不同劑量鈣敏感受體抑制劑對(duì)磨損顆粒誘導(dǎo)小鼠骨溶解及炎癥因子表達(dá)的影響

鐘艷春 葉勇軍 劉午陽(yáng)

贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科，江西贛州 341000

有限的使用壽命是人工關(guān)節(jié)置換手術(shù)最大的缺陷，產(chǎn)生這一缺陷的主要原因是術(shù)后出現(xiàn)的關(guān)節(jié)假體無(wú)菌性松動(dòng)。目前，對(duì)于人工關(guān)節(jié)無(wú)菌性松動(dòng)，非手術(shù)治療療效差，最終均需行翻修手術(shù)，而翻修手術(shù)費(fèi)用昂貴，創(chuàng)傷大，術(shù)后并發(fā)癥多，給患者帶來(lái)巨大痛苦。因此，探索出更安全有效的人工關(guān)節(jié)無(wú)菌性松動(dòng)防治方法意義重大。鈣敏感受體（calcium-sensing receptor，CaSR）是一種細(xì)胞表面受體，屬于G 蛋白偶聯(lián)受體家族。研究發(fā)現(xiàn)，CaSR 參與了多種骨關(guān)節(jié)炎癥疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，如骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，通過(guò)抑制CaSR 可以有效減輕炎癥反應(yīng)。 同時(shí)，CaSR 還在單核細(xì)胞、破骨細(xì)胞等多種細(xì)胞的成熟、分化及凋亡中起重要調(diào)控作用。 磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解也是一種炎癥性骨溶解過(guò)程，而通過(guò)抑制CaSR 是否可以減輕磨損顆粒誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及骨溶解，目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立人工關(guān)節(jié)無(wú)菌性松動(dòng)小鼠顱骨模型，給予不同濃度CaSR 抑制劑（NPS2390）干預(yù)后，觀察其對(duì)磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解及炎癥因子表達(dá)的影響，為人工關(guān)節(jié)無(wú)菌性松動(dòng)的防治提供新思路。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40 只8～10 周齡C57BL/6J 雄性小鼠，體重19～22 g，購(gòu)于上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限責(zé)任公司，許可證號(hào)碼：SCXK（滬）2017-0005，飼養(yǎng)于SPF 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房?jī)?nèi)。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審核通過(guò)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合醫(yī)學(xué)倫理規(guī)范（倫理審批號(hào)：ABRLLSC2021-0112）。

1.2 主要儀器及試劑

磨損顆粒：取人工髖關(guān)節(jié)翻修術(shù)取出的金屬關(guān)節(jié)假體柄，參照前期研究文獻(xiàn)制備（激光粒度儀分析顯示： 顆粒平均粒徑2.93 μm，98%顆粒粒徑＜6.67 μm，主要成分為鈦、銅、鉻）。 CaSR 抑制劑NPS2390（美國(guó)Sigma 公司，226878-01-09）； 小鼠白細(xì)胞介素-1β（in terleukin-1β，IL-1β）ELISA 檢測(cè)試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，JL18442）；小鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 檢測(cè)試劑盒 （上海江萊生物科技有限公司，JL10484）；抗酒石酸酸性染色液（solarbio 公司，G1942）；Micro-CT（SCANCO MEDICAL，瑞士，vivaCT40）；圖像分析軟件（Image-Pro Plus 6.0）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理

1.3.1 磨損顆粒制備 將制備的磨損顆粒用75%乙醇溶液沖洗并浸泡48 h 后，生理鹽水反復(fù)清洗。 經(jīng)鱟試劑盒檢測(cè)內(nèi)毒素含量小于0.02 EU/ml 后， 采用PBS配制成濃度為600 mg/ml 顆粒懸液備用。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將40 只8～10 周齡C57BL/6J 雄性小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分成空白對(duì)照組、 顆粒組、低劑量治療組、高劑量治療組，每組10 只。

