妊娠期糖尿病患者胎盤組織中Apelin和APJ的表達(dá)及其對滋養(yǎng)層細(xì)胞胰島素抵抗和行為的影響

劉莎莎,趙 云,孫國強,陳菲菲

（1.湖北省婦幼保健院產(chǎn)科，湖北 武漢 430070；2.湖北省婦幼保健院婦產(chǎn)科，湖北 武漢 430070）

妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）是一種以患者妊娠期間不同程度糖耐量異常為特征的代謝性疾?。?］。隨著生活節(jié)奏的加快和高齡產(chǎn)婦的增加，GDM的發(fā)病率呈逐年升高趨勢［2］。GDM嚴(yán)重影響母嬰健康，其不僅導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局的發(fā)生，還使患者及其后代遠(yuǎn)期發(fā)生2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）和其他類型代謝綜合征的風(fēng)險明顯增加［3-5］。盡管GDM的 發(fā) 生 機 制 尚 未 完 全 闡 明，但 研 究［6-7］證 實：GDM與T2DM相 似，即 胰 島 素 抵 抗（insulin resistance，IR）和糖代謝紊亂在GDM的發(fā)生進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。同時，研究［8］表明：上述代謝異常能夠損傷滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖和侵襲等功能，而后者是導(dǎo)致胎盤組織病理改變和不良妊娠結(jié)局的重要誘導(dǎo)因素。Apelin作為血管緊張素Ⅱ1型受體相關(guān)蛋白（angtiotensinⅡtype 1 receptor associated protein，APJ）的內(nèi)源性配體，廣泛表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和胎盤等組織器官中［9］。研究［10-11］顯示：在T2DM肥胖患者的外周血和皮下脂肪組織中Apelin/APJ表達(dá)明顯增加，進(jìn)一步研究證實其可能通過增加葡萄糖的利用而提高胰島素的敏感性，即Apelin/APJ系統(tǒng)能改善T2DM患者的IR。但GDM患者Apelin/APJ的表達(dá)及其是否參與GDM患者胎盤組織的IR和對滋養(yǎng)層細(xì)胞功能的影響尚不明確。腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）途徑是經(jīng)典的能量代謝信號通路，其不僅能夠調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的增殖和分化，還能參與胰島素信號的傳導(dǎo)，放大和調(diào)控IR并發(fā)揮作用，從而介導(dǎo)T2DM的 發(fā) 生［12-13］。同 時，AMPK在GDM患 者胎盤組織中呈異常低表達(dá)，并與高糖（high glucose，HG）條件下滋養(yǎng)層細(xì)胞的功能損傷有關(guān)［14］。因此，本研究檢測Apelin和APJ在GDM患者胎盤組織中的表達(dá)，探究其對滋養(yǎng)層細(xì)胞IR和增殖及侵襲功能的影響，進(jìn)一步闡明GDM的發(fā)病機制，以期為GDM的治療提供新的靶點和可能性。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2019年5月—2020年5月于湖北省婦幼保健院產(chǎn)科定期產(chǎn)檢且住院行剖宮產(chǎn)術(shù)分娩的孕產(chǎn)婦60例作為研究對象，進(jìn)行回顧性分析。根據(jù)是否患有GDM將研究對象分為2組：GDM組30例，糖 耐 量 正 常（normal glucose tolerance，NGT）組30例。術(shù)中取出胎盤后，立即由臍帶附著處中央部位取約1 cm×1 cm×1 cm胎盤絨毛組織，30 min內(nèi)運回實驗室保存于液氮中，進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實驗。所有受試者或家屬均簽署書面知情同意書，且本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：①GDM組為根據(jù)第9版《婦產(chǎn)科學(xué)》的GDM診療標(biāo)準(zhǔn)診斷為GDM的患者，即在孕24～28周空腹接受75 g葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT），空 腹 血 糖≥5.1 mmol·L－1和（或）OGTT-1 h血糖≥10.0 mmol·L－1和（或）OGTT-2 h血 糖≥8.5 mmol·L－1的孕產(chǎn)婦。②NGT組為年齡和孕周等與GDM組患者相匹配的NGT者，即在孕24～28周空腹接受75 g OGTT，空腹血糖＜5.1 mmol·L－1和（或）OGTT-1 h血糖＜10.0 mmol·L－1和（或）OGTT-2 h血糖＜8.5 mmol·L－1的孕產(chǎn)婦。排除標(biāo)準(zhǔn)：①孕產(chǎn)婦年齡＜20歲或＞35歲；②妊娠期并發(fā)糖尿病的患者，OGTT-空 腹 血 糖≥7.0 mmol·L－1和（或）OGTT-2 h血糖≥11.1 mmol·L－1和（或）糖化 血 紅 蛋 白（glycated hemoglobin，HbA1c）＞6.5%；③妊娠并發(fā)心腦血管、肺、肝和腎等器官疾病，妊娠并發(fā)甲狀腺疾病等其他并發(fā)癥者；④非自然妊娠或多胎妊娠者；⑤早產(chǎn)和宮內(nèi)生長受限等不良妊娠結(jié)局者。

