藍(lán)莓花青素與男性生殖功能損傷機(jī)制的研究進(jìn)展

黃濤 李威 喻英 穆毅 唐開(kāi)發(fā)

1貴州醫(yī)科大學(xué)（貴陽(yáng) 550004）；2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科（貴陽(yáng) 550004）

男性生殖功能障礙是近幾十年才引起臨床及相關(guān)研究人員關(guān)注的一種疾病。男性生育能力下降的原因離不開(kāi)氧化應(yīng)激（OS）與炎癥介質(zhì)，其中活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）似乎在精子DNA 損傷的產(chǎn)生、精液參數(shù)受損和精子功能衰竭中發(fā)揮重要作用［1］。近年來(lái)，針對(duì)OS 及炎癥介質(zhì)造成的男性不育治療方案和策略層出不窮，而中草藥也逐漸進(jìn)入人們的視野。本綜述就植物抗炎、抗氧化劑當(dāng)中較為常見(jiàn)的藍(lán)莓花毒素（BA）與OS、炎癥介質(zhì)的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，期望為男性生殖功能障礙患者的治療和預(yù)后提供幫助。

1 男性生殖功能障礙

男性不育被定義為1年內(nèi)規(guī)律且無(wú)保護(hù)措施的性交而女方無(wú)法懷孕。WHO 調(diào)查估計(jì)，育齡夫婦不育問(wèn)題中約50%的病例是由男性引起的。20 世紀(jì)80 代以來(lái)，流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：整個(gè)社會(huì)男性人群的精子濃度和總數(shù)整體下降，甚至超過(guò)半數(shù)，下降值分別是52.4%、59.3%［2］。國(guó)內(nèi)的相關(guān)研究也表明2001-2018年，健康男性精液的各項(xiàng)參數(shù)均隨時(shí)間的變化呈現(xiàn)下降趨勢(shì)［3-4］。因此，男性生殖功能障礙已成為一個(gè)全球性的醫(yī)學(xué)及社會(huì)問(wèn)題。

造成男性生育能力損害的因素很多，其中包括年齡、體質(zhì)量、身體成分比例等生理因素；代謝綜合征、感染、炎癥、精子DNA 碎片率（DFI）升高等病理因素；焦慮、創(chuàng)傷、壓力等心理因素；生理活動(dòng)、吸煙、飲酒、吸毒等生活方式以及暴露于毒素、重金屬、輻射、PM2.5 等環(huán)境因素［5-11］。

2 氧化應(yīng)激及炎癥介質(zhì)對(duì)男性生殖系統(tǒng)的不良影響

2.1 氧化應(yīng)激對(duì)男性生殖系統(tǒng)的影響 男性生殖功能在某些因素作用下將產(chǎn)生極其嚴(yán)重的影響，如熱應(yīng)激會(huì)嚴(yán)重?fù)p害雄性豚鼠的生殖功能，表現(xiàn)為睪丸結(jié)構(gòu)和精子特征的顯著改變，其機(jī)制可能是熱應(yīng)激導(dǎo)致睪丸丙二醛水平升高，GSH-Px、SOD、CAT 等酶的活性降低［12］。當(dāng)線(xiàn)粒體膜脂質(zhì)遭受ROS 的侵犯時(shí)，將阻礙呼吸鏈電子的傳遞，導(dǎo)致男性生殖功能的病理性改變［13］。此外，男性生殖毒性是順鉑的副作用，其會(huì)誘導(dǎo)的睪丸OS 標(biāo)志物和炎癥介質(zhì)（TNF-α 和iNOS）發(fā)生變化，也可導(dǎo)致凋亡標(biāo)志物caspase-3 和Bax 的睪丸基因表達(dá)增加及Bcl-2 的減少，最終造成男性生殖功能低下［14］。造成男性生殖功能障礙的因素較多，其中ROS 在男性生殖系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色，甚至可以決定男性能否繁衍后代，然而對(duì)男性造成的威脅遠(yuǎn)不止此。