1.3.3 磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解顱骨模型建立 所有分組后小鼠按照400 mg/kg 的劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，剪去小鼠顱頂部毛發(fā)，碘伏消毒三遍皮膚后，以小鼠外耳根內(nèi)側(cè)部連線中點(diǎn)為中心，作一經(jīng)顱正中矢狀線長(zhǎng)約0.5 cm 的手術(shù)切口，逐層切開皮膚、皮下組織，剝離顱骨骨膜，于顆粒組、低劑量治療組、高劑量治療組小鼠骨膜下植入30 mg（50 μl）預(yù)先配備好的關(guān)節(jié)假體磨損顆粒懸浮液，空白對(duì)照組以等量PBS 溶液替代。 3-0 絲線縫合手術(shù)切口，檢查切口無(wú)漏液后碘伏消毒切口，手術(shù)結(jié)束。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)干預(yù)及建模成功的標(biāo)準(zhǔn) 建模手術(shù)后第2天開始，低劑量治療組、高劑量治療組小鼠分別隔日接受0.2、2.0 mg/kg NPS2390 腹腔注射； 空白對(duì)照組和顆粒組以等量生理鹽水替代，干預(yù)持續(xù)14 d。 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，仔細(xì)觀察各組小鼠頭部術(shù)口，進(jìn)食及活動(dòng)情況，以及小鼠顱頂磨損顆粒懸浮液有無(wú)外漏。小鼠在處死前，術(shù)口無(wú)紅腫、滲液、流膿，無(wú)磨損顆粒外漏，進(jìn)食及活動(dòng)正常，屬模型建立成功。

1.3.5 標(biāo)本采集 藥物干預(yù)14 d 后處死各組小鼠，去除顱底組織及顱骨表面植入磨損顆粒。 行Micro-CT檢測(cè)后將每組標(biāo)本分2 份，一份顱骨用10%的甲醛固定，用于組織學(xué)檢測(cè)，一份放置2 ml DMEM 培養(yǎng)基浸泡24 h，取上清檢測(cè)炎癥因子含量。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.4.1 Micro-CT 檢測(cè) 將Micro-CT 參數(shù)設(shè)定為：X線能量70 kV，200 μA， 掃面層厚20 μm， 激發(fā)時(shí)間300 ms。 獲得斷層圖像后對(duì)顱蓋骨進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)重建。在顱蓋骨標(biāo)本正中央選取5 mm的正方形區(qū)域進(jìn)行骨礦物質(zhì)密度、骨孔隙率和骨體積分?jǐn)?shù)檢測(cè)。

1.4.2 HE 染色 標(biāo)本中性甲醛固定24 h， 流水沖洗后放置10%乙二胺四乙酸中脫鈣， 每3 天更換浸泡液1次，直至顱骨變軟，細(xì)針能輕易穿透為止。 標(biāo)本經(jīng)脫水、石蠟包埋，切片，片厚5 μm，HE 染色。通過(guò)顯微鏡在200×下觀察顱骨HE 染色切片并拍照。 使用美國(guó)Image-Pro Plus 軟件分析正中矢狀線區(qū)域骨面積。

1.4.3 TRAP 染色 TRAP 標(biāo)本經(jīng)脫水浸蠟包埋后切成4～5 μm 厚切片，放入TRAP 固定液4℃固定3 min，清水沖洗。再將切片放入TRAP 孵育液中置于37℃溫箱染色60 min，水洗。最后，蘇木素染色液中染色5 min，水洗。 通過(guò)顯微鏡在200×下觀察顱骨TRAP 染色切片并拍照，將細(xì)胞染成暗紅色，多核的定為陽(yáng)染細(xì)胞，即為破骨細(xì)胞。 使用美國(guó)Image-Pro Plus 軟件分析破骨細(xì)胞數(shù)。

1.4.4 ELISA 檢測(cè) 將標(biāo)本放置于2 ml DMEM 培養(yǎng)基浸泡24 h，取上清，按ELISA 試劑盒操作說(shuō)明書檢測(cè)其中IL-1β、TNF-α 含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Micro-CT 檢測(cè)

CT 掃描圖像重建后顯示空白對(duì)照組顱骨表面光滑平整，顱骨縫連接緊密（圖1A）。顆粒組磨損顆粒放置區(qū)域顱骨顯得粗糙，凹凸不平，表面布滿坑坑洼洼的骨吸收孔隙，顱骨正中連接縫增寬（圖1B）。 低劑量組顱骨重建圖像仍可見較多骨吸收陷窩，但較顆粒組稍少（圖1C）。 高劑量組顱骨表面骨吸收空隙明顯較少，較光滑，重建圖像與空白對(duì)照組較相似（圖1D）。

