日本血吸蟲(chóng)帶電多泡體蛋白5的生物學(xué)特性研究

張 旻，傅志強(qiáng)，林矯矯，洪 煬

血吸蟲(chóng)病是由裂體吸蟲(chóng)感染而引起的一種易被忽視的寄生蟲(chóng)病。目前，報(bào)告的血吸蟲(chóng)病感染病例數(shù)超過(guò)2.5億，因此，該病對(duì)全球的公共衛(wèi)生造成了較大威脅[1]。血吸蟲(chóng)的體被是一層覆蓋于整個(gè)蟲(chóng)體表面的合胞體，在蟲(chóng)體侵入終末宿主體內(nèi)進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中，該結(jié)構(gòu)進(jìn)行不斷地更新，從而使不同發(fā)育階段蟲(chóng)體體被呈現(xiàn)差異性[2]。體被是血吸蟲(chóng)與終末宿主內(nèi)環(huán)境直接作用的界面，一方面，胞質(zhì)橋可以將由位于細(xì)胞體中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器合成的產(chǎn)物運(yùn)輸?shù)襟w被中，為該結(jié)構(gòu)的形成提供原料；另一方面，宿主源性蛋白可以通過(guò)體被被膜的內(nèi)吞作用進(jìn)入到胞質(zhì)橋中，并被運(yùn)輸至高爾基體中進(jìn)行降解，為蟲(chóng)體逃避宿主的免疫攻擊提供幫助[3]。因此，體被對(duì)維持蟲(chóng)體在宿主體內(nèi)的生長(zhǎng)發(fā)育繁殖起著極為關(guān)鍵的作用，而體被蛋白也普遍被認(rèn)為是開(kāi)發(fā)抗血吸蟲(chóng)病疫苗與藥物的理想候選分子[4]。

帶電多泡體蛋白家族(Charged multivesicular body protein，CHMP)為內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體III(ESCRT-III)的重要組分，該復(fù)合體參與了多泡體(Multivesicular bodies，MVBs)的形成，而該結(jié)構(gòu)可以將與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、信號(hào)受體等相關(guān)的蛋白質(zhì)進(jìn)行分選，部分送至溶酶體降解，部分送至細(xì)胞膜上利用，從而參與到各種代謝過(guò)程中[5-6]。在擬南芥的相關(guān)研究中表明，高爾基體合成的糖轉(zhuǎn)移酶、糖蛋白以及多糖等物質(zhì)被MVBs運(yùn)送至細(xì)胞壁，從而促進(jìn)其生長(zhǎng)與更新[7]。作為CHMP家族的主要成員，CHMP5可以通過(guò)調(diào)節(jié)ESCRT-III的作用而影響MVBs發(fā)揮其功能[8]。在S.japonicum體被蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中鑒定到CHMP5，推測(cè)該蛋白可能在血吸蟲(chóng)體被更新的過(guò)程中起著重要作用[9]。

本研究對(duì)S.japonicumCHMP5基因進(jìn)行克隆、表達(dá)，分析其在不同時(shí)期蟲(chóng)體中的轉(zhuǎn)錄水平，檢測(cè)其重組蛋白的反應(yīng)原性及其在蟲(chóng)體組織中的分布情況，并評(píng)估重組蛋白在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫保護(hù)效果，為進(jìn)一步探討S.japonicumCHMP5的生物學(xué)特性提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 尾蚴、血清與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物S.japonicum尾蚴(中國(guó)大陸株)、兔抗日本血吸蟲(chóng)可溶性成蟲(chóng)抗原的免疫血清、健康兔血清、健康小鼠血清均由國(guó)家動(dòng)物血吸蟲(chóng)病參考實(shí)驗(yàn)室提供。BALB/c小鼠(雄性，6～8周齡，35只)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中S.japonicumCHMP5(FN320038.1)、S.japonicumα-tubulin(AY815746.1)的基因序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)。引物由上海華津生物技術(shù)有限公司合成。