2.2 炎癥介質(zhì)對(duì)男性生殖系統(tǒng)的影響 炎癥介質(zhì)是男性不育的核心要素之一，男性生殖系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)會(huì)對(duì)生殖細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)成分造成損傷。鄰苯二甲酸二乙基己酯可以提高血清中TNF-α 和IL-6 水平，進(jìn)一步造成睪丸中TNF-α、IL-1β 和IL-6的mRNA 表達(dá)增加［15］。炎癥介質(zhì)中的NO 在中高濃度時(shí)作為促炎介質(zhì)誘導(dǎo)OS，從而降低精子活力。在感染、精索靜脈曲張或糖尿病等病理?xiàng)l件下，過(guò)量的NO 產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致精子毒性，并通過(guò)過(guò)氧亞硝酸鹽的形成降低精子活力［16-17］。因此，在男性生殖系統(tǒng)遭到損害的因素中，炎癥介質(zhì)和OS 相互影響，互為因果。

3 BA 對(duì)氧化應(yīng)激及炎癥介質(zhì)造成男性生殖障礙的改善作用

3.1 BA 在臨床中的相關(guān)應(yīng)用 BA 為漿果藍(lán)莓中提取的主要活性物質(zhì)，是重要的抗氧化物質(zhì)之一。在肥胖和超重個(gè)體參與一項(xiàng)攝入藍(lán)莓果實(shí)的醫(yī)學(xué)營(yíng)養(yǎng)治療研究中發(fā)現(xiàn)：參與人員的BMI、胰島素水平、胰島素抵抗、低密度脂蛋白、總膽固醇和尿酸水平在服用藍(lán)莓后均顯著下降，而起到關(guān)鍵作用的可能就是BA 或者多酚［18］。黃宗銹團(tuán)隊(duì)也選擇了120 名志愿受試者，A 組服用受試物，B 組服用安慰劑，服藥周期35 d，最終結(jié)果表明試驗(yàn)組受試者的視物模糊、眼干澀、癥狀總積分均得到改善、明視持久度提高［19］。此外，以抗氧化和抗炎特性而聞名的BA 成功與水凝膠結(jié)合，在受傷的創(chuàng)面應(yīng)用負(fù)載BA 的水凝膠之后，傷口愈合明顯加快，同時(shí)也促進(jìn)了上皮和組織再生和膠原沉積和血管生成［20］。

3.2 BA 可通過(guò)干預(yù)氧化應(yīng)激損傷途徑來(lái)改善男性生殖功能障礙

3.2.1 BA 可通過(guò)促進(jìn)（和）或增加抗氧化酶以改善男性生殖功能障礙 GSH-Px、SOD、CAT 等三組蛋白酶和非酶系等抗氧化物質(zhì)作為ROS 清潔劑發(fā)揮著巨大作用。在BA 的作用下，酶系和非酶系等抗氧化物質(zhì)的活性會(huì)突顯出來(lái)。LOU 等［21］采用藍(lán)莓花青素提取物來(lái)治療大鼠白內(nèi)障，結(jié)果顯示除了可以提高大鼠晶狀體上皮細(xì)胞SIRT1 活性及下調(diào)NF-κB 活性，還會(huì)增加SOD 和GSH-Px 活性來(lái)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。張卓睿團(tuán)隊(duì)［22也證實(shí)小鼠肝臟中T-SOD 和GSH-Px 的活性還可以在BA的作用下得到明顯提升，且丙二醛含量降低，總抗氧化能力增強(qiáng)］。藍(lán)莓花青素提取物、錦葵素（malvidin，Mv）、錦葵素-3-葡萄糖苷（malvidin-3-glucoside，Mv-3-glc）和錦葵素-3-半乳糖苷（malvidin-3-galactoside，Mv-3-gal）均能降低H2O2，從而降低ROS 和MDA 的水平，并增加人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中SOD、CAT 和GSH-Px 的水平來(lái)抑制OS［23］。此外，在ALKHALF 等［24］研究中還發(fā)現(xiàn)，BA 對(duì)輻照所致小鼠血清中SOD 活性的降低也具有明顯的拮抗作用。

