 (pyraziflumid，2018 年，日本農(nóng)藥) 等陸續(xù)推向殺菌劑市場(chǎng) (表1)。

自然界也存在天然的與SDHIs 殺菌劑結(jié)構(gòu)類(lèi)似的活性物質(zhì)，如promysalin 是一種Pseudomonad aeruginosa的次生代謝物，具有抗菌活性，最初從植物根際中分離出來(lái)，親和蛋白圖譜 (affinitybased protein profiling) 鑒定表明，琥珀酸脫氫酶為該天然產(chǎn)物的生物學(xué)靶點(diǎn)[8]。目前，已經(jīng)有25 個(gè)SDHIs 類(lèi)殺菌劑品種進(jìn)入殺菌劑市場(chǎng)，此類(lèi)產(chǎn)品已成為殺菌劑市場(chǎng)銷(xiāo)售額增長(zhǎng)最為迅速的一類(lèi)藥劑，在重要植物病害的化學(xué)防控中發(fā)揮巨大作用。

已有研究表明，SDHIs 殺菌劑的結(jié)構(gòu)包括酸片段、胺片段和酰胺鍵連接部分[9-10]。結(jié)合國(guó)際殺菌劑抗性行動(dòng)委員會(huì) (Fungicide Resistance Action Committee, FRAC) 2021 年公布的SDHIs 殺菌劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)細(xì)分歸納于表1[11]。

表1 琥珀酸脫氫酶抑制劑類(lèi)殺菌劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)分類(lèi)Table 1 Classification of the chemical structure of succinate dehydrogenase inhibitors fungicides

在SDHIs 的結(jié)構(gòu)中，活性基團(tuán)為酰胺鍵 (氟唑菌酰羥胺為羥基酰胺鍵，氟唑菌酰羥胺在同類(lèi)藥劑中活性極其優(yōu)異，可能與酰胺鍵的改造有關(guān))，其余兩個(gè)基團(tuán)為改造基團(tuán)[12]。有研究表明，酰胺鍵與胺片段的距離對(duì)藥劑的活性有顯著影響[13]。此外，苯甲酰胺類(lèi)殺菌劑的氟吡菌胺 (fluopicolide)和我國(guó)自主研發(fā)的氟醚菌酰胺 (fluopimomide) 曾被認(rèn)為是SDHIs 殺菌劑，根據(jù)最新的研究結(jié)果，F(xiàn)RAC 將氟吡菌胺和氟醚菌酰胺的作用機(jī)制歸為作用于細(xì)胞骨架和馬達(dá)蛋白的delocalisation of spectrin-like proteins 亞類(lèi) (作用機(jī)制編碼為B5，抗性編碼為 #43)[11]。

2 SDHI 殺菌劑的應(yīng)用現(xiàn)狀

SDHIs 殺菌劑以其廣譜性在殺菌劑市場(chǎng)上占據(jù)了重要地位。在我國(guó)，SDHIs 殺菌劑在各類(lèi)糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物病害防治上均有登記[14]。部分藥劑的單劑登記現(xiàn)狀見(jiàn)表2。

表2 SDHIs 殺菌劑在中國(guó)的病害登記情況Table 2 Disease registration of SDHIs fungicides in China

SDHIs 殺菌劑主要登記用于擔(dān)子菌、子囊菌和半知菌引起的植物病害的化學(xué)防治。由于SDHIs 殺菌劑作用位點(diǎn)單一，抗性風(fēng)險(xiǎn)高，在產(chǎn)品登記上與其他產(chǎn)品復(fù)配成為了較好選擇。從目前上市的品種看，SDHIs 殺菌劑與主流的Qo 位點(diǎn)呼吸抑制劑類(lèi)和麥角甾醇生物合成抑制劑類(lèi)殺菌劑組合大大開(kāi)拓了應(yīng)用范圍和防治譜[14-15]。