1.3 細(xì)胞、主要試劑和儀器人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR-8/SVneo（HTR-8）購自美國模式培養(yǎng)物研 究 所 （American Type Culture Collection，ATCC）。DMEM培養(yǎng)基和1%青-鏈雙抗溶液（美國Hyclone公司），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（浙江天杭生物科技股份有限公司），兔抗Apelin和兔抗APJ抗體（美國Santa Cruz公司），TRIzol裂解液、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix EX TaqⅡKit（日本TaKaRa公司），兔抗胰島素受體底物1（insulin receptor substrate 1，IRS1）和磷脂酰 肌 醇3-激 酶 （phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）抗 體（美 國Cell Signaling Technology公司），兔抗胰島素受體底物2（insulin receptor substrate 2，IRS2）、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）、 磷 酸 化PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）、磷酸化AMPK（phosphorylated AMPK，p-AMPK）和AMPK抗體（美國Proteintech公司），牛血清白蛋白（北京索萊寶生物科技有限公司），5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2′-deoxyuridine，EdU）試劑盒（美國Thermo公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物科技有限公司），Transwell小室（美國Corning Costar公司），BCA蛋白定量試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）引物由生工生物（上海）股份有限公司設(shè)計并合成。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司），PCR儀（9902型）（美國Applied Biosystems公司），倒置光學(xué)顯微鏡（DXM1200型）（日本Nikon公司）。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和分組常規(guī)復(fù)蘇HTR-8細(xì)胞后，采用含10%FBS和1%青-鏈雙抗溶液的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至融合80%～90%時，棄上清，采用0.25%胰蛋白酶消化傳代，每3 d按1∶3傳代1次。取處于對數(shù)生長期的HTR-8細(xì)胞，按4×105mL－1細(xì)胞密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并按細(xì)胞處理方式的不同分為對照組（DMEM培養(yǎng)基中葡萄糖含量為5 mmol·L－1）、Apelin組（DMEM培 養(yǎng) 基 中 加 入10 μg·L－1Apelin［15］）、HG組（DMEM培養(yǎng)基中葡萄糖含量為25 mmol·L－1），HG+Apelin組（HG培 養(yǎng)基 中 加入10 μg·L－1Apelin）和HG+Apelin+anti-APJ組（HG培 養(yǎng) 基 中 加入10 μg·L－1Apelin與40 μg·L－1中和抗體anti-APJ）。各組細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后用于后續(xù)實驗。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測2組研究對象胎盤組織中Apelin和APJ陽性表達(dá)率將胎盤組織樣本置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，切片至4 μm后，二甲苯和梯度酒精脫蠟至水，檸檬酸鈉進(jìn)行抗原修復(fù)，雙氧水封閉過氧化物酶，山羊血清封閉抗體，加入一抗：兔抗Apelin（1∶300），兔抗APJ（1∶300），4℃孵育過夜，隨后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶500），37℃孵育30 min，加入DAB試劑顯色，蘇木精復(fù)染，再次使用梯度酒精和二甲苯脫水，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察并拍照，計算胎盤組織中Apelin和APJ蛋白陽性表達(dá)率。其中細(xì)胞核為藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)中Apelin和APJ的陽性表達(dá)為棕黃色或黃褐色。Apelin或APJ陽性 表達(dá)率=Apelin或APJ陽 性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6 RT-qPCR法檢測2組研究對象胎盤組織中Apelin和APJ mRNA表達(dá)水平TRIzol裂 解液裂解細(xì)胞后提取胎盤絨毛組織中總RNA，紫外分光光度計測量總RNA濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書方法將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以其為模板按照PCR試劑盒說明書進(jìn)行反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù) 變性15 min，94℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸32 s，共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法計算目的基因mRNA表達(dá)水平。實 驗 單 獨 重 復(fù)3次。PCR引 物 序 列：Apelin，F(xiàn) 5′-CTGCAGTGTGGCCTGTACAAGGCGCTC-3′，R 5′-AAGCGCCCGGCGCTTGAGCCTT-3′；APJ，F(xiàn) 5′-CTCATATAAGTGTCAGGGCCAAG-3′，R 5′-GAGAAGCGTCAGCGCCCTTGGCC-3′；β-actin，F(xiàn) 5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，R 5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。