表1 S. japonicum CHMP5和α-tubulin引物信息Tab.1 Primer sequences of S. japonicum CHMP5 and α-tubulin

1.4 CHMP5基因的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以S.japonicum成蟲(chóng)cDNA文庫(kù)為模板，以F1/R1為上下游引物，PCR擴(kuò)增CHMP5基因片段，經(jīng)酶切后連接至表達(dá)載體pET28a(+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a(+)-CHMP5，將其轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR、質(zhì)粒雙酶切和測(cè)序?qū)χ亟M質(zhì)粒鑒定。

1.5 CHMP5基因的生物信息學(xué)分析 利用BLAST在線程序搜索CHMP5基因編碼氨基酸序列的同源序列，并通過(guò)Clustalx進(jìn)行同源性比對(duì)分析。利用Compute pI/MW、TMHMM、SignalP、IEBD及GOR4等在線程序分析CHMP5氨基酸序列的理論等電點(diǎn)(pI)、相對(duì)分子質(zhì)量(MW)、跨膜結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽、B細(xì)胞抗原表位及二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.6 熒光定量PCR檢測(cè)CHMP5基因在不同發(fā)育階段S.japonicum中的轉(zhuǎn)錄水平 采用肝門(mén)靜脈灌注法收集S.japonicum7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d蟲(chóng)體及42 d雌蟲(chóng)、42 d雄蟲(chóng)，利用TRIzol法提取各時(shí)期蟲(chóng)體的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后作為模板，以F2/R2、F3/R3為上下游引物，利用SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測(cè)CHMP5、α-tubulin基因的轉(zhuǎn)錄水平。以α-tubulin基因?yàn)閮?nèi)參，采用相對(duì)定量法(2-ΔΔCt)計(jì)算CHMP5基因在不同發(fā)育時(shí)期蟲(chóng)體中的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 重組蛋白的表達(dá)、純化及質(zhì)譜鑒定 將pET28a(+)-CHMP5/BL21(DE3)宿主菌培養(yǎng)至OD600=0.6時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)6 h，將宿主菌進(jìn)行超聲裂解，收集上清液，以His Bind樹(shù)脂純化試劑盒對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)后，將SDS-PAGE凝膠上的重組CHMP5蛋白目的條帶切下，利用胰蛋白酶進(jìn)行膠內(nèi)酶解，經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF-MS)技術(shù)對(duì)重組蛋白鑒定。

1.8 Western blotting檢測(cè)重組蛋白的反應(yīng)原性 將純化的重組CHMP5蛋白與206佐劑充分乳化后，采用皮下分點(diǎn)注射法免疫5只SPF級(jí)BALB/c小鼠(20 μg，100 μL/只)，每隔兩周免疫1次，共免疫3次。于3免后第10 d，經(jīng)摘眼球采血并分離血清，即為小鼠抗CHMP5重組蛋白的免疫血清。以純化的重組CHMP5蛋白作為抗原，以兔抗日本血吸蟲(chóng)可溶性成蟲(chóng)抗原的免疫血清(1∶100)、小鼠抗CHMP5重組蛋白的免疫血清(1∶100)作為一抗，以山羊抗兔IgG-HRP(1∶1 000)、山羊抗小鼠IgG-HRP(1∶1 000)作為二抗，經(jīng)DAB顯色，通過(guò)Western blot檢測(cè)重組CHMP5蛋白的反應(yīng)原性，設(shè)健康兔血清、健康小鼠血清作為陰性對(duì)照。

1.9 免疫組化實(shí)驗(yàn)分析CHMP5在42 d蟲(chóng)體中的分布 將42 d血吸蟲(chóng)合抱成蟲(chóng)制成6 μm的冰凍切片，經(jīng)丙酮固定、10%山羊血清封閉后，以小鼠抗CHMP5重組蛋白的免疫血清(1∶100)作為一抗，以山羊抗小鼠IgG-Cy3(1∶1 000)作為二抗，經(jīng)DAPI(10 μg/mL)復(fù)染，通過(guò)熒光顯微鏡觀察CHMP5在血吸蟲(chóng)蟲(chóng)體中的定位情況并進(jìn)行拍照，設(shè)健康小鼠血清作為陰性對(duì)照。

