miR-216a調控NF-κB信號通路參與膿毒癥急性腎損傷的機制

鄧林林 張嘯 高儀 龔園其 藍海兵

南昌大學第二附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科（南昌 330000）

膿毒癥是一種由感染引起全身性炎癥反應的危及生命的器官功能障礙的臨床綜合征［1-2］。該病極易進展為膿毒性休克，一旦發(fā)病，發(fā)展速度極快，且患者預后較差，病死率極高［3-4］。其中急性腎損傷是該病最嚴重的并發(fā)癥之一，病死率也極高。目前，該病的發(fā)病率還在逐年遞增，因此研究有效的治療手段十分關鍵，微小RNA（microRNA，miR）是一類非編碼RNA，可以調控基因表達。有研究［5］表明，miR-216a 可以廣泛的表達于心、肝、肺、腎等組織中，并且與急性胰腺炎導致的胰腺損傷存在密切的聯(lián)系，且在對于炎癥的控制方面具有特異性，其可以對相關炎癥基因的表達進行抑制，在炎癥的調控中發(fā)揮著重要的作用。但是與膿毒癥急性腎損傷的關系還有待探討，本文推測其可能作為急性損傷診斷的標志物。除此之外，有研究［6-7］指出，當人體處于缺血缺氧的狀態(tài)時，炎癥信號通路就會被激活，從而產(chǎn)生炎性因子導致急性腎損傷發(fā)病，而NF-κB 就是與炎癥反應密切相關的常見通路；且此通路與膿毒癥大鼠神經(jīng)上皮細胞的凋亡和炎癥反應有一定的聯(lián)系［8］。但是miR-216a 是否可以調控NF-κB 改善膿毒癥大鼠急性腎損傷，還并不明確。因此，本文以膿毒癥大鼠作為實驗對象，制備膿毒癥模型，觀察其炎癥因子以及生化指標的表達，初步探討miR-216a 對膿毒癥大鼠急性腎損傷的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與分組 選取40 只在9 周齡左右的SD 雄性大鼠，體質量260 g 左右，購自北京科宇動物養(yǎng)殖中心，飼養(yǎng)于無菌環(huán)境中，溫度：27 ℃左右；濕度：55%左右，自由進食，適應性喂養(yǎng)1 周后進行實驗。然后將其隨機分為：假手術組、模型組、miR-NC 組、miR-216a 組，每組各10 只。實驗獲得醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準（編號：2017009）。

1.1.2 儀器與試劑 TRIzol RT RNA 試劑盒、反轉錄試劑盒、ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；顯微鏡（上海無陌光學儀器有限公司）；miR-216a 模擬物及對應的陰性對照（NC）模擬物（上海吉凱公司）；PCR 儀、電泳儀、酶標儀（大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司）；所需抗體（美國Thermo 公司）；組織勻漿機（深圳欣博盛生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 假手術組大鼠僅僅在開腹后分離兩腎，然后關閉即可，其余大鼠參照文獻［9］，以盲腸結扎穿孔法進行造模：對所有大鼠均進行麻醉，然后開腹，模型組和miR-NC 組、miR-216a 組大鼠首先脫毛、消毒，然后將右腎蒂及輸尿管進行分離，然后將其結扎，左腎分離后采用夾鉗將動脈閉合30 min 左右，最后進行縫合。miR-NC 組、miR-216a 組在造模成功后大鼠尾部分別注射5 μL 的miR-NC、miR-216a，模型組和假手術組注射等量生理鹽水，連續(xù)注射3 d。第4 天麻醉大鼠，做后續(xù)實驗。當大鼠出現(xiàn)寒戰(zhàn)豎毛、蜷縮懶動、呼吸急促、進食減少、精神萎靡、眼角分泌物增多、保護性反射減弱等則表示造模成功，本實驗所有大鼠均造模成功。

1.2.2 HE 染色觀察大鼠組織病理變化先將大鼠麻醉，仰臥固定，打開腹部暴露臟器，小心摘取腎臟后，用生理鹽水充分沖洗后再固定，流水沖洗并采用酒精脫水，再將組織塊置于既溶于酒精，又溶于石蠟的透明劑中，放入保溫箱中。待石蠟完全浸入組織塊后包埋，連續(xù)5 μm 切片，進行染色，然后采用顯微鏡觀察各組大鼠腎組織的病理學改變。