1.7 Western blotting法檢測2組研究對象胎盤組織和各組HTR-8細(xì)胞中IR相關(guān)蛋白表達(dá)水平和蛋白磷酸化水平采用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液于冰上提取胎盤組織樣本和各組HTR-8細(xì)胞中總蛋白，BCA法蛋白定量，加熱變性后凝膠電泳分離，冰水中轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，置于含5%牛血清白蛋白于室溫下抗體封閉2 h，TBST緩沖液充分洗滌后，加入一抗：Apelin（1∶500）、APJ（1∶500）、IRS1（1∶800）、IRS2（1∶800）、GLUT4（1∶800）、p-PI3K（1∶1 000）、PI3K（1∶1 000）、p-AMPK（1∶1 000）、AMPK（1∶1 000）和β-actin（1∶2 000），4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗滌，隨后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000），室溫下孵育2 h，加入ECL化學(xué)發(fā)光液，采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計算目的蛋白表達(dá)水平和蛋白磷酸化水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值。實驗單獨重復(fù)3次。

1.8 EdU熒光染色法檢測各組HTR-8細(xì)胞EdU陽性表達(dá)率取生長狀態(tài)良好的各組HTR-8細(xì)胞，常規(guī)消化后，按每孔2×104個接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，棄原培養(yǎng)液，4%多聚甲醛室溫下固定15 min，加入50 mmol·L－1EdU試劑37℃孵育2 h，0.5 mL 1×Hoechst 3342染色液染核后，熒光顯微鏡觀察并拍照。其中細(xì)胞核為藍(lán)色熒光，EdU陽性細(xì)胞核為紅色熒光，采用Image J軟件分析熒光強度，計算EdU陽性表達(dá)率。EdU陽性表達(dá)率=EdU陽性細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)×100%。實驗單獨重復(fù)3次。以EdU陽性表達(dá)率反映細(xì)胞增殖情況。