酶抗氧化防御系統(tǒng)和非酶抗氧化防御系統(tǒng)作為清除ROS 的第一道防線(xiàn)，催化超氧化物的歧化反應(yīng)，與CAT、GPX、抗壞血酸過(guò)氧化物酶協(xié)同作用，有效保護(hù)生殖細(xì)胞和機(jī)體本身。

3.2.2 BA 可通過(guò)修復(fù)（和）或干預(yù)精子DNA 損傷以改善男性生殖功能障礙 精子DNA 的完整性對(duì)于遺傳信息的準(zhǔn)確傳遞是必不可少的，攜有DNA損傷的部分精子可將遺傳缺陷傳遞于后代，可能導(dǎo)致子代遺傳表觀和特性發(fā)生變化。ALKHALF等［24］用BA 對(duì)輻照大鼠影響的研究中進(jìn)行了DNA片段化試驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)表明在受輻照的大鼠中有大量DNA 斷裂，而補(bǔ)充BA 的大鼠中卻沒(méi)有DNA 斷裂，且在輻照期間用BA 處理對(duì)DNA 斷裂具有中等保護(hù)作用。此外，補(bǔ)充BA 除了影響基因組DNA 甲基化水平外，還通過(guò)減少氧化應(yīng)激、增強(qiáng)抗氧化能力、保護(hù)α-TP 代謝和調(diào)節(jié)基因表達(dá)來(lái)改善全氟辛酸的毒性效應(yīng)［25］。通過(guò)對(duì)Cd 誘導(dǎo)的青春期男性小鼠損傷進(jìn)行建模并用花青素-3-葡萄糖苷（Cyanidin-3-Glucoside，C3G）喂養(yǎng)，證明C3G 可以挽救精子的數(shù)量和活性，也在精子發(fā)生過(guò)程中表現(xiàn)出對(duì)Cd 誘導(dǎo)的組蛋白修飾的部分抗性，并防止了精子核中DNA 的氧化損傷［26］。

精子在產(chǎn)生和成熟的過(guò)程中，當(dāng)修復(fù)途徑缺陷時(shí)會(huì)導(dǎo)致精子的發(fā)育停滯和異常重組，最終導(dǎo)致男性不育。因此，DNA 的完整性對(duì)精子發(fā)育和胚胎的質(zhì)量來(lái)說(shuō)至關(guān)重要，在BA 的干預(yù)下，利于DNA 損傷的修復(fù)和保護(hù)。

3.2.3 BA 可通過(guò)拮抗脂質(zhì)過(guò)氧化來(lái)改善男性生殖功能障礙

3.2.3.1 BA 可通過(guò)保護(hù)（和）或修復(fù)細(xì)胞膜以改善男性生殖功能障礙 人類(lèi)精子膜中含量較高的多不飽和脂肪酸增加了膜脂質(zhì)過(guò)氧化的敏感性，花青素則能通過(guò)優(yōu)化血清飽和和不飽和脂肪酸的分布，在增強(qiáng)抗氧化防御能力方面發(fā)揮積極作用。有關(guān)研究［27］表明，C3G 降低了大鼠Leydig 細(xì)胞系（R2C）細(xì)胞的膜脂氧化和線(xiàn)粒體膜電位的損傷率，上調(diào)了類(lèi)固醇急性調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)，促進(jìn)了膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)，最終促進(jìn)了R2C 細(xì)胞中孕酮或睪酮的合成。在矯馨瑤等［28］的研究中發(fā)現(xiàn)，BA 除了能增加對(duì)·OH、DPPH 自由基、H2O2、O2·及Fe3+等物質(zhì)的清除率，對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化也能起抑制效果。ROS 會(huì)主動(dòng)攻擊存在于精子膜中不飽和脂肪酸的雙鍵，導(dǎo)致脂膜發(fā)生氧化損傷，致使精子膜的流動(dòng)性和完整性受到損害，從而進(jìn)一步造成精子與卵子識(shí)別、融合及信息傳遞等障礙。故而，我們要深入了解BA 在膜脂成分與精子的相關(guān)性，這將有助于我們?yōu)槟行陨彻δ苷系K的診斷、治療及預(yù)后提供新的診療思路及方法。