在顱蓋骨標(biāo)本正中央選取特定區(qū)域進(jìn)行骨參數(shù)定量檢測(cè)后顯示： 顆粒組顱骨孔隙率高于空白對(duì)照組， 而顱骨礦物質(zhì)密度和骨體積分?jǐn)?shù)低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 低劑量組骨礦物質(zhì)密度高于顆粒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 高劑量組骨孔隙率低于顆粒組，而骨礦物質(zhì)密度和骨體積分?jǐn)?shù)明高于顆粒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 高劑量組骨礦物質(zhì)密度及骨體積分?jǐn)?shù)高于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1E～G）。

圖1 小鼠顱骨Micro-CT 掃描及骨參數(shù)分析

2.2 HE 染色

空白對(duì)照組顱骨冠狀面切片染色可見顱骨完整性較好，顱骨縫連接緊密，骨膜菲薄，細(xì)胞浸潤(rùn)少，多為梭形成纖維細(xì)胞（圖2A）。 顆粒組可見少量殘留的磨損顆粒，顱骨縫連接處骨破壞最明顯，周圍見大小不等的骨溶解缺孔，骨膜反應(yīng)強(qiáng)烈，明顯增厚，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2B）。 低劑量組、高劑量組亦可見少量未能沖洗干凈的顆粒，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，骨膜較薄，骨結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，骨侵蝕面積均減少（圖2C～D）。經(jīng)圖像分析顯示，顆粒組骨面積小于空白對(duì)照組，高劑量組骨面積高于顆粒組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）（圖2E）。

圖2 小鼠顱骨HE 染色及骨面積分析結(jié)果

2.3 TRAP 染色

空白對(duì)照組顱骨平整，骨皮質(zhì)邊緣零星分布少量染成暗紅色不規(guī)則形的破骨細(xì)胞（圖3A）。 顆粒組骨侵蝕明顯，形態(tài)不規(guī)則，結(jié)構(gòu)不完整，骨破壞邊緣分布大量紅色深染的多核破骨細(xì)胞（圖3B），低劑量組、高劑量組骨破壞減輕，紅色深染的破骨細(xì)胞數(shù)較少（圖3C、D）。 經(jīng)圖像分析顯示，顆粒組破骨細(xì)胞數(shù)高于空白對(duì)照組，低劑量組和高劑量組破骨細(xì)胞數(shù)均少于顆粒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3E）。

圖3 小鼠顱骨TRAP 染色及陽(yáng)染細(xì)胞數(shù)分析結(jié)果

2.4 ELISA 檢測(cè)

顆粒組炎癥因子IL-1β、TNF-α 表達(dá)量高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 低劑量治療組、高劑量治療組IL-1β、TNF-α 表達(dá)均低于顆粒組，以高劑量組降低最為明顯，低劑量組次之，高、低劑量組之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