1.9 Transwell小室實驗檢測各組HTR-8侵襲細(xì)胞數(shù)取生長狀態(tài)良好的HTR-8細(xì)胞按每孔3×104個接種于預(yù)先采用BD基質(zhì)膠包被的Transwell上室中，下室加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。孵育24 h后，取出上室，擦拭未穿出的細(xì)胞后，4%多聚甲醛固定20 min，0.5%結(jié)晶紫染色。每組隨機選取5個視野顯微鏡觀察并拍照，計數(shù)各組侵襲細(xì)胞數(shù)。實驗單獨重復(fù)3次。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 21.0和GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。2組研究對象一般臨床特征、胎盤組織中Apelin和APJ蛋白及mRNA表達(dá)水平、AMPK mRNA表達(dá)水平、各組HTR-8細(xì)胞中IR相關(guān)蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞EdU陽性表達(dá)率和侵襲細(xì)胞數(shù)均符合正態(tài)分布，以-x±s表示，2組間樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t檢驗。2組研究對象胎盤組織中Apelin和APJ mRNA表達(dá)水平與AMPK mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，Apelin和APJ陽性表達(dá)率組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2組研究對象主要臨床特征與NGT組比較，GDM組 孕 產(chǎn) 婦 年 齡 ［（31.50±4.16） 和（33.26±2.91）歲］、孕 次［（2.03±1.25）和（2.00±0.77）次］、孕前體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）［（28.20±3.72） 和 （28.18±3.51）kg·m－2］、產(chǎn) 前BMI［（26.92±2.50）和（27.74±3.19）kg·m－2］、收 縮 壓［（106.21±18.62）和（111.49±17.16）mmHg］、舒 張 壓［（72.17±6.14）和（70.32±8.31）mmHg］、孕周［（38.12±0.78）和（38.02±0.76）周］、胎 盤 質(zhì) 量［（598.11±24.056）和（587.04±33.17）g］和外周血Apelin水平［（0.42±0.02）和（0.40±0.05）ng·L－1］差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），OGTT-空腹血糖［（4.22±0.31）和（5.32±0.51）mmol·L－1］、OGTT-1 h血 糖［（8.11±0.72）和（9.65±1.29）mmol·L－1］、OGTT-2 h血 糖［（7.20±0.56）和（8.24±1.66）mmol·L－1］、IR指數(shù)（1.03±0.09和3.37±0.11）和HbA1c（5.05%±0.32%和5.51%±0.53%）均明顯升高（P＜0.01）。

2.2 胎盤組織中Apelin和APJ陽性表達(dá)率及蛋白表達(dá)水平免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果顯示：Apelin和APJ在2組研究對象胎盤組織的滋養(yǎng)層細(xì)胞胞質(zhì)中廣泛表達(dá)。與NGT組（62.13%和57.19%）比較，GDM組研究對象胎盤組織中Apelin和APJ的陽性表達(dá)率（23.41%和16.55%）均明顯降低（P＜0.05）。Western blotting法檢測結(jié)果顯示：與NGT組比較，GDM組研究對象胎盤組織中Apelin和APJ蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05）。見圖1和2。

圖1 2組研究對象胎盤組織中Apelin和APJ陽性表達(dá)情況(免疫組織化學(xué)，Bar=100 μm)Fig.1 Positive expression of Apelin and APJ in placenta tissue of subjects in two groups(Immunohistochemistry,Bar=100 μm)

2.3 胎盤組織中Apelin和APJ mRNA表達(dá)水平及其與AMPKmRNA表達(dá)水平的相關(guān)性RT-qPCR檢測結(jié)果顯示：與NGT組比較，GDM組研究對象胎盤組織中Apelin和APJ mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見 圖3。與NGT組（4.07±0.843）比較，GDM組研究對象胎盤組織中AMPK mRNA表達(dá)水平（1.03±0.222）明顯降低（P＜0.05）。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示：胎盤組織中Apelin和APJ mRNA表達(dá)水平與AMPK mRNA表達(dá)水平均呈正相關(guān)關(guān)系（R2=0.148，P＜0.05；R2=0.275，P＜0.05）。見圖4。

圖3 RT-qPCR法檢測2組研究對象胎盤組織中Apelin和APJ mRNA表 達(dá) 水 平Fig.3 Expression levels of Apelin and APJ mRNA in placenta tissue of subjects in two groups detected by RT-qPCR method

圖4 Pearson相關(guān)分析法分析GDM患者胎盤組織中Apelin（A）和APJ（B）mRNA表達(dá)水平與AMPK mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性Fig.4 Correlations between expression levels of Apelin（A）and APJ（B）mRNA and expression level of AMPK mRNA in placenta tissue of GDM patients analyzed by Pearson correlation analysis method

