復蘇因子薄層瓊脂快速培養(yǎng)法診斷結核性胸膜炎的應用研究

邢愛英，杜鳳嬌，李自慧，杜博平，孫 琦，賈紅彥，魏榮榮，潘麗萍，劉忠泉

我國是結核病高負擔國家，結核性胸膜炎是僅次于肺結核的主要結核病類型，占胸腔積液類型的50%以上，且發(fā)病率呈上升趨勢[1-2]。細菌學檢查仍是結核性胸膜炎診斷的金標準，但胸水涂片陽性率低于5.8%，改良羅氏培養(yǎng)的陽性率雖有提高(30%)，但培養(yǎng)時間較長(4～8周)；胸膜活檢的陽性率達到69.6%～82%，但為有創(chuàng)性檢查，有引發(fā)結核病播散和加重的風險[2-5]。胸腔積液結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tb)液體培養(yǎng)法(BACTEC MGIT-960)雖可將培養(yǎng)時間縮短至14 d左右，但昂貴的儀器和試劑難以在結核病多發(fā)的貧困地區(qū)推廣[4,6]。因此，迫切需要建立一種快速的能提高胸腔積液M.tb培養(yǎng)陽性率的新方法。本研究團隊前期探索了胸腔積液M.tb的復蘇培養(yǎng)，提示復蘇促進因子(resuscitation promoting factor,Rpf)可提高M.tb的培養(yǎng)陽性率，縮短培養(yǎng)時間[7]。本研究進一步優(yōu)化復蘇因子培養(yǎng)法，并引進顯微鏡觀察特征性微小菌落報告結果，建立結核分枝桿菌Rpf薄層瓊脂(thin layer agar,TLA)快速培養(yǎng)新方法并評估其應用價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 連續(xù)收集2016年7月至2018年11月期間在北京胸科醫(yī)院住院或門診就診的疑似結核性胸膜炎患者155例，剔除診斷不明確及資料不全者18例。最終納入137例患者，其中男性83例，女性54例；年齡18～86歲，平均(49.45±19.10)歲，分為結核性胸膜炎組和其他疾病對照組。結核性胸膜炎組依據WS 288-2017 肺結核診斷標準[8]，以病原學(包括細菌學、分子生物學)或病理學確診結核性胸膜炎者49例及臨床診斷結核性胸膜炎者54例，共103例，男性64例，女性39例；年齡18～86歲，平均(46.08±19.95)歲；其他疾病組為排除結核性胸膜炎，且既往無結核病史和結核接觸史、也未經過放化療和手術治療的其他胸膜疾病者34例，男性19例，女性15例；年齡26～79歲，平均(59.65±11.48)歲；其中肺癌27例(小細胞癌10例，非小細胞癌17例)、細菌性胸膜炎5例和胸膜間皮瘤2例。以上患者均無HIV感染、急性病毒感染、肝炎、免疫性疾病和免疫抑制劑應用史，也無嚴重肝腎功能損害，無妊娠。本研究通過首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院倫理委員會批準，批件號為(2015)年臨床審第(08)號。