1.2.3 PCR 檢測大鼠腎組織中miR-216a 表達 提取組織總RNA，然后將其逆轉錄為cDNA，擴增后根據(jù)試劑盒進行PCR 檢測。檢測miR-216a 表達。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.4 生化分析儀檢測各組大鼠生化指標水平 抽取大鼠靜脈血液2 mL，采用生化分析儀檢測大鼠血清中血肌酐（blood creatinine，Scr）、尿素氮（urea nitrogen，BUN）以及腎損傷分子-1（kidney damage molecule-1，KIM-1）水平。

1.2.5 ELISA檢測各組大鼠血清炎癥因子水平 將各組大鼠靜脈血液迅速注入EDTA 試管中混勻，離心后置于-80 ℃環(huán)境中待檢，采用ELISA 法檢測大鼠血清腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factoralpha，TNF-α）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）的表達，嚴格按照說明書操作。

1.2.6 Western blot 檢測各組組織的NF-κB 通路相關蛋白表達 取組織總蛋白進行測定，加入SDS-PAGE 凝膠后進行電泳，分離后進行轉膜用BSA 封閉PVDF 膜1 h，脫脂封閉后加入NF-κB p65、p-NF-κB p65 抗體；吸盡一抗孵育時的洗滌液后加入稀釋好的二抗慢慢搖動；再次搖動洗滌，然后凝膠成像，計算蛋白表達。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析；兩兩之間采用LSD-t檢驗多重比較；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠腎臟組織病理改變 假手術組大鼠腎組織結構無異常；模型組和miR-NC 組腎組織伴有炎性浸潤、腎間質加寬；miR-216a 組炎性浸潤現(xiàn)象以及腎小球病變情況有所緩解，見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理學變化（200×）Fig.1 Histopathological changes in the kidney of each group of rats（200×）

2.2 測定組織中miR-216a 表達 與假手術組相比，模型組、miR-NC 組腎組織miR-216a 表達水平較低，與miR-NC組相比，miR-216a組腎組織的miR-216a 表達水平較高（P＜0.05），提示轉染成功，見表2。

表2 各組大鼠腎組織中miR-216a 表達比較Tab.2 Comparison of miR-216a expression in the kidney tissue of rats in each group ±s

表2 各組大鼠腎組織中miR-216a 表達比較Tab.2 Comparison of miR-216a expression in the kidney tissue of rats in each group ±s

注：與假手術組相比，*P ＜0.05

分組假手術組模型組miR-NC 組miR-216a 組F 值P 值例數(shù)10 10 10 10 miR-216a 1.02±0.05 0.52±0.12*0.50±0.08*3.75±0.54*309.005＜0.001

2.3 測定各組大鼠腎組織生化指標 與假手術組相比，模型組、miR-NC 組大鼠血清Scr、BUN、KIM-1水平較高，與miR-NC 組相比miR-216a 組大鼠血清Scr、BUN、KIM-1 水平較低（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠腎組織中生化指標比較Tab.3 Comparison of biochemical indexes in the kidney tissue of rats in each group ±s

表3 各組大鼠腎組織中生化指標比較Tab.3 Comparison of biochemical indexes in the kidney tissue of rats in each group ±s

注：與假手術組相比，*P ＜0.05

分組假手術組模型組miR-NC 組miR-216a 組F 值P 值例數(shù)10 10 10 10 Scr（μmol/L）30.52±3.69 52.67±4.48*52.36±4.03*40.03±2.57*80.763＜0.001 BUN（mmol/L）7.63±1.69 22.05±3.69*21.08±3.74*13.48±2.58*49.862＜0.001 KIM-1（ng/L）21.07±3.05 63.17±8.63*63.47±8.41*39.74±6.12*87.393＜0.001

2.4 測定大鼠血清炎性細胞因子 與假手術組相比，模型組、miR-NC 組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平較高，與miR-NC 組相比miR-216a 組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平較低（P＜0.05），見表4。