1.10 重組蛋白對(duì)小鼠免疫保護(hù)效果的評(píng)價(jià) 將30只SPF級(jí)BALB/c小鼠隨機(jī)等分成3組，即：重組蛋白免疫組、佐劑對(duì)照組及PBS對(duì)照組。重組蛋白免疫組小鼠注射含PBS、206佐劑和20 μg純化重組CHMP5蛋白的乳化液(100 μL/只)，佐劑對(duì)照組小鼠注射含206佐劑和PBS的乳化液(100 μL/只)，PBS對(duì)照組小鼠注射等體積的PBS。每隔14 d免疫1次，共免疫3次。第3次免疫后的14 d，3組小鼠均經(jīng)腹部皮膚貼片法感染S.japonicum尾蚴(40±1)條/只。于免疫后0 d、10 d、24 d、38 d、84 d，經(jīng)眼眶靜脈竇采血并分離血清。以純化的重組CHMP5蛋白作為包被抗原(10 μg/mL)，以各組小鼠血清(1∶100)作為一抗，以山羊抗小鼠IgG-HRP(1∶1 000)作為二抗，利用間接ELISA法檢測(cè)特異性抗體水平。于感染后第42 d剖檢小鼠，采用肝門(mén)靜脈灌注法收集蟲(chóng)體并計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)減蟲(chóng)率；通過(guò)鏡檢計(jì)算肝組織蟲(chóng)卵數(shù)，統(tǒng)計(jì)肝臟減卵率。

1.11 統(tǒng)計(jì)方法 利用Excel 2010和SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，數(shù)據(jù)間比較用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CHMP5基因的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的鑒定 以S.japonicum成蟲(chóng)cDNA文庫(kù)為模板，PCR擴(kuò)增獲得大小約為675 bp的CHMP5基因目的片段，將其連接至表達(dá)載體pET28a(+)構(gòu)建重組質(zhì)粒，利用限制性內(nèi)切酶BamH I與XhoI對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定(圖1)，表明成功獲得重組質(zhì)粒pET28a(+)-CHMP5。

2.2 CHMP5基因編碼氨基酸序列的生物信息學(xué)分析 對(duì)重組質(zhì)粒pET28a(+)-CHMP5進(jìn)行測(cè)序，分析其編碼的氨基酸序列，結(jié)果顯示，該測(cè)序序列編碼224個(gè)氨基酸，與目標(biāo)序列完全相符。利用NCBI的BLAST對(duì)S.japonicumCHMP5氨基酸序列進(jìn)行相似性搜索，選擇來(lái)自牛血吸蟲(chóng)(Schistosomabovis，RTG85136)、華支睪吸蟲(chóng)(Clonorchissinensis，GAA55213)、人類(Homosapiens，NP_057494)、牛(Bostaurus，NP_001029854)、小鼠(Musmusculus，NP_084090)共5個(gè)物種的CHMP5蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)(圖2)。結(jié)果顯示，S.japonicumCHMP5與牛血吸蟲(chóng)的CHMP5相似性為82%，與其余物種的CHMP5相似性介于50%～56%。

M:DL2 000 DNA Marker;1:pET28a(+);2:pET28a(+)-CHMP5;3:pET28a(+)-CHMP5雙酶切圖1 重組質(zhì)粒pET28a(+)-CHMP5的鑒定Fig.1 Identification of the recombinant plasmid pET28a(+)-CHMP5

圖2 不同物種CHMP5氨基酸序列的同源性分析Fig.2 Homology analysis of the derived amino acid sequences of CHMP5 from various species