3 SDHIs 殺菌劑抗性發(fā)生現(xiàn)狀

SDHIs 殺菌劑的固有抗性風(fēng)險(xiǎn)被FRAC 歸類(lèi)為中至高等。最早的SDHIs 殺菌劑抗性報(bào)道至少可追溯至1975 年，Gunatilleke 等在實(shí)驗(yàn)室條件下通過(guò)誘導(dǎo)試驗(yàn)獲得了萎銹靈抗性的構(gòu)巢曲霉Aspergillus nidulans菌株[16]。21 世紀(jì)以來(lái)，殺菌劑的抗性問(wèn)題逐漸引起人們的重視，與此同時(shí)SDHIs殺菌劑的應(yīng)用范圍也愈發(fā)廣泛，使用年限越來(lái)越長(zhǎng)，該類(lèi)藥劑的田間抗性問(wèn)題也逐漸加重[17]。目前，SDHIs 殺菌劑的抗性問(wèn)題已經(jīng)發(fā)生在多種病原菌上，涉及多個(gè)國(guó)家。在美國(guó)已檢測(cè)到開(kāi)心果腐爛病菌Alternariaalternata抗啶酰菌胺菌株，且對(duì)萎銹靈表現(xiàn)出正交互抗性[18]；番茄早疫病菌Alternaria solani抗SDHIs 菌株[19]、馬鈴薯早疫病菌A. solani抗啶酰菌胺和吡噻菌胺菌株等[20]。在巴西小麥麥瘟病菌Pyricularia oryzae中，已檢測(cè)到氟唑菌酰胺的抗性菌株[21]，菊花白銹病菌Puccinia horiana種群中也已經(jīng)檢測(cè)到SDHIs 殺菌劑抗性[22]。在歐洲，已發(fā)現(xiàn)多種病原菌對(duì)SDHIs殺菌劑產(chǎn)生抗性，如小麥殼針孢菌Zymoseptoria tritici、蘋(píng)果黑星病菌Venturia inaequalis、馬鈴薯早疫病菌A. solani、百合葉枯病菌Botrytis elliptica和油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum等[23]。在中國(guó)，小麥赤霉病菌Fusarium graminearum[24]、番茄灰霉病菌Botrytis cinerea[25]、桃腐爛病菌A.alternata[26]、黃瓜靶斑病菌Corynespora cassiicola[27]等病原菌中均已出現(xiàn)SDHIs 殺菌劑抗性種群。隨著SDHIs 殺菌劑使用年限和范圍的增加，抗藥性問(wèn)題呈現(xiàn)加重趨勢(shì)，延緩和治理SDHIs 殺菌劑的抗性已經(jīng)成為一個(gè)迫切需要解決的重要科學(xué)問(wèn)題。

4 SDHIs 殺菌劑抗性分子機(jī)制

4.1 靶標(biāo)基因點(diǎn)突變

植物病原真菌藥靶基因的遺傳分化決定了殺菌劑的選擇性，不同植物病原真菌藥靶基因編碼的氨基酸數(shù)量也存在一定差異。敏感的植物病原菌藥靶基因發(fā)生特異性突變可導(dǎo)致對(duì)殺菌劑產(chǎn)生不同水平的抗性。Mair 等建議，將所有的同類(lèi)型殺菌劑抗性點(diǎn)突變進(jìn)行規(guī)范化，統(tǒng)一命名，為殺菌劑靶標(biāo)蛋白突變提出了一個(gè)統(tǒng)一的氨基酸標(biāo)記系統(tǒng)，即不論實(shí)際位置如何，同源氨基酸位點(diǎn)都被賦予相同的數(shù)字，便于人們理解抗藥性位點(diǎn)[28]。線粒體復(fù)合物II 通常由SDHA、SDHB、SDHC 和SDHD4 個(gè)亞基組成，在已有的報(bào)道中，還未見(jiàn)SDHA亞基上出現(xiàn)抗藥性突變，已知主要的抗藥性突變位點(diǎn)集中在SDHB、SDHC、SDHD3 個(gè)亞基上。

隨著SDHIs 殺菌劑使用年限的增長(zhǎng)，有關(guān)其抗性報(bào)道也逐步增多。根據(jù)近年來(lái)的相關(guān)抗性機(jī)制研究報(bào)道和FRAC 統(tǒng)計(jì)結(jié)果，將植物病原菌的抗藥性突變基因型歸納于表3。

表3 植物病原菌與SDHIs 殺菌劑抗性相關(guān)的點(diǎn)突變基因型Table 3 Genotypes of plant pathogenic bacteria related to SDHIs fungicide resistance

近年來(lái)，F(xiàn)RAC 聯(lián)合巴斯夫、拜耳、科迪華、先正達(dá)、富美實(shí)、安道麥、住友集團(tuán)等企業(yè)在美國(guó)、巴西、歐洲等地區(qū)進(jìn)行了多種病原的抗性監(jiān)測(cè)工作，并逐年在FRAC 官網(wǎng)上發(fā)布結(jié)果[23]。在SDHB、SDHC和SDHD亞基上的抗藥性突變形式有很多，甚至同一物種中存在各種不同形式的抗藥性點(diǎn)突變基因型[17,29,37,50-55]。在以上突變中SDHB亞基的突變?cè)?57、267 或272 位由組氨酸突變?yōu)槔野彼?異亮氨酸/精氨酸，225 位脯氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔诙辔锓N中相對(duì)比較保守。但并非所有的田間突變都能引起藥敏性的變化，例如，小麥殼針孢菌田間抗藥性群體的突變BC266G、C-N33T、C-N34T 和C-L184W 已被驗(yàn)證與SDHIs 殺菌劑藥敏性無(wú)關(guān)[23]。本研究團(tuán)隊(duì)最新研究發(fā)現(xiàn)，核盤(pán)菌SDHB-A11V 突變并非是SDHIs殺菌劑抗性突變位點(diǎn)，而SDHB-P226L 突變能引起SDHIs 殺菌劑的中等水平抗性[38]。