3.2.3.2 BA 可通過(guò)抑制（和）或減弱細(xì)胞凋亡以改善男性生殖功能障礙 從胚胎發(fā)育的角度來(lái)看，細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是至關(guān)重要的，貫穿于生物體的整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中，有助于組織的更新和擺脫炎癥細(xì)胞，但其卻不可過(guò)度凋亡。研究證實(shí)了BA 能顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡，降低血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子水平，并激活A(yù)kt 信號(hào)通路，激活的Akt 可以作為核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）活化的上游信號(hào)，增強(qiáng)escin 介導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞抗氧化和對(duì)抗H2O2的細(xì)胞保護(hù)活性［23，29］。藍(lán)莓花青素提取物通過(guò)抑制衰老和細(xì)胞凋亡以及將過(guò)表達(dá)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）下調(diào)至正常水平來(lái)保護(hù)這些細(xì)胞免受光誘導(dǎo)的損傷，從而對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞有益［30］。

細(xì)胞存活是機(jī)體得以延續(xù)的基本條件，當(dāng)生殖細(xì)胞受到損傷時(shí)，可在BA 的作用下，通過(guò)caspase-3、Akt 等相關(guān)信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞活性，從而改善男性生殖功能。

3.2.3.3 BA 可通過(guò)改善（和）或糾正線(xiàn)粒體損傷以改善男性生殖功能障礙 精子線(xiàn)粒體功能的缺陷損害了維持精子運(yùn)動(dòng)所需的能量產(chǎn)生，并且可能是弱精子癥的根本原因。ROS 的過(guò)量產(chǎn)生與線(xiàn)粒體功能障礙密切相關(guān)，其特征是線(xiàn)粒體膜電位的喪失、線(xiàn)粒體質(zhì)量的增加、線(xiàn)粒體呼吸復(fù)合物的改變、細(xì)胞色素c 的釋放、線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)錄因子A 的減少和mtDNA 斷裂的增加［31］。在SUN 等［32］研究中發(fā)現(xiàn)，丙烯酰胺（AA）和縮水甘油酰胺（GA）（GA 是AA 的最終基因毒性代謝物）暴露增加ROS 水平并降低線(xiàn)粒體膜電位，導(dǎo)致黃體酮產(chǎn)生減少，C3G 則通過(guò)抑制ROS 生成、線(xiàn)粒體膜去極化和細(xì)胞凋亡以及激活類(lèi)固醇生成酶，有效降低AA 和GA 誘導(dǎo)的生殖毒性。Bax 是BCL2 家族的成員，當(dāng)細(xì)胞凋亡信號(hào)出現(xiàn)時(shí)，Bax 的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，然后線(xiàn)粒體的通透性轉(zhuǎn)換孔通過(guò)與電壓依賴(lài)性陰離子通道相互作用，最終線(xiàn)粒體膜遭到損害，而B(niǎo)A 干預(yù)下顯著抑制了Bax 和Caspase3 的表達(dá)，從而阻礙線(xiàn)粒體遭到進(jìn)一步的損害［33-34］。

因此，經(jīng)BA 干預(yù)下發(fā)現(xiàn)線(xiàn)粒體通透性過(guò)渡孔開(kāi)口減少，總抗氧化應(yīng)激能力顯著增加，線(xiàn)粒體膜電位的去極化和膜脂質(zhì)過(guò)氧化得到改善，對(duì)某些因素誘導(dǎo)的線(xiàn)粒體損傷提供了顯著的保護(hù)。