該蛋白pI為4.63，MW約為25 kDa，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，無(wú)信號(hào)肽。在該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，無(wú)規(guī)則卷曲所占比例為47.32%，α-螺旋為46.88%，延伸鏈為5.8%。S.japonicumCHMP5氨基酸序列中存在6個(gè)長(zhǎng)度大于7個(gè)氨基酸[10]的B細(xì)胞抗原表位，主要分布于aa5-aa18、aa28-aa37、aa43-aa63、aa70-aa85、aa120-aa133、aa147-aa221，表明該蛋白可能具有良好的反應(yīng)原性。

2.3 CHMP5基因在不同發(fā)育時(shí)期蟲(chóng)體中的轉(zhuǎn)錄水平 利用SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測(cè)CHMP5基因在S.japonicum感染7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d蟲(chóng)體及42 d雌蟲(chóng)、42 d雄蟲(chóng)中的轉(zhuǎn)錄水平(圖3)，其在35 d、42 d蟲(chóng)體中的轉(zhuǎn)錄水平高于7 d、14 d、21 d、28 d蟲(chóng)體中的轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05)，在42 d雌蟲(chóng)中的轉(zhuǎn)錄水平約是42 d雄蟲(chóng)的3倍(F=718.465，P<0.05)。結(jié)果表明，在終末宿主小鼠體內(nèi)，CHMP5基因在蟲(chóng)體的發(fā)育過(guò)程中持續(xù)表達(dá)，且轉(zhuǎn)錄水平呈升高趨勢(shì)。

注：柱圖上所標(biāo)數(shù)字相同表示二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，所標(biāo)數(shù)字不同表示二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。圖3 CHMP5在不同時(shí)期、性別S. japonicum蟲(chóng)體中的轉(zhuǎn)錄情況Fig.3 Patterns of stage- and sex-specific differential expression of CHMP5 in S. japonicum

2.4 重組蛋白的表達(dá)、純化及質(zhì)譜鑒定 重組CHMP5蛋白在IPTG(1 mmol/L)誘導(dǎo)6 h時(shí)達(dá)到最大表達(dá)量，且以可溶性蛋白形式存在，經(jīng)His Bind樹(shù)脂純化，通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后的pET28a(+)-CHMP5/BL21(DE3)宿主菌在34 kDa左右出現(xiàn)了目的條帶，略大于理論值29 kDa，且純化后的產(chǎn)物呈現(xiàn)出單一的目的條帶(圖4)。利用MALDI-TOF/TOF-MS技術(shù)對(duì)SDS-PAGE凝膠上單一的目的條帶進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示該產(chǎn)物確實(shí)為S.japonicumCHMP5，Mascot檢索分值為446分，肽段匹配數(shù)為9個(gè)，序列覆蓋率為39.29%。表明獲得純化的S.japonicum重組CHMP5蛋白。

M:蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:誘導(dǎo)后的pET28a(+)/BL21(DE3)宿主菌;2:誘導(dǎo)后的pET28a(+)-CHMP5/BL21(DE3)宿主菌;3:純化后的重組CHMP5蛋白圖4 重組CHMP5蛋白表達(dá)和純化的SDS-PAGE檢測(cè)Fig.4 Expression and purification analysis of the recombinant CHMP5 protein by SDS-PAGE

2.5 重組蛋白的反應(yīng)原性分析 以重組CHMP5蛋白為抗原進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果顯示，重組蛋白與兔抗日本血吸蟲(chóng)可溶性成蟲(chóng)抗原的免疫血清(圖5A)、小鼠抗CHMP5重組蛋白的免疫血清(圖5C)發(fā)生了特異性反應(yīng)，于34 kDa處出現(xiàn)了特異性條帶，而陰性對(duì)照無(wú)反應(yīng)(圖5B、圖5D)，表明該重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性和免疫原性。

M:蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:兔抗日本血吸蟲(chóng)可溶性成蟲(chóng)抗原的免疫血清;2:健康兔血清;3:小鼠抗CHMP5重組蛋白的免疫血清;4:健康小鼠血清圖5 重組CHMP5蛋白反應(yīng)原性的Western blotting鑒定Fig.5 Reactogenicity analysis of the recombinant CHMP5 protein by Western blotting

2.6 CHMP5蛋白在42 d蟲(chóng)體中的分布 以小鼠抗CHMP5重組蛋白的免疫血清、健康小鼠血清作為一抗進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，前者在42 d血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)體被出現(xiàn)了特異性的紅色熒光(圖6A)，而后者無(wú)反應(yīng)(圖6B)。結(jié)果表明，CHMP5主要分布于S.japonicum蟲(chóng)體的體被上。

A:小鼠抗CHMP5重組蛋白的免疫血清;B:健康小鼠血清圖6 S. japonicum CHMP5蛋白的免疫組化實(shí)驗(yàn)分析(100×)Fig.6 Immunolocalization of CHMP5 in adult S. japonicum,detected by IHC (100×)

2.7 免疫小鼠血清抗重組蛋白特異性抗體的檢測(cè) 用間接ELISA方法檢測(cè)重組蛋白免疫組、佐劑對(duì)照組及PBS對(duì)照組小鼠血清中抗CHMP5重組蛋白特異性IgG抗體的變化，結(jié)果顯示，與兩個(gè)對(duì)照組相比，重組蛋白免疫組小鼠的抗體滴度在免疫24 d時(shí)即達(dá)到較高水平，并在免疫38 d時(shí)略有升高至最大值，直到感染后42 d剖殺動(dòng)物時(shí)，抗體一直維持在較高水平(圖7)。表明重組CHMP5蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

圖7 小鼠抗CHMP5重組蛋白特異性IgG抗體水平的ELISA檢測(cè)Fig.7 ELISA detection of specific IgG antibodies against the recombinant CHMP5 protein in mouse sera

2.8 重組蛋白在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫保護(hù)效果 重組蛋白免疫組、佐劑對(duì)照組及PBS對(duì)照組所有小鼠于3免后2周攻擊感染尾蚴，42 d后計(jì)算減蟲(chóng)率及肝臟減卵率。結(jié)果顯示，PBS對(duì)照組、佐劑對(duì)照組、重組蛋白免疫組的小鼠平均荷蟲(chóng)數(shù)分別為25.2±6.2、24.5±5.8、19.9±5.4，平均每克肝組織蟲(chóng)卵數(shù)分別為88 665±10 894、85 333±10 020、48 660±9 238(圖8)。與佐劑對(duì)照組相比，重組CHMP5蛋白在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)了18.96%的減蟲(chóng)率和42.98%的肝臟減卵率，表明該重組蛋白可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生部分的免疫保護(hù)效果。

①：P<0.05；②：P<0.01圖8 重組CHMP5蛋白在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫保護(hù)效果Fig.8 Immunoprotective effects induced by the recombinant CHMP5 protein in mice