在抗藥性進(jìn)化過(guò)程中，某些突變會(huì)伴隨一些生物適合度的下降，如生長(zhǎng)速率、致病力等[56-57]。此外，由于一些真菌的多核現(xiàn)象，雜合突變體的抗藥性一直無(wú)法準(zhǔn)確鑒定。我們?cè)陂_(kāi)展核盤(pán)菌 (多核絲狀真菌) 對(duì)SDHIs 殺菌劑抗性的相關(guān)研究中，通過(guò)人工點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建了SDHB-P226L 的點(diǎn)突變載體，并通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，同源置換野生菌株中的SDHB基因，獲得的轉(zhuǎn)化子多為雜合子，生物適合度低，進(jìn)一步對(duì)雜合子進(jìn)行藥劑馴化，獲得了點(diǎn)突變純合子菌株，抗藥性水平與生物適合度均顯著提高[38]。劉西莉研究團(tuán)隊(duì)在立枯絲核菌 (多核絲狀真菌) 的抗藥性研究中，對(duì)雜合體抗藥性突變菌株進(jìn)行藥劑馴化，完成了雜合子純合化的遺傳變異，演化了真菌的抗藥性進(jìn)化過(guò)程[30]。Bart 研究團(tuán)隊(duì)建立了一套系統(tǒng)的劑量依賴(lài)型殺菌劑抗性誘導(dǎo)技術(shù)，用于評(píng)估SDHIs 殺菌劑的抗性風(fēng)險(xiǎn)[33]。

4.2 SDHIs 殺菌劑的非靶標(biāo)抗性

Yamashita 等率先在小麥殼針孢菌上報(bào)道了SDHIs 殺菌劑的非靶標(biāo)抗性[58]。在歐洲采集的田間小麥殼針孢病原群體中發(fā)現(xiàn)了可以穩(wěn)定遺傳的抗藥性菌株，但在其SDHA、SDHB、SDHC和SDHD亞基上并未檢測(cè)到抗藥性突變位點(diǎn)。在交互抗性測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，此種抗性僅僅存在于包括氟吡菌酰胺和異丙噻菌胺在內(nèi)的部分長(zhǎng)雜環(huán)酰胺類(lèi)SDHIs 殺菌劑，而對(duì)聯(lián)苯吡菌胺和氟唑菌酰胺等其他酰胺類(lèi)SDHI 殺菌劑無(wú)正交互抗性[58]。非靶標(biāo)抗藥性菌株和相同作用靶標(biāo)的殺菌劑之間無(wú)交互抗性的發(fā)現(xiàn)，引起了人們對(duì)SDHIs 殺菌劑抗性與藥劑靶標(biāo)的深入思考和探究。

通常情況下，靶標(biāo)基因的突變和過(guò)表達(dá)是其對(duì)殺菌劑產(chǎn)生抗性的主要原因，但目前尚未有因琥珀酸脫氫酶相關(guān)亞基基因過(guò)表達(dá)而引起抗藥性的相關(guān)研究。然而，Mae 等發(fā)現(xiàn)在小麥殼針孢菌中，MFS1(major facilitator superfamily) 啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)座子插入引起了其對(duì)SDHIs 殺菌劑的抗性[59]；Sang 等在對(duì)氟吡菌酰胺不敏感的大豆猝倒病菌Fusarium virguliforme菌株中，發(fā)現(xiàn)了MFS轉(zhuǎn)運(yùn)體基因過(guò)量表達(dá)，同時(shí)，在酵母系統(tǒng)中，通過(guò)異源表達(dá)驗(yàn)證了這種耐藥性[60]。這種耐藥性產(chǎn)生的原因?yàn)橥庠葱晕镔|(zhì)解毒相關(guān)基因過(guò)表達(dá)，引起細(xì)胞對(duì)藥劑的外排作用增強(qiáng)，從而降低了殺菌劑的毒力。