2.4 各組HTR-8細(xì)胞中IR相關(guān)蛋白表達(dá)水平和磷酸化水平Western blotting法檢測結(jié)果顯示：與對照組比較，Apelin組細(xì)胞中Apelin、APJ、IRS1、IRS2和GLUT4蛋 白 表 達(dá) 水 平 及p-PI3K/PI3K和p-AMPK/AMPK比 值 明 顯 升 高（P＜0.05）；HG組 細(xì) 胞 中Aplein、APJ、IRS1、IRS2和GLUT4蛋白表達(dá)水平及p-PI3K/PI3K和p-AMPK/AMPK比值明顯降低（P＜0.05）；HG+Apelin組和HG+Apelin+anti-APJ組 細(xì) 胞 中APJ、IRS1、IRS2和GLUT4蛋白表達(dá)水平及p-PI3K/PI3K和p-AMPK/AMPK比 值 明 顯 降 低（P＜0.05），Apelin蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與HG組 比 較，HG+Apelin組 和HG+Apelin+anti-APJ組細(xì)胞中Apelin蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），HG+Apelin組細(xì)胞中APJ蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），HG+Apelin+anti-APJ組細(xì)胞中APJ蛋白表達(dá)水平明顯降 低（P＜0.05），HG+Apelin組 細(xì) 胞 中IRS1、IRS2和GLUT4蛋白表達(dá)水平及p-PI3K/PI3K和p-AMPK/AMPK比值明顯升高（P＜0.05）；HG+Apelin+anti-APJ組細(xì)胞中上述各指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 各組HTR-8細(xì)胞中IR相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.5 Electrophoregram(A)and histogram(B)of expressions of IR related proteins in HTR-8 cells in various groups

2.5 各組HTR-8細(xì)胞EdU陽性表達(dá)率與對照組比較，Apelin組細(xì)胞EdU陽性表達(dá)率明顯升高（P＜0.05），HG組、HG+Apelin組 和HG+Apelin+anti-APJ組細(xì)胞EdU陽性表達(dá)率均明顯降低（P＜0.05）；與HG組比較，HG+Apelin組細(xì)胞EdU陽性表達(dá)率明顯升高（P＜0.05），HG+Apelin+anti-APJ組細(xì)胞EdU陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖6和7。

圖2 Western blotting法檢測2組研究對象胎盤組織中Apelin和APJ蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.2 Electrophoregram(A)and histogram(B)of expressions of Apelin and APJ proteins in placenta tissue of subjects in two groups detected by Western blotting method

圖6 各組細(xì)胞EdU染色陽性表達(dá)情況(Bar=100 μm)Fig.6 Positive expression of EdU staining of cells in various groups(Bar=100 μm)

2.6 各組HTR-8細(xì)胞中侵襲細(xì)胞數(shù)Transwell小室實驗結(jié)果顯示：與對照組比較，Apelin組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯升高（P＜0.05），HG組、HG+Apelin組和HG+Apelin+anti-APJ組侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯降低（P＜0.05）；與HG組比較，HG+Apelin組HTR-8侵襲細(xì)胞數(shù)明顯升高（P＜0.05），HG+Apelin+anti-APJ組侵襲細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖8和9。

圖8 Transwell小室實驗檢測各組細(xì)胞侵襲情況（結(jié)晶紫，Bar=50 μm）Fig.8 Invasion of cells in various groups detected by Transwell chamber assay(Crystal violet,Bar=50 μm)

3 討 論

研究［10］表明：Apelin/APJ系統(tǒng)可能通過調(diào)節(jié)組織中葡萄糖的代謝而影響包括GDM在內(nèi)的代謝性疾病，但其具體作用機制尚未完全闡明。本研究結(jié)果顯示：GDM患者胎盤組織中Apelin及其受體APJ和AMPK均異常低表達(dá)；進(jìn)一步的研究表明：外源性給予Aplein不僅能改善HG環(huán)境中HTR-8細(xì)胞IR，還能保護HTR-8細(xì)胞的增殖和侵襲能力，可能是通過上調(diào)AMPK蛋白表達(dá)而發(fā)揮作用。