3 討 論

輻射致弱的血吸蟲(chóng)尾蚴/童蟲(chóng)疫苗是目前公認(rèn)最為有效的抗血吸蟲(chóng)感染的免疫原，在小鼠、豬等多種動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的免疫保護(hù)效果，但是由于存在不安全性、蟲(chóng)體來(lái)源受限等缺點(diǎn)而無(wú)法在現(xiàn)場(chǎng)推廣使用[11]。近些年來(lái)，國(guó)內(nèi)外的科學(xué)家利用分子生物學(xué)技術(shù)鑒定到一些具有免疫保護(hù)性作用的抗原分子，進(jìn)而推動(dòng)了基因工程疫苗的發(fā)展。其中，埃及血吸蟲(chóng)的Sh28GST以及曼氏血吸蟲(chóng)的Sm14、SmTSP-2和Smp80已經(jīng)分別進(jìn)入臨床試驗(yàn)[12]。Sh28GST的重組蛋白免疫猴子后，使其膀胱、肝、腸、肺等組織蟲(chóng)卵總數(shù)減少50%，尿液和糞便蟲(chóng)卵總數(shù)減少77%[13]。Smp80的重組蛋白誘導(dǎo)狒狒產(chǎn)生了93%的減蟲(chóng)率(雌蟲(chóng))、90%的肝及腸組織總減卵率，使糞便蟲(chóng)卵孵化率降低了81%[14]。體被是血吸蟲(chóng)與宿主血液直接接觸的界面，所以普遍認(rèn)為其與血吸蟲(chóng)營(yíng)養(yǎng)攝取、免疫逃避、免疫調(diào)節(jié)、排泄、滲透壓調(diào)節(jié)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等密切相關(guān)[15]。體被蛋白作為生物學(xué)功能的承擔(dān)者，通過(guò)對(duì)其研究有可能發(fā)現(xiàn)新的疫苗候選分子。

在前期圍繞S.japonicum體被開(kāi)展的免疫蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，鑒定到了S.japonicumCHMP5，推測(cè)該蛋白很可能定位于體被上。在本研究中，利用免疫組化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明其為體被蛋白。熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，S.japonicumCHMP5基因在42 d雌蟲(chóng)中的轉(zhuǎn)錄水平約是42 d雄蟲(chóng)的3倍。這可能是由于S.japonicumCHMP5通過(guò)參與MVBs的形成而參與到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝、信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程[6,8]，而42 d雌蟲(chóng)大量產(chǎn)卵需要消耗更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而引起該基因在42 d雌蟲(chóng)中的轉(zhuǎn)錄水平高于42 d雄蟲(chóng)中的轉(zhuǎn)錄水平。利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)S.japonicumCHMP5氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，其具有6個(gè)B細(xì)胞抗原表位，而后者為能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體的物質(zhì)基礎(chǔ)，提示該蛋白在理論上可能具有良好的反應(yīng)原性。

重組CHMP5蛋白的理論分子量約為29 kDa，但在SDS-PAGE分析中出現(xiàn)在34 kDa大小的位置，將其純化產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，結(jié)果證明該重組蛋白為S.japonicumCHMP5，推測(cè)出現(xiàn)這種問(wèn)題很有可能是因?yàn)樵摰鞍姿鶐щ姾捎绊懥似湓赟DS-PAGE凝膠上的遷移。以純化的重組CHMP5蛋白為抗原進(jìn)行Western blotting分析，結(jié)果顯示，該蛋白與兔抗日本血吸蟲(chóng)可溶性成蟲(chóng)抗原的免疫血清、小鼠抗CHMP5重組蛋白的免疫血清均能發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)，具有較好的反應(yīng)原性和免疫原性，為該蛋白作為抗日本血吸蟲(chóng)病保護(hù)性抗原研究奠定了一定基礎(chǔ)。

以小鼠為動(dòng)物模型進(jìn)行免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，重組CHMP5蛋白不僅刺激機(jī)體產(chǎn)生了高水平的特異性IgG抗體，還誘導(dǎo)其產(chǎn)生了18.96%的減蟲(chóng)率和42.98%的肝臟減卵率。目前，普遍認(rèn)為有效的預(yù)防性疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的減蟲(chóng)率和減卵率都應(yīng)達(dá)到75%[12]?？梢酝ㄟ^(guò)更換佐劑或者將多種蛋白的保護(hù)性抗原表位串聯(lián)制成嵌合蛋白等多種方式來(lái)提高S.japonicumCHMP5的免疫保護(hù)力[16]，這為未來(lái)的研究提供了思路。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：張旻，洪煬，傅志強(qiáng)，等.日本血吸蟲(chóng)帶電多泡體蛋白5的生物學(xué)特性研究[J]．中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(9)：764-770.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.120