3.3 BA 可通過(guò)阻斷（和）或減少炎癥介質(zhì)以改善男性生殖功能障礙 研究［35］證實(shí)了多種炎癥細(xì)胞因子如IL-1β 和IL-6 以及PGE2 等相關(guān)炎癥介質(zhì)都會(huì)受到BA 的調(diào)節(jié)作用，從而抑制炎癥細(xì)胞產(chǎn)生的ROS。Mv-3-glc 和Mv-3-gal 是BA 重要成分，其可抑制TNF-α 誘導(dǎo)的單核細(xì)胞趨化蛋白-1、細(xì)胞間粘附分子-1 和血管細(xì)胞粘附分子-1 的產(chǎn)生以及IκBα 的降解；不僅如此，Mv-3-glc 和Mv-3-gal 能夠抑制p65（NF-κB 的一個(gè)亞基）的核轉(zhuǎn)位，表明Mv-3-glc 和Mv-3-gal 可以阻斷促I(mǎi)κBα 下游的炎癥信號(hào)［36］。XIAO 等［37］研究發(fā)現(xiàn)，C3G 可以通過(guò)血睪丸屏障抑制炎性細(xì)胞因子來(lái)改善結(jié)腸炎小鼠的精子質(zhì)量和受損的生育能力，并且相對(duì)低劑量（12.5 mg/kg 和25 mg/kg）的C3G 可通過(guò)改善結(jié)腸炎和降低血清炎性因子水平來(lái)減輕炎性因子對(duì)睪丸的損害。

在病理和生理過(guò)程中，NO、NF-κB、TNF-α、IL-1β 和IL-6 等炎癥介質(zhì)的反常功能取決于機(jī)體的整體狀態(tài)和氧化系統(tǒng)-抗氧化系統(tǒng)的平衡。然而，BA 對(duì)于炎癥介質(zhì)的具體作用機(jī)制及如何通過(guò)簡(jiǎn)單檢測(cè)來(lái)預(yù)判男性生殖功能狀態(tài)是我們接下來(lái)繼續(xù)探索的方向之一。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，BA 可以作為抗氧化物酶類(lèi)物質(zhì)或非酶物質(zhì)改善和緩解ROS 及炎癥介質(zhì)對(duì)精子、生殖細(xì)胞及器官的損傷。除了影響基因組DNA 甲基化水平、防止精子核中DNA 的氧化損傷外，還通過(guò)減少氧化應(yīng)激、增強(qiáng)抗氧化能力、保護(hù)α-TP 代謝和調(diào)節(jié)基因表達(dá)來(lái)改善生殖功能狀態(tài)。脂質(zhì)過(guò)氧化時(shí)，BA 的生理活性會(huì)穩(wěn)定細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和修復(fù)損傷的功能，并使線(xiàn)粒體的功能和結(jié)構(gòu)可以得到恢復(fù)，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的侵襲及凋亡。BA 可調(diào)節(jié)L-1β、NO、IL-6 以及PGE2 等相關(guān)炎癥介質(zhì)，阻斷炎癥信號(hào)通路，直接或間接減少炎癥細(xì)胞產(chǎn)生的ROS 來(lái)改善生殖系統(tǒng)的損傷。

然而，現(xiàn)階段大部分實(shí)驗(yàn)研究仍停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，BA 對(duì)男性生殖系統(tǒng)的抗炎、抗氧化作用機(jī)理上尚未研究清楚，BA 成分之間的是否存在協(xié)同作用以及BA 發(fā)揮預(yù)期效果所需具體劑量也是未知的。因此，進(jìn)一步研究BA 對(duì)男性生殖功能障礙的具體療效、作用機(jī)制、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及作用靶點(diǎn)是我們接下來(lái)的研究重點(diǎn)。