4.3 長(zhǎng)雜環(huán)酰胺類(lèi)(stretch heterocycle amide,SHA)SDHIs 與普通SDHIs 殺菌劑的抗性差異

本研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，從黃瓜上分離的多主棒孢C. cassiicola發(fā)生了SDHB-H278R 點(diǎn)突變，導(dǎo)致其對(duì)啶酰菌胺產(chǎn)生抗性，但對(duì)SDHIs 殺菌劑氟吡菌酰胺 (屬于長(zhǎng)雜環(huán)酰胺亞類(lèi)) 不存在交互抗性。張曉珂等發(fā)現(xiàn)，在灰霉病菌中，氟吡菌酰胺與啶酰菌胺之間無(wú)交互抗性[61]。Ishii 等發(fā)現(xiàn)，在多主棒孢和瓜類(lèi)白粉病菌Podosphaera xanthii中，對(duì)啶酰菌胺 (非雜環(huán)酰胺亞類(lèi)) 和吡噻菌胺 (非長(zhǎng)雜環(huán)酰胺亞類(lèi)) 的抗性菌株對(duì)氟吡菌酰胺并未表現(xiàn)出交互抗性[62]。這些研究結(jié)果表明，病原菌對(duì)長(zhǎng)雜環(huán)酰胺亞類(lèi)SDHIs 與普通SDHIs 的抗性機(jī)制存在差異。

Steinhauer 等以“產(chǎn)生非靶標(biāo)抗藥性的小麥殼針孢菌”為研究材料，探究了同類(lèi)SDHIs 殺菌劑無(wú)交互抗性的原因[63]。通過(guò)正向遺傳學(xué)技術(shù)分析得到，小麥殼針孢菌Z. tritici部分種群中存在多個(gè)SDHC同源基因；并結(jié)合反向遺傳學(xué)技術(shù)，揭示了小麥殼針孢菌非靶標(biāo)抗藥性產(chǎn)生的原因是由于SDHC3基因的存在，且抗性水平和SDHC3的表達(dá)水平及選擇性剪切效率的差異有關(guān)；同時(shí)，SDHC3啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)座子插入也介導(dǎo)了SHASDHI 殺菌劑的抗性。有趣的是，SDHC3的存在僅對(duì)SHA-SDHI 殺菌劑表現(xiàn)抗性，對(duì)其他非SHASDHI 殺菌劑并未表現(xiàn)出抗性，點(diǎn)突變策略和分子對(duì)接也進(jìn)一步證實(shí)了SDHC3 為SHA-SDHI 殺菌劑的藥劑靶標(biāo)[63]。這一發(fā)現(xiàn)從分子角度揭示了“藥-靶”互作機(jī)理，豐富了當(dāng)前的SDHIs 殺菌劑的抗性機(jī)制研究。

4.4 SDHC 亞基遺傳分化對(duì)SDHIs 殺菌劑敏感性的調(diào)控研究

有趣的是，在不同的植物病原真菌中，琥珀酸脫氫酶的C 亞基可遺傳分化為多個(gè)亞型，且調(diào)控著病原菌對(duì)SDHIs 殺菌劑的敏感性。邵文勇等發(fā)現(xiàn)在灰霉病菌B. cinerea中，存在5 種不同的SDHC分化亞型，不同亞型的灰霉病菌對(duì)SDHIs殺菌劑的敏感性存在一定差異[64]?；颐共【鶶DHC不同亞型的遺傳分化，可能是在SDHIs 殺菌劑的選擇壓下導(dǎo)致的。然而在核盤(pán)菌S. sclerotiorum中，SDHC亞型的遺傳分化似乎與其對(duì)SDHIs 殺菌劑敏感性并無(wú)聯(lián)系，本研究團(tuán)隊(duì)在核盤(pán)菌中發(fā)現(xiàn)SDHC亞基存在兩種亞型，兩者存在11 個(gè)氨基酸的差異，在田間病原群體的比例約為7 : 3，但核盤(pán)菌SDHC亞基遺傳分化的兩種亞型對(duì)SDHI殺菌劑的藥敏性并無(wú)顯著差異[38,65]。