1.2 主要試劑與儀器M.tb復蘇因子B(Rvl009)和Rpf E(Rv2450c)重組蛋白由本實驗室制備[9]。TLA培養(yǎng)基的制作：取MiddleBrook 7H11基礎培養(yǎng)基(美國Becton Dickinson公司)2.1 g加入90 mL雙蒸餾水中，溶解后加入0.5 mL丙三醇，120～124 ℃高壓15 min，冷卻至50～55 ℃時加入OADC(油酸-牛血清白蛋白-葡萄糖-過氧化氫酶，oleic acid-albumin-dextrose-catalase) 10 mL，并加入抗生素(終濃度分別為：氨芐青霉素100 μg/mL、羧芐青霉素50 μg/mL、可溶性多黏菌素B 200 μg/mL、可溶性兩性霉素B 5 μg/mL)混勻，每平皿倒入10 mL培養(yǎng)基，4 ℃保存?zhèn)溆?。NALC-NaOH消化液：4% NaOH溶液和2.94%(0.1 mol/L)枸櫞酸鈉溶液等體積混合(密閉冷藏保存)，使用前每100 mL混合液加入0.5 g N-乙酰半胱氨酸(NALC),混勻后8 h內使用。DNA提取試劑盒(美國Qiagen公司)，M.tb標準株H37Rv為本實驗室保存。5500E CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Nuaire公司)，DM500顯微鏡(德國Leica公司)，MyCycler PCR擴增儀(美國Bio-rad公司)，GelDoc XR凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-RAD公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集及處理(中和離心法) 無菌抽取每例結核性胸膜炎患者胸腔積液100 mL，分裝于2個含肝素鈉的50 mL無菌離心管中，室溫3 000×g離心20 min后棄去部分上清，管底部留下5 mL重懸，將2支離心管中混懸液合并，加入等體積共10 mL的NALC-NaOH混合液(現用現配)，渦旋振蕩，待標本均勻液化后靜置15 min，加入20 mL的0.067 mol/L pH 6.8的磷酸緩沖液(PBS)混勻(25 min內完成)；10 ℃、3 000×g離心20 min，棄去上清，加入PBS至終體積40 mL，充分混勻后3 000×g離心20 min，棄上清后沉淀中加入0.4 mL PBS混勻備用。

1.3.2 復蘇因子薄層瓊脂(Rpfs-TLA)快速培養(yǎng) 將復蘇因子蛋白終濃度(2 nmol/mL Rpf B和2 nmol/mL Rpf E)和100 μL處理標本混勻后接種至TLA培養(yǎng)基，應用接種棒均勻涂布，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；同時將10 μL生理鹽水和100 μL處理標本混勻后接種于TLA培養(yǎng)基設置為對照組，兩組均做復孔。每批試驗同時設加無菌生理鹽水100 μL的陰性對照和100 μL H37Rv標準株(濃度為2×103CFU/mL)的陽性對照作為質量控制。

上述培養(yǎng)于第3 d觀察無污染后，每2 d定期肉眼觀察和用顯微鏡下(100×)觀察Rpfs-TLA培養(yǎng)組和普通TLA培養(yǎng)對照組并記錄結果，培養(yǎng)60 d后停止菌落計數和培養(yǎng)時間的記錄。結果鑒定按2006年中國防癆協(xié)會《結核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》進行[10]。

1.3.3 抗酸染色涂片鏡檢 適量刮取TLA上培養(yǎng)的陽性菌落，加入0.5 mL 1×PBS(pH 6.8)研磨，取20 μL上述處理液涂于載玻片上，直徑為0.5 cm范圍，紫外線過夜自然干燥固定，萋-尼染色，載玻片干燥后油鏡下(100×)觀察結果。

1.3.4 菌種鑒定 適量刮取陽性培養(yǎng)物菌落研磨、煮沸后，用美國Qiagen公司DNA提取試劑盒提取DNA，行PCR擴增試驗(16S rRNA引物序列：F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R：5′-CCC-CGTCAATTCATTTGAGTTT-3′)，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳證實目的條帶為M.tb，并對PCR擴增產物測序及進行菌種鑒定。

2 結 果

2.1 Rpfs-TLA與普通TLA培養(yǎng)組間陽性率的比較 103例結核性胸腔積液Rpfs-TLA與普通TLA培養(yǎng)結果見表1。Rpfs-TLA培養(yǎng)組M.tb培養(yǎng)陽性率為43.7%(45/103)，普通TLA對照組M.tb培養(yǎng)陽性率為29.1%(30/103)，兩組差異有統(tǒng)計學意義(χ2=54.56，P<0.001)。Rpfs-TLA和普通TLA培養(yǎng)在34例其他疾病對照組中的陽性率均為0。

表1 Rpfs-TLA與普通TLA培養(yǎng)在結核性胸膜炎組中的培養(yǎng)結果Tab.1 Results of M.tb culture in the tuberculous pleurisy group by Rpfs-TLA and TLA