表4 各組大鼠炎性細胞因子水平比較Tab.4 Comparison of inflammatory cytokine levels in each group of rats ±s

表4 各組大鼠炎性細胞因子水平比較Tab.4 Comparison of inflammatory cytokine levels in each group of rats ±s

注：與假手術組相比，*P ＜0.05

分組對照組模型組miR-NC 組miR-226a 組F 值P 值例數(shù)10 10 10 10 TNF-α（ng/mL）45.63±6.17 132.05±15.08*133.25±16.47*69.36±9.04*127.845＜0.001 IL-6（ng/mL）28.39±5.95 95.33±10.32*96.01±10.41*54.04±8.41*136.835＜0.001 IL-1β（ng/mL）40.17±6.28 106.47±10.45*105.85±10.99*71.74±9.54*117.705＜0.001

2.5 測定大鼠腎組織中NF-κB通路相關蛋白表達與假手術組相比，模型組、miR-NC 組大鼠腎組織中蛋白表達較高，與miR-NC 組相比miR-216a 組大鼠腎組織中蛋白表達較低（P＜0.05），見表5，圖2、3。

圖2 各組大鼠腎組織中NF-κB 通路相關蛋白表達比較Fig.2 Comparison of NF-κB pathway-related protein expression in the kidney tissues of various groups of rats

表5 各組大鼠腎組織中NF-κB 通路相關蛋白表達比較Tab.5 Comparison of NF-κB pathway-related protein expression in the kidney tissues of rats in each group ±s

表5 各組大鼠腎組織中NF-κB 通路相關蛋白表達比較Tab.5 Comparison of NF-κB pathway-related protein expression in the kidney tissues of rats in each group ±s

注：與假手術組相比，*P ＜0.05

分組假手術組模型組miR-NC 組miR-216a 組F 值P 值例數(shù)10 10 10 10 NF-κB p65 1.05±0.06 2.57±0.17*2.55±0.19*1.38±0.08*333.569＜0.001 p-NF-κB p65 1.34±0.15 2.89±0.26*2.88±0.27*1.54±0.10*160.794＜0.001

圖3 NF-κB 信號通路作用圖Fig.3 NF-κB signaling pathway action diagram

3 討論

膿毒癥是由各種細菌、真菌等微生物入侵到機體后引發(fā)的炎癥反應，是一種全身性的反應，該病在發(fā)病過程中，機體會產(chǎn)生大量促炎因子從而改善炎癥反應，但如果增強炎癥反應的因子和減輕炎癥反應的因子發(fā)生抗衡，就會損害機體；據(jù)研究［10］發(fā)現(xiàn)，大約30% ～50%的膿毒癥患者會發(fā)生膿毒癥急性腎損傷，且非常常見，而且該并發(fā)癥具有病情危急、臨床治療效果不明顯、病死率極高等特點。盡管目前許多抗生素都在不斷升級，治療手段也在不斷改善，但是該病的治療成本也在不斷增長，且病死率依舊沒有下降［11］。有研究已證實，miR-216a 已被證明與包括肺癌、乳腺癌在內的多種癌癥的發(fā)病以及病情進展有關。除此之外，還有研究表明miR-216a 可以調控Ybx1-框結合蛋白1 的表達在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中起到參與作用，這提示miR-216a 或許也可以在急性腎損傷的發(fā)生發(fā)展中起到一定的調控作用［12-13］。且萬笑笑［14］已經(jīng)研究證實，miR-216a 可以通過調控NF-κB 信號通路抑制缺氧-復氧誘導的腎小管上皮細胞急性腎損傷。這為miR-216a 可以參與膿毒癥急性腎損傷的發(fā)生發(fā)展這一結論增加了一絲可信度。因此，本文通過研究SD 大鼠，對其進行膿毒癥模型建造，并對miR-216a 進行轉染，結果發(fā)現(xiàn)miR-216a 在模型組中的表達較低，說明低表達的miR-216a 會增加大鼠腎組織的損傷，影響腎功能。此外，有研究提示，NF-κB 通路對膿毒癥有調控作用。因此，本文就miR-216a 是否可以調控NFκB 信號通路作用于膿毒癥大鼠進行分析。