Steinhauer 等發(fā)現(xiàn)，小麥殼針孢菌Z. tritici SDHC遺傳分化為3 個(gè)亞基 (SDHC1、SDHC2、SDHC3)，并證實(shí)SDHC3是SHA-SDHI 殺菌劑的藥劑靶標(biāo)[63]。李美霞發(fā)現(xiàn)，在小麥赤霉病菌中存在兩個(gè)不同SDHC亞基 (SDHC1和SDHC2)，共同調(diào)控著該菌株對(duì)SDHIs 殺菌劑的敏感性[66]。當(dāng)SDHC1敲除時(shí)，小麥赤霉病菌對(duì)SDHIs 殺菌劑的敏感性顯著增加，表現(xiàn)出超敏感；而當(dāng)SDHC2敲除時(shí)，則其敏感性顯著降低，表現(xiàn)出抗藥性。此種調(diào)控機(jī)制，正如苯并咪唑類(lèi)殺菌劑藥靶基因β-tubulin在小麥赤霉病菌中的遺傳分化，β1-tubulin負(fù)調(diào)控其對(duì)微管蛋白抑制劑的抗性，而β2-tubulin正調(diào)控其對(duì)微管蛋白抑制劑的抗性[67]。這種藥靶基因遺傳分化對(duì)SDHIs 殺菌劑的敏感性表現(xiàn)出雙向調(diào)控的現(xiàn)象，暗示了SDHC1，SDHC2可能競(jìng)爭(zhēng)性地參與或調(diào)控著琥珀酸脫氫酶復(fù)合體的結(jié)構(gòu)形成，但其調(diào)控方式仍需通過(guò)蛋白質(zhì)互作與結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證。

5 SDHIs 殺菌劑抗性檢測(cè)/監(jiān)測(cè)方法

隨著具有單一作用位點(diǎn)的現(xiàn)代選擇性殺菌劑的飛速發(fā)展，抗藥性問(wèn)題已成為必然。因此，開(kāi)展抗藥性檢測(cè)/監(jiān)測(cè)研究，不僅能實(shí)現(xiàn)植物病原菌的抗藥性流行預(yù)警，而且可指導(dǎo)植物病害防控的精準(zhǔn)選藥和科學(xué)施藥，保障我國(guó)的農(nóng)藥減量與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全?？顾幮詸z測(cè)/監(jiān)測(cè)技術(shù)是隨著現(xiàn)代選擇性殺菌劑的問(wèn)世不斷發(fā)展起來(lái)的，可以分為以下3 個(gè)階段：

第1 階段是傳統(tǒng)的生物測(cè)定法，通過(guò)藥劑對(duì)菌絲生長(zhǎng)或孢子萌發(fā)抑制的差異來(lái)判定菌株是否具有抗藥性，通過(guò)大量的抗性監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)和藥敏性測(cè)定結(jié)果優(yōu)化出區(qū)分劑量，用該方法篩選抗性菌株可減少工作量，如：桃腐爛病菌A. alternata等對(duì)SDHIs 殺菌劑的抗性檢測(cè)[68]。該方法需要經(jīng)過(guò)菌株的分離、純化和培養(yǎng)，需在含藥平板上進(jìn)行抗藥性檢測(cè)，由于工作量大、周期長(zhǎng)、效率低、檢測(cè)成本高，以致檢測(cè)的菌株數(shù)量有限，往往在檢測(cè)到抗性菌株時(shí)，病原菌群體中抗藥性菌株的比例已經(jīng)達(dá)到1%以上，在短期內(nèi)即可造成抗藥性病害流行，導(dǎo)致突發(fā)性危害的發(fā)生[69]。

第2 階段主要是基于藥靶基因突變后與野生菌株的核酸序列差異而開(kāi)發(fā)的分子檢測(cè)方法。這一階段的檢測(cè)技術(shù)往往以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)為基礎(chǔ)，最為有效、直接、準(zhǔn)確的方式是通過(guò)擴(kuò)增靶基因序列并測(cè)序，分析突變位點(diǎn)?；谛蛄胁町?，利用限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增后的多態(tài)性核酸序列進(jìn)行裂解，進(jìn)而進(jìn)行電泳分析。這種方法相對(duì)于測(cè)序的成本大大降低，被廣泛用來(lái)進(jìn)行抗藥性突變檢測(cè)。其中，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 (RFLP，restriction fragment length polymorphism) 方法被用于檢測(cè)開(kāi)心果晚疫病菌A.alternata、多寄主灰霉病菌B. cinerea對(duì)SDHIs殺菌劑抗性的點(diǎn)突變[57,70]。裂解擴(kuò)增多態(tài)性序列(CAPS，cleaved amplified polymorphic sequence)被用于Clarireedia屬SDHIs 殺菌劑抗性的檢測(cè)[71]。等位基因PCR (AS-PCR，allele specific PCR) 被用于A. alternata對(duì)SDHIs 的抗性檢測(cè)[43]。一種基于PCR 的高分辨率溶解曲線法 (HRM，high-resolution melting) 用來(lái)檢測(cè)灰霉病菌B. cinerea SDHBH272R/Y 序列變化[72]。這一階段的抗藥性分子檢測(cè)技術(shù)，能夠在幾小時(shí)內(nèi)鑒定或診斷菌株的抗藥性，高通量定量PCR 技術(shù)能夠在病原群體中檢出萬(wàn)分之一至十萬(wàn)分之一的抗藥性基因頻率，實(shí)現(xiàn)抗藥性早期預(yù)警，解決了抗藥性病害突發(fā)和防控措手不及的問(wèn)題[73]。但是，該階段的檢測(cè)技術(shù)需要昂貴的儀器和高級(jí)技術(shù)人員才能完成，仍然限制技術(shù)的推廣應(yīng)用。