2.2 兩種不同培養(yǎng)法M.tb陽性結果報告時間比較

肉眼觀察下Rpfs-TLA和普通TLA培養(yǎng)的可視菌落平均報告時間為(18.13±2.32)d 和(29.47±3.59)d，兩組差異有統(tǒng)計學意義(t=13.99，P<0.001)；Rpfs-TLA與普通TLA培養(yǎng)在顯微鏡下觀察微菌落的平均報告時間為(11.87±2.29)d和(20.60±3.11)d，兩組差異有統(tǒng)計學意義(t=16.62，P<0.001)，Rpfs-TLA培養(yǎng)法顯微鏡下微菌落報告時間較肉眼下縮短(t=31.82，P<0.001)。

①：P<0.001圖1 不同培養(yǎng)方法顯微鏡下和肉眼觀察M.tb陽性結果報告時間Fig.1 Reporting times for Mycobacterium tuberculosis positive results,detected via a microscope and the naked eye,for different culture methods

2.3 不同培養(yǎng)組鏡下觀察M.tb菌落形成單位數比較 Rpfs-TLA培養(yǎng)組顯微鏡下觀察M.tb微菌落平均形成單位數為(75.23±10.09)×103，高于普通TLA培養(yǎng)組的(28.17 ±3.24)×103(t=4.72，P<0.001) 。

2.4 培養(yǎng)陽性菌落的細菌學和分子生物學鑒定 Rpfs-TLA培養(yǎng)組45例陽性菌落和普通TLA對照組30例陽性菌落研磨后涂片行抗酸染色，100倍油鏡下觀察均可見紅色抗酸桿菌。培養(yǎng)陽性菌落提取DNA，應用H37Rv特異性引物16S rRNA進行PCR擴增，電泳顯示上述抗酸染色為陽性的菌落PCR產物均出現目的片段，表明培養(yǎng)菌落均為M.tb。并進一步對上述PCR擴增產物進行測序分析，均為結核分枝桿菌。

2.5 Rpfs-TLA快速培養(yǎng)法診斷結核性胸膜炎的效能評價 在103例結核組和34例對照組中Rpfs-TLA快速培養(yǎng)法檢測胸腔積液M.tb，結果見表2。診斷結核性胸膜炎的靈敏度為43.7%(95%CI：34.5%～53.3%)，特異度為100%(95%CI：89.9%～100%)，診斷準確度為57.7%(95%CI：49.3%～65.6%)。

表2 Rpfs-TLA快速培養(yǎng)檢測胸腔積液結核分枝桿菌的結果Tab.2 Results of M.tb detection in the patients with pleural effusion by Rpfs-TLA

3 討 論

結核性胸膜炎患者標本的M.tb分離培養(yǎng)陽性率極低，是多年來困擾結核性胸膜炎診斷和藥敏試驗的難題。結核性胸膜炎是M.tb由近胸膜的原發(fā)病灶直接波及胸膜，或經血液、淋巴道途徑傳播至胸膜而引起的滲出性炎癥。大量的胸腔積液降低了M.tb的濃度，且M.tb因長期缺少營養(yǎng)和氧氣而處于休眠狀態(tài)，從而導致胸腔積液M.tb體外培養(yǎng)陽性率極低[6,11]。生長活躍的富含堿基G+C的革蘭氏陽性菌能產生一種使休眠菌重新活躍的復蘇因子，它是一種分子量在16～17 kDa的蛋白質。有研究發(fā)現，結核桿菌表達5種復蘇因子蛋白質，即RpfA、RpfB、RpfC、RpfD、RpfE。它們在皮摩爾級濃度就能有效的促進同源陳舊菌的復蘇、生長，但鮮有M.tb復蘇因子在結核病臨床應用領域的相關研究報道[12-14]。