在本研究中，首先觀察了各組大鼠腎組織的病理學變化，結果顯示，假手術組大鼠腎組織結構無異常；模型組和miR-NC 組腎組織伴有炎性浸潤、腎間質加寬；miR-216a 組炎性浸潤現(xiàn)象以及腎小球病變情況有所緩解。這說明miR-216a 在膿毒癥急性腎損傷的并且進展中扮演著抑癌的角色，進一步證實其過表達對腎組織有一定的保護作用。Scr、BUN 是判斷腎功能損害的重要指標，在急性腎損傷中會呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，KIM-1 也是該病的重要標志因子，在早期水平較高［15］。在本研究結果中，顯示模型組、miR-NC 組大鼠血清Scr、BUN、KIM-1 水平較假手術組升高，miR-216a 組大鼠血清Scr、BUN、KIM-1 水平較miR-NC 組降低。這進一步提示過表達的miR-216a 可以降低膿毒癥急性腎損傷的腎功能損害程度。眾所周知［16］，TNF-α 和IL-1β 是反應機體炎癥的重要指標，也是該病在發(fā)展過程中單核巨噬細胞產(chǎn)生的重要因子；而IL-6 是膿毒癥中關鍵促炎因子，可以激活某些轉導通路來調節(jié)膿毒癥等病理條件下的多種細胞因子［17］。在本研究的ELISA 實驗中，發(fā)現(xiàn)與假手術組相比，其余各組大鼠血清炎性因子水平較高，而與miR-NC 組相比miR-216a 組大鼠血清炎性因子水平較低。說明，miR-216a 可以減少TNF-α，IL-6 以及IL-1β 的分泌，抑制炎癥聯(lián)級反應，緩解炎癥癥狀。提示過表達的miR-216a 在疾病進展過程中可以通過抑制炎癥反應來保護腎臟。

王彬等［18］指出，在實驗性重度急性胰腺炎組織中的TLR4、NF-κB p65 表達變化與腎損傷嚴重程度和促炎因子的變化一致，且認為某種激酶的負調控通過TLR4/NF-κB 信號通路減輕脂多糖誘導的小鼠急性腎臟損傷［19］。并且研究［20］發(fā)現(xiàn)NFκB 通路在膿毒癥中有重要的參與作用，且與炎性因子水平呈負相關關系；研究還指出，當NF-κB 被激活后，進而會抑制促炎因子的表達；當正反饋調節(jié)與負反饋調節(jié)失衡時，也就是促炎反應與抗炎反應失衡時，就會引起嚴重的炎癥反應，甚至是膿毒癥，最終導致多功能障礙綜合征［21-22］。而在本研究中，也發(fā)現(xiàn)了與以上研究基本一致的結果：與假手術組相比，模型組、miR-NC 組大鼠腎組織中NF-κB 信號轉導通路中關鍵蛋白表達較高，而與miR-NC 組相比miR-216a 組大鼠腎組織中通路相關蛋白表達較低。此外，在膿毒癥中，由于外來致病菌的感染，LPS 與TLRs 結合以后，經(jīng)過信號通路的傳導最終激活NF-kB 的轉錄，釋放大量的促炎介質如TNF-α、IL-P、IL-1、IL-6、IL-10 等因子，導致炎癥級聯(lián)反應，最終影響疾病的預后。而本研究miR-216a 可以減少炎癥因子釋放，抑制NF-κB通路，這提示miR-216a 對膿毒癥急性腎損傷的保護作用是通過抑制NF-κB 信號通路實現(xiàn)的。其抗炎機制可能是通過其抗炎機制可能是降低NF-κB p65 表達，抑制NF-κB 信號通路活化，降低炎性因子TNF-α，IL-6，IL-1β 分泌。

綜上所述，過表達miR-216a 可能是通過調控NF-κB 信號通路，抑制膿毒癥大鼠炎癥因子的釋放，阻斷炎癥因子的合成與釋放，進而保護腎臟。miR-216a 可作為膿毒癥急性腎損傷中的預測性生物標志物，對臨床診斷及療效判定等方面具有重要的意義。但是是否有其他miRNA 參與疾病進程尚不清楚，需要深入研究。