第3 階段是基于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù) (loopmediated isothermal amplification, LAMP)而發(fā)展的新的快速分子檢測(cè)方法。本研究團(tuán)隊(duì)創(chuàng)造性地研究了基因擴(kuò)增引物的堿基錯(cuò)配技術(shù)，率先發(fā)明了可診斷藥靶基因單堿基突變的LAMP 抗藥性高通量快速檢測(cè)技術(shù)[74]，借助LAMP技術(shù)，在檢測(cè)水平上實(shí)現(xiàn)了質(zhì)的飛躍。2014 年，本研究團(tuán)隊(duì)率先將LAMP 技術(shù)結(jié)合到植物病原菌抗藥性檢測(cè)方面，并開(kāi)發(fā)了一系列配套技術(shù)，大大革新了病原菌抗藥性的的檢測(cè)技術(shù)[75-78]。此后，針對(duì)SDHIs殺菌劑抗性位點(diǎn)的LAMP 檢測(cè)技術(shù)也被開(kāi)發(fā)[79-81]。LAMP 檢測(cè)技術(shù)無(wú)需昂貴的儀器設(shè)備和繁瑣的試驗(yàn)操作過(guò)程，檢測(cè)靈敏度與檢測(cè)效率得到進(jìn)一步提高。相應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)已開(kāi)發(fā)為快速檢測(cè)試劑盒，解決了檢測(cè)的時(shí)空限制問(wèn)題，檢測(cè)條件極度簡(jiǎn)化，田間地頭即可快速檢測(cè)。一臺(tái)水浴鍋或恒溫箱反應(yīng)1 h，即可通過(guò)肉眼觀察樣品顏色差異來(lái)判斷結(jié)果，簡(jiǎn)便快捷，非常適合田間快速診斷，但該方法仍然存在著只能對(duì)抗藥性進(jìn)行定性分析的缺陷。目前，本研究團(tuán)隊(duì)正在研發(fā)新一代LAMP 抗藥性定量快速分子檢測(cè)技術(shù)，若該技術(shù)研發(fā)成功，有望將抗藥性檢測(cè)效率再提高100 倍以上，檢測(cè)成本降低至1%，未來(lái)的定量快速分子檢測(cè)技術(shù)十分令人期待。

6 SDHIs 殺菌劑抗性風(fēng)險(xiǎn)與治理

FRAC 將SDHIs 殺菌劑的固有抗性風(fēng)險(xiǎn)列為中至高等抗性風(fēng)險(xiǎn)。長(zhǎng)期單一使用SDHIs 殺菌劑，植物病原真菌對(duì)其極易產(chǎn)生抗性。盡管病原菌的SDHIs 殺菌劑靶標(biāo)基因存在低、中、高水平抗藥性基因型，但同一種SDHIs殺菌劑的連續(xù)使用和加量使用，會(huì)殺死或抑制敏感和低抗水平的病原菌，加速形成中、高水平抗藥性群體，使SDHIs 殺菌劑失效。因此，延緩或阻止抗藥性群體發(fā)展是抗藥性治理的重要目標(biāo)。

由于藥靶基因在不同的病原菌中存在分化，并存在不同的保守型，因此，在殺菌劑進(jìn)入田間防治前，應(yīng)建立敏感性基線和開(kāi)展抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，為科學(xué)用藥和抗性監(jiān)測(cè)提供科學(xué)依據(jù)。目前已有報(bào)道中，SDHIs 殺菌劑抗性菌株的抗性水平主要為中、低水平抗性，相較敏感群體，EC50值倍數(shù)在5～30 之間，此種抗性水平在藥劑選擇下有利于抗性群體的發(fā)展。