劉忠泉等首次報道了脊柱結核膿液標本中復蘇因子蛋白對M.tb培養(yǎng)具有促進作用，并探索了胸腔積液M.tb培養(yǎng)中加入一定濃度Rpfs的作用效果[7,15]。本研究進一步優(yōu)化了復蘇因子培養(yǎng)，并引進顯微鏡觀察特征性微小菌落報告結果，建立了M.tbRpfs-TLA快速培養(yǎng)法，在胸腔積液M.tb培養(yǎng)的陽性率高于普通TLA培養(yǎng)(χ2=54.56，P<0.001)，且Rpfs-TLA的平均菌落形成單位數高于普通TLA (t=4.72，P<0.001),提示Rpfs可促進胸腔積液中M.tb生長，提高胸腔積液M.tb體外培養(yǎng)的陽性率[16-17]。

M.tb為慢生長菌，培養(yǎng)周期長，痰標本通常需要生長3～4周，結核性胸膜炎由于大量的胸腔積液降低了M.tb的濃度，且多為休眠菌，因此培養(yǎng)時間更長。本研究加入復蘇因子蛋白的薄層瓊脂培養(yǎng)可視菌落報告平均時間為18.13 d，較生理鹽水對照組提前了11.34 d；當采用倒置顯微鏡下定期觀察微小菌落并結合分子生物學鑒定，可進一步縮短陽性結果平均報告時間至11.87 d，表明復蘇因子培養(yǎng)可縮短報告時間，證實了Rpfs對休眠M.tb的促生長作用。M.tb分泌多種包含高保守區(qū)的復蘇因子蛋白，保守區(qū)有非常相似的結構，即含有溶解酵素和可溶性細胞溶解轉糖基酶。研究認為Rpfs的作用機制是通過切割僅存在于休眠菌細胞壁上的對細胞生長分裂有物理阻礙作用的肽聚糖，從而使休眠菌恢復生長[14,18]。Rpfs能啟動M.tb中rv1776、rv0238、mmpL等基因，從而啟動mRNA轉錄，提高細菌的自我復蘇能力，使低密度的受損或休眠的細菌恢復為可培養(yǎng)狀態(tài)，縮短細菌生長繁殖的遲滯期，加速其生長繁殖[19]。

薄層瓊脂培養(yǎng)法具有準確、快速、操作簡單、價格低廉的特點，在低收入國家可作為傳統(tǒng)L?wenstein-Jensen 培養(yǎng)以及 BACTEC MGIT-960液體培養(yǎng)的替代方法[20-21]。在肺結核檢測中TLA和 BACTEC MGIT-960的靈敏度相當，且陽性結果報告時間接近，分別為(10.6～12.5) d和(9.6～11.2) d，但BACTEC MGIT-960快速培養(yǎng)法儀器昂貴，培養(yǎng)基價格高，很難在基層普及。本研究首次引進顯微鏡觀察特征性微小菌落的TLA培養(yǎng)胸腔積液中M.tb的陽性率為29.13%，高于改良羅氏培養(yǎng)(16.1%)，與BACTEC MGIT-960(26.5%)相當[7,22]。目前已有TLA用于M.tb藥敏檢測的報道，加入復蘇因子是否也能縮短耐藥檢測時間仍需進一步研究。

34例對照組中Rpfs-TLA和普通TLA的特異度均是100%，但Rpfs-TLA從54例臨床診斷結核性胸膜炎者中檢測出了10個陽性結果，這使得實驗室確診胸膜結核患者的比率從47.57%(49/103)提高到57.28%(59/103)。從患者樣本中成功培養(yǎng)出M.tb對臨床鑒別、診斷結核性胸膜炎、確定藥物敏感性和菌株分型、加快啟動適當治療、減少醫(yī)療資源消耗有重要意義[16,23]。

總之，復蘇因子薄層瓊脂快速培養(yǎng)法具有準確、快速、陽性率高、操作簡單、價格低廉的優(yōu)點，能夠為結核性胸膜炎的診斷、鑒別提供幫助。

利益沖突：無

引用本文格式：邢愛英，杜鳳嬌，李自慧，等.復蘇因子薄層瓊脂快速培養(yǎng)法診斷結核性胸膜炎的應用研究[J].中國人獸共患病學報，2022，38(9)：802-806.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.125