圖4 ELISA 檢測(cè)炎癥因子表達(dá)量

3 討論

隨著生物醫(yī)學(xué)材料研究的發(fā)展，人工關(guān)節(jié)假體材質(zhì)由金屬升級(jí)到了陶瓷，關(guān)節(jié)的耐磨性得到了很大提升，但是仍然難以做到關(guān)節(jié)界面零磨損。 關(guān)節(jié)的長(zhǎng)期使用依然會(huì)源源不斷產(chǎn)生磨損顆粒， 由此產(chǎn)生的磨損顆粒聚集在假體周圍， 誘導(dǎo)無(wú)菌性炎癥反應(yīng)及破骨細(xì)胞過(guò)渡活化、 骨吸收， 最終導(dǎo)致假體周圍骨缺損、松動(dòng)。從磨損顆粒的產(chǎn)生到關(guān)節(jié)假體松動(dòng)是一個(gè)復(fù)雜的炎癥性骨溶解過(guò)程，涉及多種炎癥細(xì)胞聚集浸潤(rùn)及炎癥因子分泌，其中，單核巨噬細(xì)胞在該炎癥反應(yīng)過(guò)程中起重要作用。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同材質(zhì)的磨損顆粒均能刺激外周血單核細(xì)胞分泌炎癥因子和趨化因子，并存在劑量依賴性；其中鈦合金顆粒的生物學(xué)活性最強(qiáng)， 其次是鈷鉻合金和聚甲基丙烯酸甲酯顆粒，超高分子量聚乙烯顆粒最低弱。 劉子歌等則認(rèn)為鈷鉻鉬合金顆粒對(duì)巨噬細(xì)胞細(xì)胞的刺激更為強(qiáng)烈，能更顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能及骨溶解相關(guān)因子的釋放。 席向東等在人工關(guān)節(jié)無(wú)菌性松動(dòng)假體周圍界膜組織中發(fā)現(xiàn)含有大量異物巨噬細(xì)胞，且基質(zhì)金屬蛋白酶-9、TNF-α、IL-1 的表達(dá)明顯高于初次人工置換患者滑膜組織。單核細(xì)胞可吞噬粒徑小于10 μm的磨損顆粒，并融合成多核異物巨噬細(xì)胞，活化后產(chǎn)生大量炎癥因子TNF-α、IL-1β、單核細(xì)胞趨化蛋白1（Monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）等，以維持假體周圍慢性炎癥反應(yīng)。 CaSR 參與了多種炎癥反應(yīng)過(guò)程，并在多種炎癥細(xì)胞中均有表達(dá)。 D′Espessailles 等發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞表達(dá)CaSR，當(dāng)受到CaSR 激動(dòng)劑刺激后，巨噬細(xì)胞核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）、IL-1β及半胱氨酸酶-1 的表達(dá)明顯增加，而加入CaSR 拮抗劑后，炎癥因子表達(dá)明顯得到抑制。 Jager 等發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者單核細(xì)胞CaSR 表達(dá)明顯上調(diào)，并通過(guò)激活NLRP3 炎癥使IL-1β 釋放增加， 維持炎癥反應(yīng)， 通過(guò)抑制CaSR 可減輕類風(fēng)濕患者炎癥反應(yīng)。Su發(fā)現(xiàn)大腸桿菌大鼠睪丸炎模型中睪丸單核巨噬細(xì)胞CaSR 表達(dá)明顯增加，并通過(guò)激活NLRP3 炎癥小體上調(diào)IL-1β 的表達(dá)，而CaSR 抑制劑可明顯減輕炎癥反應(yīng)。 Lee 等證實(shí)CaSR 抑制劑NPS2143 可以抑制脂多糖誘導(dǎo)的急性肺水腫小鼠肺內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和MCP-1、TNF-α、白細(xì)胞介素-6 等炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷有保護(hù)作用。 由此可見，單核巨噬細(xì)胞表達(dá)的CaSR 有助于炎癥因子的釋放，炎癥反應(yīng)的擴(kuò)大及維持，而通過(guò)阻斷CaSR 可抑制炎癥反應(yīng)。本研究中，與空白對(duì)照組相比，顆粒組局部炎癥反應(yīng)明顯加重，骨膜增厚，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可見多核巨噬細(xì)胞，同時(shí)，TNF-α、IL-1β 表達(dá)量也明顯增加，且無(wú)紅腫、滲液等感染跡象，這說(shuō)明，動(dòng)物模型的建立是成功的，很好地模擬了磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解體內(nèi)變化。給予CaSR 抑制劑NPS2390 干預(yù)后， 顱骨骨膜炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)明顯減少， 炎癥因子TNF-α、IL-1β 表達(dá)明顯被抑制， 這種抑制效果隨NPS2390 濃度增加而越發(fā)明顯， 其機(jī)制很有可能是NPS2390 阻斷了周圍單核巨噬細(xì)胞CaSR 信號(hào)通路，抑制了炎癥因子的釋放，阻斷了磨損顆粒引發(fā)的炎癥瀑布反應(yīng)。