病原菌對(duì)殺菌劑發(fā)生抗性變異后的適合度是影響抗性群體發(fā)展的重要因素。桃腐爛病菌A.alternata SDHD-D123E 點(diǎn)突變的抗性菌株，產(chǎn)孢量下降，在氧化應(yīng)激壓力下生長(zhǎng)速率降低[26]，說(shuō)明在沒(méi)有藥劑選擇壓下，抗藥性病菌在群體中的比例會(huì)下降。然而，馬鈴薯葉枯病菌A. alternata和A. solani攜帶SDHB-H277Y/R 和SDHD-D123E點(diǎn)突變菌株，無(wú)明顯適合度變化[51]，草莓灰霉病菌B. cinerea攜帶SDHB-H272R/Y/L、SDHB-P225F和SDHB-N230I 點(diǎn)突變的菌株，也無(wú)明顯適合度變化[82]。大多數(shù)研究表明，SDHIs 殺菌劑抗性病原菌的適合度與野生敏感群體相比，并無(wú)明顯下降，說(shuō)明在藥劑選擇下，抗藥性病原群體會(huì)發(fā)展較快。在殺菌劑進(jìn)入田間應(yīng)用以后，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)/檢測(cè)田間病原菌的抗藥性發(fā)生動(dòng)態(tài)，對(duì)于抗藥性早期預(yù)警、儲(chǔ)備抗藥性治理技術(shù)、評(píng)價(jià)抗藥性治理策略及技術(shù)的有效性等具有重要意義。

抗藥性病害流行不僅取決于抗藥性菌株在群體中的比例，更取決于抗藥性病原菌的絕對(duì)數(shù)量。當(dāng)病原菌群體在自然界的數(shù)量巨大時(shí)，即使抗藥性病菌未成為優(yōu)勢(shì)種群，在藥劑防治時(shí)剩下的抗藥性病菌也足以引起病害流行。因此，能夠降低藥劑選擇壓，如利用抗病品種、生物防治等病害綜合防治策略均有利于延緩抗藥性群體發(fā)展。Samaras 等發(fā)現(xiàn)，生防菌Bacillus amyloliquefaciens在與氟吡菌酰胺的交替使用中對(duì)灰霉病菌表現(xiàn)出較高的抑制作用，并降低了SDHIs 類(lèi)殺菌劑的抗性頻率[83]。病害發(fā)生嚴(yán)重度直接關(guān)系到病原群體的發(fā)展，凡是有利于降低病害壓力的農(nóng)藝措施，如田園衛(wèi)生及通風(fēng)透光等栽培措施均是抗藥性治理策略與技術(shù)的重要組成部分。

SDHIs 殺菌劑種類(lèi)多，結(jié)構(gòu)差異大，盡管FRAC 給予了這些殺菌劑相同的抗性分類(lèi)編碼(#7)，屬于同一交互抗性組，但是目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些病原菌對(duì)長(zhǎng)雜環(huán)酰胺類(lèi)SDHIs 殺菌劑和普通SDHIs 殺菌劑并無(wú)交互抗性。因此作者認(rèn)為，在明確所防治的病原群體對(duì)SDHIs 殺菌劑之間存在交互抗性條件下，或可考慮混用或輪用不同亞類(lèi)的SDHIs 殺菌劑或以不同類(lèi)型SDHI 殺菌劑來(lái)緩解SDHIs 殺菌劑抗性[58,63]。

在推薦SDHIs 殺菌劑與其他作用機(jī)制的藥劑(QoIs 殺菌劑和EBIs 殺菌劑) 以復(fù)配的方式使用時(shí)，不僅應(yīng)該遵循增效原則和無(wú)藥害原則，而且必須考慮是否有利于抗藥性治理[84]。不同作用方式的殺菌劑如果存在相同的抗藥性機(jī)制也不應(yīng)該混合使用，如相同的增加藥劑外排抗性機(jī)制、相同化學(xué)基團(tuán)的降解與解毒機(jī)制等。值得注意的是，那些抗性機(jī)制和作用方式不同的兩種高抗性風(fēng)險(xiǎn)殺菌劑也應(yīng)謹(jǐn)慎混合使用，防止在短時(shí)間內(nèi)病原菌對(duì)兩種殺菌劑均產(chǎn)生抗性，枯竭有效的殺菌劑資源，如使用SDHIs殺菌劑與QoIs 殺菌劑混劑防治蔬菜灰霉病，很快會(huì)使灰霉菌對(duì)這兩種類(lèi)型的殺菌劑產(chǎn)生高水平抗性群體[46]。

研發(fā)作用機(jī)制新穎、沒(méi)有交互抗性的新型殺菌劑是治理抗藥性的根本措施。針對(duì)藥靶變異的生物學(xué)信息設(shè)計(jì)和創(chuàng)制反抗性殺菌劑，對(duì)于治理重要?dú)⒕鷦┓肿影袠?biāo)抗性具有重要價(jià)值。然而，利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)挖掘和發(fā)現(xiàn)殺菌劑新的分子靶標(biāo)、發(fā)現(xiàn)調(diào)控藥-靶互作的關(guān)鍵蛋白、解析和發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)蛋白新的藥敏性結(jié)構(gòu)域等，是靶向新型殺菌劑和靶向增效劑創(chuàng)制的理論基礎(chǔ)。