研究［16］顯示：GDM患者外周血中Apelin水平與健康對照者比較無明顯差異，與本研究結(jié)果相似，均顯示在GDM患者和NGT研究對象外周血中Apelin水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與Apelin廣泛表達(dá)于心腦血管等器官組織和內(nèi)皮細(xì)胞中從而使兩者在血液循環(huán)中較難存在差異性變化有關(guān)。VAUGHAN等［15］發(fā)現(xiàn)：Aplein和APJ在胎盤組織中表達(dá)，且可能參與調(diào)節(jié)胎盤血流量和糖脂代謝。本研究結(jié)果顯示：與NGT組比較，GDM組患者胎盤組織中Aplein和APJ mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯降低，提示胎盤組織中Aplein和APJ的表達(dá)可能是GDM發(fā)生的影響因素。細(xì)胞中能量代謝的關(guān)鍵分子AMPK，同樣在GDM胎盤組織中呈異常低表達(dá)，且在T2DM誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的研究［17］中顯示：Apelin能夠通過AMPK途徑改善HG誘導(dǎo)的心臟縫隙連接蛋白43水平的降低。在多囊卵巢中也發(fā)現(xiàn)Aplein可通過激活A(yù)MPK與PI3K/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路，增加胰島素樣生長因子1誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞中類固醇的生成［18］。因此，AMPK途徑可能作為細(xì)胞中Aplein發(fā)揮糖脂代謝的下游通路。本研究中Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示：在GDM胎盤組織中Apelin及其受體APJ mRNA表達(dá)水平與AMPK mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系，進(jìn)一步證實兩者在異常的糖代謝中可能存在相互作用。

圖7 各組HTR-8細(xì)胞EdU陽性表達(dá)率Fig.7 Positive expression rates of HTR-8 cells in various groups

在胰島素信號傳遞系統(tǒng)中，IRS1/2是作為起始步驟，激活下游PI3K/Akt途徑和以GLUT4為主的葡萄糖轉(zhuǎn)運體的易位，最終促進(jìn)葡萄糖的吸收和利用［19］。而上述蛋白被廣泛認(rèn)為是胰島素介導(dǎo)葡萄糖利用的重要調(diào)控因子，常被用來衡量組織或器官的胰島素敏感性水平［20］。同時，AMPK的活化也能促進(jìn)GLUT4的膜易位［21］。本研究結(jié)果顯示：外源性給予Aplein能明顯促進(jìn)HG環(huán)境下HTR-8細(xì)胞中胰島素信號分子IRS1/2及GLUT4的表達(dá)和PI3K的磷酸化水平，但阻滯APJ受體表達(dá)后，Aplein對上述蛋白的促進(jìn)作用被抑制，提示在HTR-8細(xì)胞中Apelin的促胰島素敏感作用需通過與其受體APJ結(jié)合，而該作用可能與Aplein和APJ可上調(diào)AMPK的磷酸化水平有關(guān)。

滋養(yǎng)層細(xì)胞作為胎盤組織的重要組成細(xì)胞，其正常生物學(xué)功能的維持對胎盤形成和發(fā)育至關(guān)重要，而滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖和侵襲能力是胎盤發(fā)揮正常作用所必備［3］。妊娠期間，母體或母胎界面分泌多種細(xì)胞因子或蛋白以促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、分化和侵襲，但在GDM中，HG環(huán)境能明顯影響滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、分化和侵襲功能。彭海燕等［22］發(fā)現(xiàn)：HG環(huán)境可能通過下調(diào)滋養(yǎng)層細(xì)胞中的腺苷單磷酸活化蛋白激酶α1亞基的表達(dá)抑制其增殖活性；TAO等［23］認(rèn)為：HG能通過下調(diào)胎盤生長因子的表達(dá)，降低其對滋養(yǎng)層細(xì)胞中活性氧的調(diào)控作用，從而增強HG環(huán)境對細(xì)胞增殖和侵襲能力的抑制作用。本研究結(jié)果顯示：HG能明顯抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖和侵襲功能，但Apelin能通過與APJ受體相互結(jié)合改善此現(xiàn)象。

綜上所述，Apelin及其受體APJ在GDM患者胎盤組織中的表達(dá)明顯降低，而外源性給予Apelin可通過上調(diào)AMPK信號通路的表達(dá)改善滋養(yǎng)層細(xì)胞的IR，并促進(jìn)HG環(huán)境下滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖和侵襲能力。Apelin和APJ有望作為改善GDM患者胎盤組織IR和糖代謝的候選靶點，為改善GDM患者的預(yù)后提供新的策略和研究方向。

圖9 各組HTR-8細(xì)胞中侵襲細(xì)胞數(shù)Fig.9 Number of invasion cells of HTR-8 cells in various groups