磨損顆粒不僅可以通過(guò)炎癥細(xì)胞間接影響骨組織細(xì)胞，也可以直接影響骨細(xì)胞，導(dǎo)致骨代謝失衡。體外培養(yǎng)的破骨細(xì)胞前體細(xì)胞可吞噬磨損顆粒，并融合分化成為有骨吸收能力的成熟破骨細(xì)胞，參與假體周圍骨吸收過(guò)程。 同時(shí)，磨損顆粒還可以增加假體周圍核因子κB 受體活化因子配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）的表達(dá)，抑制骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）表達(dá)，通過(guò)強(qiáng)化RANKL/核因子κ B受體活化因子（receptor activator of NF-κB，RANK）信號(hào)通路促進(jìn)破骨細(xì)胞成熟、分化，外源性給予OPG 干預(yù)后可以抑制磨損顆粒誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及骨溶解。磨損顆?？梢种瞥晒羌?xì)胞生長(zhǎng)、 成熟及功能的發(fā)揮，誘導(dǎo)其凋亡，通過(guò)刺激成骨細(xì)胞功能，可有效抑制磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解。 CaSR 也參與了多種骨組織細(xì)胞成熟、分化及凋亡的調(diào)控，但在不同疾病中起不一樣的作用。 雷群等發(fā)現(xiàn)Ca通過(guò)與CaSR 結(jié)合在體外能促進(jìn)人成骨細(xì)胞的增殖、成骨分化與礦化，CaSR拮抗劑降能阻斷這一作用。雷尼酸鍶是一種抗骨質(zhì)疏松藥物，因其中鍶離子和鈣離子理化性質(zhì)相仿，有報(bào)道雷尼酸鍶通過(guò)激活CaSR，促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡和成骨細(xì)胞分化，從而加強(qiáng)骨組織，達(dá)到抗骨質(zhì)疏松療效。Liu 等報(bào)道雷尼酸鍶還可通過(guò)阻斷炎癥因子TNF-α、IL-1β 釋放，促進(jìn)OPG 表達(dá)，抑制破骨細(xì)胞生成，從而減輕磨損顆粒誘導(dǎo)炎癥骨溶解。 Liu 等發(fā)現(xiàn)肺癌組織中CaSR 表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，存在骨轉(zhuǎn)移的肺癌CaSR 表達(dá)明顯高于無(wú)骨轉(zhuǎn)移肺癌。 高表達(dá)的CaSR 可以促進(jìn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞成熟分化，抑制成骨細(xì)胞功能，CaSR 拮抗劑可抑制肺癌骨轉(zhuǎn)移的骨破壞。 Boudot 等發(fā)現(xiàn)CaSR 的過(guò)表達(dá)在可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞分泌表皮調(diào)節(jié)素，從而抑制OPG 的表達(dá)，促進(jìn)破骨細(xì)胞成熟分化，骨破壞。董冰子等發(fā)現(xiàn)CaSR 拮抗劑溶鈣素可以制造低鈣血癥的假象，促進(jìn)甲狀旁腺激素的分泌，從而刺激成骨，增強(qiáng)骨密度。

在本研究中，磨損顆粒組破骨細(xì)胞數(shù)量多于空白對(duì)照組，骨體積分?jǐn)?shù)、骨礦物質(zhì)密度明顯降低，骨孔隙率增加和骨溶解明顯，提示磨損顆粒在體內(nèi)誘導(dǎo)了破骨細(xì)胞激活并發(fā)揮了骨溶解作用。 給予CaSR 抑制劑NPS2390 干預(yù)后，破骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少，顱骨骨溶解也受到抑制。 其作用機(jī)制可能兩方面。 一方面是NPS2390 抑制了局部炎癥反應(yīng)及單核巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，而單核細(xì)胞是破骨細(xì)胞的前體來(lái)源來(lái)細(xì)胞，是磨損碎屑誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞活化的基礎(chǔ)， 前體細(xì)胞減少了， 成熟的破骨細(xì)胞自然就少了。 另一方面是CaSR在磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解中的作用和轉(zhuǎn)移瘤中的作用相似， 是激活破骨細(xì)胞， 促進(jìn)骨溶解的作用，而NPS2390 抑制了這種作用。當(dāng)然，本實(shí)驗(yàn)未檢測(cè)CaSR的表達(dá)，所以具體作用機(jī)制仍不明確。

綜上所述，CaSR 抑制劑可有效減輕磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解及炎癥因子的表達(dá)，但其具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究