7 展望

當(dāng)前，SDHIs 殺菌劑在全球殺菌劑市場(chǎng)中仍處于上升期，SDHIs 殺菌劑仍有廣闊的市場(chǎng)需求，因此開(kāi)展SDHIs 殺菌劑的抗性研究，對(duì)于延緩其抗藥性發(fā)展速度，開(kāi)發(fā)新型高活性的SDHIs殺菌劑仍具有重要意義。同時(shí)當(dāng)前的SDHIs 殺菌劑與植物病原菌藥劑靶標(biāo)之間的研究結(jié)果也加深了人們對(duì)藥靶互作的理解，豐富了SDHIs 殺菌劑的作用機(jī)制研究，為SDHIs 殺菌劑的反抗性藥劑或者難以產(chǎn)生抗性的新藥劑研發(fā)提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)[85]。自然界天然的與SDHIs 殺菌劑結(jié)構(gòu)類(lèi)似的活性物質(zhì)，與當(dāng)前的酰胺類(lèi)殺菌劑具有不同化學(xué)結(jié)構(gòu)，這也啟發(fā)了科學(xué)家開(kāi)展新型SDHIs 殺菌劑的研發(fā)[8]，同時(shí)也從側(cè)面印證了SDHIs 殺菌劑的環(huán)境安全性。此外，通過(guò)修飾和改造現(xiàn)有殺菌劑，研發(fā)高選擇性、高活性、高安全性、低風(fēng)險(xiǎn)的SDHIs 殺菌劑仍在進(jìn)行，各種抗藥性檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展也為SDHIs 殺菌劑的抗藥性監(jiān)測(cè)提供了技術(shù)保障。可以預(yù)見(jiàn)，SDHIs 殺菌劑仍將在未來(lái)的農(nóng)藥市場(chǎng)中發(fā)揮中流砥柱的作用。

謹(jǐn)以此文慶賀中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)學(xué)科成立70 周年。

Dedicated to the 70th Anniversary of Pesticide Science in China Agricultural University.

作者簡(jiǎn)介：

毛玉帥，男，2018 年畢業(yè)于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，獲農(nóng)學(xué)學(xué)士學(xué)位。2020 年畢業(yè)于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，獲農(nóng)學(xué)碩士學(xué)位，同年，于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院農(nóng)藥系師從周明國(guó)教授繼續(xù)攻讀博士學(xué)位，主要從事殺菌劑生物學(xué)及植物病原菌抗藥性研究。

周明國(guó)，男，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)教授。1982 年畢業(yè)于南京農(nóng)學(xué)院(現(xiàn)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)) 并留校工作，1999 年獲中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位。主要從事殺菌劑生物學(xué)和農(nóng)作物病害防控理論與技術(shù)研究?，F(xiàn)任國(guó)際植物病理學(xué)會(huì)病害控制委員會(huì)組委、中國(guó)農(nóng)藥發(fā)展與應(yīng)用協(xié)會(huì)殺菌劑專(zhuān)業(yè)委員會(huì)主任委員及《農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)》編委。1990 年和1993 年分別入選歐盟為中國(guó)培養(yǎng)100 名博士后和25 名跟蹤培養(yǎng)人才計(jì)劃，1 9 9 8 年享受?chē)?guó)務(wù)院特殊津貼。先后主持完成歐盟、UNIDO、ICGEB 政府性及先正達(dá)、巴斯夫農(nóng)藥企業(yè)的重大國(guó)際合作項(xiàng)目和國(guó)家973 課題、863 和948 項(xiàng)目、行業(yè)專(zhuān)項(xiàng)、國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)及面上項(xiàng)目及省部級(jí)科技項(xiàng)目近30 項(xiàng)。獲國(guó)家科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)3 項(xiàng)（第1 完成人2 項(xiàng)，第3 完成人1 項(xiàng)），光華工程科技獎(jiǎng)、江蘇省專(zhuān)利發(fā)明人獎(jiǎng)、中國(guó)農(nóng)藥工業(yè)協(xié)會(huì)農(nóng)藥創(chuàng)新獎(jiǎng)突出貢獻(xiàn)獎(jiǎng)等。發(fā)表研究論文400 余篇，獲國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利45 件，國(guó)際專(zhuān)利7 件。